Ефект зниження сечової кислоти та механізм актеозиду та ехінакозиду, екстрагуватися з Cistanche Tubulosa
Mar 03, 2025
Анотація:Прагнути вивчити ефекти зниження сечової кислоти та механізми актеозиду (AS) та ехінакозиду (ECH)Cistanche tubulosa.
МетодиМодель HyperUricemia (HUA) щура була встановлена за допомогою оксону калію (1,5 г · кг -1 · d -1) у поєднанні з аденіном (100 мг · кг -1 · d -1). The HUA model rats were randomly divided into a model control group, an allopurinol group (30 mg·kg-1·d-1 ), AS low and high (50, 100 mg·kg-1·d-1 ) dose groups, and ECH low and high (50, 100 mg · kg -1 · d -1) групи дози. Раніше була встановлена нормальна контрольна група. Після чотирьох тижнів введення аналізатора біохімії крові був використаний для виявлення сечовини SUA, CREA, аденозин -дезамінази (ADA) та рівня сечової кислоти (UUA) у сечі. Аналіз імуноферментного ферменту, пов'язаний з імуноферментним, використовували для виявлення рівня ксантину оксидази (XOD) у сироватці крові. Тканину нирок збирали, а коефіцієнт нирок зважували та обчислювали. Фарбування гематоксиліну еозину (HE) використовували для спостереження за нирковими патологічними змінами. Імуногістохімія (IHC) та ПЛР у режимі реального часу використовувались для виявлення рівнів експресії білка та мРНК транспортера 1 (URAT1), транспортеру глюкози 9 (GLUT9), транспортеру органічного аніона 1 (OAT1) та органічним аніонним транспортером 3 (OAT3) у ниральній тканині. Результати AS та ECH можуть покращити функцію нирок у щурів моделі HUA, знижувати рівень сечової кислоти в крові, сприяти виділенню сечової кислоти, знизити регуляцію рівня в сироватці крові та XOD, а також регулювати експресію білка та мРНК URAT1 та GLUT9 в нирковій тканині, при збільшенні регуляції білка та експресії мРНК OAT1 та OAT3 в нирковій тані.
Висновки Фенілетноїд -глікозиди як і від ECH від Cistanche Tubulosa можуть здійснювати ефекти зниження сечової кислоти, покращуючи функцію нирок у щурів HUA, зниження рівня ADA та XOD та регулюючи експресію URAT1, GLUT9, OAT1 та OAT3.
Ключові слова: cistanche tubulosa; актерозид; Ехінакозид; гіперурикемія; зменшення сечової кислоти; механізм
Екстракт Cistanche tubulosa з 16% актеозидом
Гіперурикемія (HUA) - це метаболічне захворювання, спричинене невпорядкованим метаболізмом пурину в організмі людини, що призводить до підвищеного рівня сечової кислоти крові [1]. Зазвичай він діагностується, коли рівні сечової кислоти крові перевищують 7. 0 Mg · dl⁻ (416. 0 μMol·L⁻) у чоловіків і 6. 0 mg · dl⁻ (357. Розвиток гіперурикемії пов'язаний насамперед з такими факторами, як дієти з високою тваринами, хронічне споживання алкоголю, вживання ліків та гіпотиреоз. Це не тільки збільшує ризик серцево -судинних захворювань, діабету та гіпертонії [3-4], але й суттєво впливає на здоров'я пацієнтів.
В даний час клінічні методи лікування гіперурикемії в основному включають препарати, що інгібують вироблення сечової кислоти та сприяють виділенню сечової кислоти. Однак ці методи лікування мають певні обмеження для пацієнтів з порушенням функції печінки або нирок [5-6]. Тому вивчення ефективних препаратів з низькими побічними ефектами має велике значення для профілактики та лікування гіперурикемії.
Cistanche Tubulosa (Schenk) R. Wight, зазвичай використовується в традиційній китайській медицині як трава, що отовує нирки, використовується для лікування таких станів, як безсилля, безпліддя, дефіцит сутності та крові, слабкість у нижній частині спини та колін, слабкість м’язів та запор через сухість кишечника [7]. Дослідження показали, щоCistanche tubulosaволодіє нейропротекторними [8], протизапальними [9], регуляцією метаболізму кісток [10] та впливами підвищення ефективності у хіміотерапії для онкологічних хворих [11]. Серед його різних активних компонентів фенілетноїдні глікозиди є найбільш рясними.
Актеозид (AS) та ехінакозид (ECH), два фенілетаноїдні глікозиди з високим вмістом уCistanche tubulosa, проявляти сильну біологічну активність та мають значний потенціал для розвитку та застосування. Отже, наша дослідницька група вибрала та ECH для подальшого вивчення. Через мережеві фармакологічні прогнози та попередні експерименти у мишей ми виявили, що фенілеттоїдні глікозидні екстракти зCistanche tubulosaможе мати певний ефект, що знижує сечову кислоту. Однак шляхи та механізми цих ефектів залишаються незрозумілими.
Таким чином, використовуючи механізми вироблення сечової кислоти та її первинні шляхи екскреції як фокус дослідження, ми досліджували ефекти, що знижують сечову кислоту, фенілетноїдних екстрактів глікозиду як та ECH. Це дослідження має на меті з'ясувати шляхи та механізми, за допомогою яких AS та ECH здійснюють свої ефекти, що знижують сечову кислоту.
1 матеріали
1.1 Експериментальні тварини
Сімдесят чоловіків SPF-класу Sprague-Dawley (SD) щурів, вагою 150–180 г, були придбані в експериментальному центрі тварин Медичного університету Сіньцзян. Номер ліцензії на виробництво тварин: SCXK (xin) 2023-0001. Цей експеримент був затверджений Комітетом з етики тварин в Інституті досліджень медицини Uygur Medicine Research xinjiang, з номером затвердження етики тварин: iACUC- (Zhun) -2024-009.
1.2 препарати та реагенти
Фенілетоїдні глікозидні екстракти (як і ECH)зCistanche tubulosa (purity >98%, перевірені високоефективною рідинною хроматографією) були вилучені, очищені та готували ключовою лабораторією науки про формулювання UYGUR, інституту досліджень медицини Uygur Medicine Xinjiang. Номери партії: 20220617 (AS) та 20220526 (ECH).
Таблетки аллопуринолу, Номер партії: 62208726, виготовлений Jiangsu Wanbang Biochemical Pharmaceutical Group Co., Ltd.
Калієвий окссонатіаденін, Пакетні номери: I2130050 та C2202255, придбані у Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
CREA (креатинін), UA (сечова кислота), сечовина та ADA (аденозин -дезаміназа), Пакетні номери: 141123010, 141223004, 141323008 та 043624005, придбані у Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.
Набір аналізу XOD (Xanthine Oxidase), Номер партії: Y10001219, придбаний у Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.
Антитіла (urat1, glut9, oat1, oat3), номери пакетів: 3i5723 0, 92f0296/4, 0f33081/2i44618, придбаний у Affinity Biosciences.
HRP-мічений козячий анти-Rabbit IgG, Номер партії: 245440113, придбаний у ZSGB-BIO.
Розчин фарбування гематоксиліном, Номер партії: 24135741H, придбаний у Пекіні Lanjieke Technology Co., Ltd.
Набір хромогенного реагенту, Номер партії: 240010512, придбаний у ZSGB-BIO.
DEPC (діетил -пірокарбонат), Номер каталогу: D 60029-500 Ml, придбаний у Amresco (США).
M5 Hiclear DL2000 ДНК -маркер, Номер каталогу: MF025, придбаний у Пекінської геноміки Biotechnology Co., Ltd.
Реагент Trizol ™, Номер каталогу: 15596026, придбаний у Thermo Fisher Scientific (США).
5x All-In-One RT MasterMixіEvagreen Express 2 × qpcr mastermix-low rox, Номери каталогів: G492 та G891, обидва придбані у Applied Biological Materials Inc. (ABM).
2 методи
2.1 МОДЕЛЬНА ВІДПОВІДАЛЬНІСТЬ І ГРУПАЦІЯ
Сімдесят щурів Sprague-Dawley (SD) були акліматизовані та розділені на дві групи: нормальна контрольна група (1 0 щури) та контрольна група моделі (60 щурів). Нормальну контрольну групу вводили 0,5% CMC-NA через Gavage. Модельну контрольну групу вводили оксонат калію (1,5 г · кг⁻) у поєднанні з аденіном (100 мг · кг⁻) у дозі 10 мл · кг⁻, один раз на день протягом 14 днів поспіль. Модель вважалася успішно встановленою, коли рівні сечовини, CREA та SUA значно зросли, виміряні біохімічним аналізатором.
Далі щури моделі гіперурикемії були розділені на такі групи на основі рівня SUA, сечовини та CREA: контрольна група моделі, група аллопуринолу (3 0 мг · кг⁻), низька доза як група (50 мг · кг⁻), висока доза як група (100 мг · кг), і низька DOS-Dos ECH GROUP (100 мг · кг⁻), з 10 щурами у кожній групі. Для підтримки стабільної гіперурикемії всі групи, за винятком нормальної контрольної групи, вводили окссонат калію (500 мг · кг⁻) у поєднанні з аденіном (100 мг · кг⁻) через побожку вранці, а потім введення відповідних препаратів у кожній групі лікування вдень. Нормальна контрольна група отримала 0,5% розчину CMC-NA вранці і в другій половині дня в дозі 10 мл · кг⁻, один раз на день протягом 14 днів поспіль. Після цього введення моделюючих агентів було припинено, а відповідні препарати постійно вводили щодня протягом додаткових 14 днів.
2.2 Збір зразків
Після остаточної дози щурів постили протягом ночі (вода не була обмежена). Сечу з кожної групи збирали для тестування сечової кислоти. Вага тіла вимірювали після голодування, а зразки крові збирали під наркозом. Сироватка була розділена центрифугуванням і зберігалася для подальшого використання. Тканини нирок збирали та зважували. Одну нирку фіксували в 4% параформальдегідному розчині, а інший був замороженим у рідкому азоті для подальшого аналізу.
2.3 Вимірювання сечової кислоти в сечі щурів
Зразки сечі з кожної групи центрифугували (3, 000 r · min⁻, 10 хв, радіус центрифуги 14 см), і супернатант був зібраний. Зразки сечі розбавляли 1: 9 фізіологічним розчином та аналізували на вміст сечової кислоти за допомогою біохімічного аналізатора.
2.4 Вимірювання ADA, сечовини, CREA та SUA в сироватці щурів
Зразки крові з кожної групи центрифугували (3, 000 r · min⁻, 10 хв, радіус центрифуги 14 см) і сироватка була зібрана. Рівень ADA, сечовини, CREA та SUA в сироватці крові вимірювали за допомогою біохімічного аналізатора.
2,5 Вимірювання XOD у сироватці щурів
Зміни рівня XOD у сироватці щурів вимірювали за допомогою ферментативного аналізу відповідно до інструкцій виробника. Були реєстрували початкову поглинання (A₁) та кінцеву поглинання (A₂) при 290 нм, а ΔA (ΔA=A₂ - A₁) розраховували. ΔA замінили у формулу:
Xod (nmol⁻ · min⁻ · ml⁻)=[ΔA × Реакційна система Загальний об'єм ÷ (Молярний коефіцієнт вимирання сечової кислоти × Оптичний шлях довжини) × 10⁹] ÷ Об'єм зразка ÷ {{2} × Δa,
Для обчислення кількості сечової кислоти, каталізованої на хвилину на мілілітр сироватки.
2,6 Вимірювання коефіцієнтів нирок
Тканини нирок збирали, промивали сольовим розчином, а зайву воду видаляли. Вага органу була точно виміряна, а коефіцієнт нирок обчислювали наступним чином:
Коефіцієнт нирок=маса нирок (мг) / маса тіла (g).
2.7 Гістопатологічне спостереження за тканиною нирок він фарбував
Тканини нирок, фіксовані в 4% параформальдегідному розчині, зневоднювали концентрацією етанолу, очищали ксилолом, вбудовували в парафін і розрізали в 4- мкм -шматочки. Зрізи депарафінізували ксилолом, зволожуючи градуйований етанол, фарбували гематоксиліном та еозином (He) і герметизували нейтральною гумкою. Морфологічні зміни в нирковій тканині спостерігалися під світлим мікроскопом, а зображення знімали при збільшенні 400 ×.
2.8 Виявлення експресії білка URAT1, GLUT9, OAT1 та OAT3 в тканинах нирок IHC
Тканини нирок, фіксованих у 4% параформальдегідному розчині, зневоднювали концентрацією етанолу, очищали ксилолом, вбудовували в парафін і розрізали. Було виконано пошук антигену та блокування козячої сироватки. Первинні антитіла (URAT1, GLUT9, OAT1, OAT3) додавали при розведенні 1: 200 та інкубували протягом ночі при 4 градусах. Наступного дня секції промивали PBS, висушили на повітрі та інкубували з міченим біотином козячим анти-кролячим IgG на 37 градусах протягом 30 хвилин. Зрізи промивали PBS та інкубували з хромогенним реагентом DAB протягом 10 хвилин з подальшим промиванням PBS, фарбуванням гематоксиліном протягом 3 хвилин, диференціацією з розчином етанолу соляної кислоти, розчином карбонату літію, зневодненням градієнтом, очищенням ксиленом та герметичною гамма.
Для кожного щура було обрано два випадкові 4 0 0 × поля нирок. Позитивне фарбування (коричнево-жовтих) аналізували, і інтегрована оптична щільність (IOD) кожного поля вимірювали за допомогою Image-Pro Plus 6.0 для статистичного аналізу.
