Пухлинні клітини не в змозі представити епітопи, обмежені MHC-II, отримані з онкогенів, до CD{1}} Т-клітин
Oct 09, 2023
CD4+ T-клітини відіграють вирішальну роль у протипухлинному імунітеті через розпізнавання пептидних антигенів, представлених на MHC класу II (MHC-II). Незважаючи на те, що деякі солідні види раку можна індукувати для експресії MHC-II, ступінь, до якої це дозволяє пряме розпізнавання пухлиноспецифічними CD4+ Т-клітинами, невідомий. Ми виділили та охарактеризували рецептори Т-клітинного антигену (TCR) із природно праймованих CD4+ Т-клітин, специфічних для 2 онкобілків, HPV-16 E6 та активуючої мутації KRASG12V, від пацієнтів із плоскоклітинним раком голови та шиї і протокової аденокарциноми підшлункової залози, відповідно, і визначили їх здатність розпізнавати аутологічні або людські лейкоцитарні антиген-сумісні антиген-експресуючі пухлинні клітини. Ми виявили в обох випадках, що TCR були здатні розпізнавати навантажені пептидом клітини-мішені, які експресують відповідні MHC-II або B-клітинні антигенпрезентуючі клітини (APC), коли антигени були ендогенно експресовані та спрямовані до ендосомального шляху, але не змогли розпізнати пухлину клітини, що експресують вихідний білок навіть після індукції поверхневої експресії MHC-II за допомогою IFN- або трансдукцію за допомогою CIITA. Ці результати свідчать про те, що праймінг і функціональне розпізнавання як ядерного (E6), так і пов’язаного з мембраною (KRAS) онкобілка переважно обмежуються крос-презентуючими APC, а не шляхом прямого розпізнавання пухлинних клітин, індукованих до експресії MHC-II.
Переваги cistanche tubulosa - Протипухлинний
вступ
Злоякісна трансформація соматичних клітин ініціюється дією активованих онкогенів, які порушують регуляцію шляхів росту клітин і призводять до нестримної проліферації (1). У випадку раку, асоційованого з ВПЛ, експресія ранніх генів Е6 і Е7 ВПЛ сприяє онкогенезу шляхом інгібування генів-супресорів пухлини p53 і Rb відповідно (2). Альтернативно, конститутивна активація онкогену може відбуватися через соматичну мутацію в генах, що регулюють клітинний ріст і шляхи проліферації, наприклад сімейство RAS. Дійсно, активація мутацій KRAS, таких як KRASG12V, зазвичай зустрічається у пацієнтів з раком підшлункової залози, товстої кишки та легенів (3). Хоча онкогени сприяють захворюванню, вони також можуть стати мішенями для імунної системи господаря. В останні роки роль імунної системи в контролі раку, пов’язаного з ВПЛ, стала широко визнаною. CD8+ і CD4+ Т-клітини, що розпізнають HPV E6 і E7, а також інші білки HPV, були ідентифіковані як у периферичній крові, так і в лімфоцитах, що інфільтрують пухлину (TIL) пацієнтів з ВПЛ-асоційованим рак (4–6). Імунотерапія, націлена на ці антигени, включаючи терапевтичні вакцини проти раку та адаптивну клітинну терапію (ACT) з TIL або Т-клітинами, сконструйованими TCR, є активною областю доклінічних і клінічних досліджень (2). Відповіді Т-клітин на онкогенні мутації також широко описані (7–9). Крім того, існують прямі клінічні докази того, що ACT з TIL, націленими на мутантний KRAS, може сприяти об’єктивній відповіді (10). Хоча CD8+ Т-клітини, що розпізнають епітопи, отримані з онкогенів, опосередковують пряму цитотоксичність проти пухлинних клітин (11–13), роль CD4+ Т-клітин у протипухлинному імунітеті є менш вивченою. Недавні дослідження висвітлили підмножину CD4+ Т-клітин, що експресують цитотоксичні маркери, такі як гранзим В (GrzmB), у ракових пухлинах людини (14, 15). Однак антигенна специфіка цих клітин і, отже, їх терапевтичний потенціал залишаються в основному невідомими. Крім того, для того, щоб ці цитотоксичні CD4+ Т-клітини розпізнавали та знищували пухлинні клітини, пухлинна клітина повинна не тільки експресувати MHC-II, але й відповідні антигени повинні бути спрямовані на відповідний шлях презентації. У цьому дослідженні ми досліджували здатність CD4+ T-клітин, специфічних для онкобілків HPV-16 E6 і KRASG12V, розпізнавати пухлинні клітини, що експресують антиген. Хоча обидва TCR були здатні безпосередньо розпізнавати ендогенно оброблені та представлені антигени, спрямовані в ендосомальний компартмент HLA-сумісних B-клітин, жоден не був здатний розпізнавати антиген-експресуючі пухлинні клітини з індукованою експресією MHC-II. Загалом наші результати свідчать про те, що лише певні антигени представлені безпосередньо на пухлинних клітинах MHC-II+, що може обмежити пул CD4+ Т-клітин, здатних безпосередньо розпізнавати та елімінувати пухлинні клітини.
Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему
Натисніть тут, щоб переглянути продукти Cistanche Enhance Imunity
【Запитуйте більше】 Електронна пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Результати
Ідентифікація HPV-16 E6-специфічних CD4+ і CD8+ Т-клітинних відповідей за TIL плоскоклітинної карциноми голови та шиї. Ми провели скринінг серії окремих культур TIL, виділених із фрагментів пухлини розміром від 2 до 4 мм від пацієнта (Hu-56) з ВПЛ-16+ плоскоклітинною карциномою голови та шиї (HNSCC) (Додаткова таблиця 1; додатковий матеріал доступна в Інтернеті разом із цією статтею; https://doi.org/10.1172/jci.insight.165570DS1) за допомогою аналізів IFN-ELISPOT для ідентифікації відповідей Т-клітин, спрямованих проти ВПЛ-16 вірусних онкобілків Е6 і Е7, використовуючи пептидні пули, що містять перекриваються 15-мери, що охоплюють довжину білків E6 і E7. Примітно, що фрагменти TIL 12 і 29 створювали значну кількість плям на фоні при повторній стимуляції пептидним пулом E6 і містили як CD4+, так і CD8+ Т-клітини (Малюнок 1A та Додатковий малюнок 1A). Щоб ідентифікувати відповідні підмножини Т-клітин, ми проаналізували ці культури TIL за допомогою аналізу секреції цитокінів. Це показало, що фрагмент TIL 29 (F29) містив E6-реактивні CD8+ Т-клітини, тоді як фрагмент 12 (F12) містив як CD4+, так і CD8+ Т-клітини, здатні розпізнавання пулу пептидів E6 (рис. 1B). Жодна з CD4+ Т-клітин не виробляла IL-5 у відповідь на повторну стимуляцію E6, підтверджуючи Th1-подібний фенотип. Щоб визначити TCR-клональність E6-специфічних TIL, ми відсортували поодинокі IFN-секретуючі CD4+ T-клітини з F12 і CD8+ T-клітини з F12 і F29. Секвенування TCR виявило єдиний TCR, який експресується CD{49}} Т-клітинами, що секретують IFN (n=31 з 31 секвенованої клітини), а також один клон TCR, спільний для CD, що секретує IFN{{53 }} Т-клітини як з F12, так і з F29 (n=40 з 41 і 37 з 38 секвенованих клітин відповідно) (додаткова таблиця 2). Ці результати вказують на те, що моноклональні CD4+ і CD8+ Т-клітини, реактивні на E6, присутні в TIL цього пацієнта. HLA-A*02:01–обмежені CD8+ Т-клітини з TIL розпізнають E6, представлений лінією пухлинних клітин, отриманою пацієнтом. TIL з F29 виробляли IFN- при повторній стимуляції пептидом E629-38, що свідчить про те, що F29 TCR розпізнає цей раніше описаний епітоп з обмеженням HLA-A*02:01 (додатковий малюнок 1B) (11). Це було підтверджено дослідженнями зв’язування тетрамеру з використанням E629-38/HLA-A*02:01 для мічення TCR-дефіцитних клітин J76, що експресують людський CD8, і використанням раніше описаного E628-38-специфічного TCR як позитивного контроль (Малюнок 2A) (11). Обидва TCR продемонстрували подібні рівні функціональної авідності, як продемонстровано підвищенням рівня маркера гострої активації CD69 на J76 після стимуляції аутологічними В-лімфобластоїдними клітинними лініями (B-LCL), що обробляються титрованими концентраціями пептиду E629-38 (рис. 2, B і C). Ці дані підтверджують наявність CD8+ Т-клітинного клону, специфічного для відомого епітопу E6 з подібними функціональними характеристиками до TCR, який був протестований у клінічних умовах (16). Далі ми намагалися визначити, чи може E6-специфічний CD8+ TCR розпізнавати ендогенно експресовані антигени і таким чином опосередковувати протипухлинну цитотоксичність. Для цього ми використали добре охарактеризовану лінію пухлини HLA-A*02:01+ HPV-16+, CaSki, а також аутологічну лінію пухлинних клітин, HNSCC-56, отриману за допомогою клітинне перепрограмування тканини первинної пухлини, як описано раніше (17) для аналізів цитотоксичності in vitro. Аналіз RNA-Seq підтвердив експресію ранніх генів HPV-16, включаючи E6, як зразком первинної пухлини, так і лінією аутологічних клітин (додатковий малюнок 1C). Первинні CD{111}} Т-клітини людини, що експресують F29 TCR, можуть опосередковувати знищення клітин як CaSki, так і HNSCC-56 у діапазоні співвідношень ефектор-мішень in vitro (рис. 2, D і E). Разом ці дані підтверджують, що F29 TCR розпізнає ендогенно експресований антиген E6. Ідентифікація E6-специфічної CD4+ Т-клітини з обмеженням HLA-DQ за TIL. Щоб розширити E6-специфічні TIL для подальшого функціонального аналізу, ми використали раніше описаний протокол швидкого розширення культури з OKT-3 та опромінені алогенні РВМС для розширення TIL з F12. Хоча первинна культура F12 спочатку містила CD8+ і CD4+ Т-клітини з реактивністю E6, кінцевий клітинний продукт після швидкого розмноження містив 99% CD4+ Т-клітин, з яких приблизно 38,33 % продемонстрували реактивність проти E6, як продемонстровано фарбуванням внутрішньоклітинних цитокінів на IFN- (рис. 3A).
Китайська трава цистанка рослина-Протипухлина
На додаток до IFN-, стимульовані E6-специфічні CD4+ TIL можуть секретувати TNF-, але не IL-2 (додатковий малюнок 2A). Незважаючи на те, що загальна частота клітин GrzmB+ не зростала при стимуляції антигеном, контроль TNF-секретуючих клітин показав, що E6-специфічні CD4+ TIL містять більше внутрішньоклітинних GrzmB, ніж неспецифічні TIL (додаткова рис. 2B). ). ІФН-секретуючі CD4+ TIL також експресували коінгібіторний маркер програмованої клітинної смерті 1 (PD-1), що відповідає опублікованим сигнатурам пухлинно-реактивних CD4+ TIL (додатковий малюнок 2C) ( 18, 19). E6-специфічні CD4+ TIL продемонстрували високу функціональну авідність, оскільки ці клітини могли секретувати цитокіни при концентраціях пептидів менше 1 мкг/мл (рис. 3B). Щоб визначити специфічність культури F12 TIL, ми обробили аутологічні B-LCL індивідуальними пептидами, що відповідають кожному з 37 пептидів, що містяться в оригінальному пулі E6 (додаткова таблиця 3). CD4+ TIL з F12 секретували IFN- при стимуляції пептидами E61-15 і E65-19, які мають основну послідовність з 11 амінокислот (додатковий малюнок 2D). Експерименти спільного культивування в присутності HLA-блокуючих АТ виявили значне зниження секреції IFN TIL, коли B-LCL блокували анти-HLA-DQ АТ, але не анти-HLA-DR або ізотипні контрольні АТ (рис. 3C). Щоб визначити, які алелі HLA-DQ відповідають за презентацію цього епітопу, ми імпульсно впливали на B-LCL, що експресують відомі алелі HLA-DQ (додаткова таблиця 4), з E61-15 і виявили, що клітини KAS011 експресують HLA-DQA1*01 :02 і DQB1*05:02, але не Hu-195 B-LCL, що експресують DQA1*05:05 і DQB1*03:01, можуть представляти антиген TIL у такий же спосіб, як аутологічний Hu{{63} } B-LCL (Малюнок 3D). Нарешті, ми намагалися перевірити, що ідентифікована раніше послідовність TCR дійсно відповідальна за розпізнавання E6. Експресія F12 TCR у первинних здорових донорських CD4+ Т-клітинах була достатньою для сприяння розпізнаванню пептиду E61-15, про що свідчить підвищення регуляції CD69 і PD-1 (рис. 3E). ). У сукупності ці результати демонструють ідентифікацію обмеженого HLA-DQ епітопу E6, який розпізнається моноклональними CD4+ TIL. E6-специфічні CD4+ Т-клітини не розпізнають і не вбивають аутологічні пухлинні клітини, що експресують MHC-II. Недавні дослідження виявили генетичні сигнатури цитотоксичних CD4+ TIL у деяких ракових захворюваннях людини (14, 15). Однак чи відіграють цитотоксичні CD4+ Т-клітини роль у розвитку раку, спричиненого ВПЛ, невідомо. Щоб визначити, чи можуть E6-специфічні CD4+ T-клітини з TIL безпосередньо розпізнавати HNSCC-56, ми спочатку дослідили статус його експресії MHC-II. Незважаючи на те, що пухлинні клітини не експресували виявлений поверхневий MHC-II у культурі, лікування IFN- протягом 72 годин було достатнім, щоб індукувати регуляцію MHC-II (рис. 4A). Далі ми культивували HNSCC-56 з CD4+ F12 TIL. Важливо, що пухлинні клітини MHC-II+, попередньо кондиціоновані IFN-, не змогли стимулювати CD4+ TIL, як було визначено секрецією IFN- (рис. 4B).
Малюнок 1. Ідентифікація E6-реактивних CD4+ і CD8+ TIL від HPV-16+ HNSCC. (А)
Рисунок 2. Функціональні характеристики HLA-A*02:01–обмеженого, E6-специфічного TCR від Hu-56 TIL. (А)
Проте лінії пухлинних клітин, оброблені IFN, імпульсовані E61-15 перед додаванням TIL, були здатні стимулювати відповідь Т-клітин, що вказує на поверхневу експресію обмежувальних алелів HLA-DQ у клітинній лінії, яка ендогенно експресує E6 було недостатньо для розпізнавання пухлини, але вимагало екзогенного навантаження цільового пептиду. Така сама вимога до навантаження екзогенного цільового пептиду спостерігалася з CIITA-трансдукованими пухлинними клітинами (HNSCC-56 CIITA), які конститутивно експресують високі рівні поверхневого MHC-II (рис. 4B). Щоб перевірити, чи можуть CD4+ TIL розпізнавати ендогенно оброблену та презентовану версію епітопу E6 на APC, ми ретровірусно трансдукували аутологічні B-LCL за допомогою експресійної конструкції, що кодує перші 50 амінокислот E6, злитих з MHC- I трансмембранний домен (E6-MITD), який індукує локалізацію злитої амінокислотної послідовності на плазматичній мембрані та підтримує презентацію на MHC-II через ендосомальний обмін (20). B-LCL, які експресують конструкцію E6-MITD, можуть стимулювати E6-специфічні CD4+ TIL, що вказує на те, що пептидний епітоп, розпізнаний цими TIL, може бути природним чином оброблений і представлений на MHC-II, коли спрямований до відповідного шляху (рис. 4C).
Рисунок 3. Функціональні характеристики клонально розширених, обмежених HLA-DQ, E6-специфічних CD4+ TIL. (А)
Далі ми намагалися визначити, чи були F12 E6-специфічні CD4+ TIL здатні до прямої цитотоксичності пухлини. Згідно з даними наших аналізів розпізнавання, E6-специфічні CD4+ TIL не змогли обмежити ріст пухлинних клітин HNSCC-56, які не експресують MHC-II (рис. 4D) . Крім того, пухлинні клітини HNSCC-56 CIITA також росли без інгібування в присутності CD4+ TIL. Однак ріст пухлинних клітин HNSCC-56 CIITA, які отримували імпульсну обробку пептидом E61-15, пригнічувався ефекторними клітинами залежно від дози. Загалом ці дані свідчать про те, що хоча HNSCC-56 може представляти епітопи E6 CD8+ T-клітинам, E6-специфічні CD4+ TIL не здатні безпосередньо розпізнавати та лізувати MHC- II+ аутологічні пухлинні клітини. Гени, які беруть участь у презентації антигену, часто мутують у ракових пухлинах, що може перешкоджати розпізнаванню Т-клітинами (21). Щоб визначити, чи містили пухлинні клітини HNSCC-56 будь-які соматичні мутації, що перешкоджають представленню антигену на MHC-II, ми виконали секвенування повного екзома пухлинних клітин і PBMC з Hu-56 як контрольного зразка. Зі 104 ідентифікованих несинонімічних соматичних мутацій не було явних мутацій у компонентах шляху презентації MHC-II, включаючи HLADMA, HLADMB і CD74 (додаткова таблиця 5). Ідентифікація HLA-DRB5*01:01–обмеженого, KRASG12V-специфічного TCR у крові пацієнта з протоковою аденокарциномою підшлункової залози. Отримавши ці результати, ми вирішили визначити, чи була нездатність пухлинних клітин презентувати антиген на MHC-II для інших онкогенів. Враховуючи, що циркулюючі пухлиноспецифічні Т-клітини були ідентифіковані у людей, хворих на рак (8, 22), ми стимулювали PBMC у пацієнта (Hu-66) з протоковою аденокарциномою підшлункової залози (додаткова таблиця 1) за допомогою пулу пептидів що відповідає загальним онкогенним мутаціям (додаткова таблиця 6) протягом 14 днів до повторної стимуляції окремими пептидами для ідентифікації відповідних Т-клітинних відповідей за допомогою ELISPOT. Ці результати вказують на наявність Т-клітинної відповіді, спрямованої проти KRASG12V, про що свідчить збільшення кількості плям IFN на тлі у відповідь на амінокислоти 1–15 KRASG12V (рис. 5A). Щоб ідентифікувати відповідні TCR, пов’язані з цією відповіддю, ми знову використали аналіз секреції цитокінів для сортування клітин, що секретують IFN. Аналіз секреції цитокінів виявив специфічну продукцію IFN- Т-клітинами CD4+ у відповідь на повторну стимуляцію KRASG12V (рис. 5B). Порівняння ланцюгів TCR з відсортованих клітин, що секретують IFN, з тими, що присутні в нерозширених PBMC цього пацієнта, виявило один клонотип TCR, присутній з найвищою частотою серед обох популяцій (Малюнок 5C і Додаткова таблиця 2). Ці результати вказують на те, що частота цього клону Т-клітин була розширена на початковому рівні в PBMCs, що свідчить про природну відповідь in vivo, а не праймування in vitro в нашій культурі розширення. Щоб перевірити антигенну специфічність цього TCR, ми експресували його в первинних людських CD4+ T-клітинах шляхом ретровірусної трансдукції та культивували ці клітини з аутологічними B-LCL, імпульсованими або мутантним KRASG12V, або відповідним пептидом WT. Сконструйовані Т-клітини секретували IFN- при стимуляції мутантним, але не WT, пептидом KRAS, підтверджуючи, що цей TCR є специфічним для KRASG12V (рис. 5D). Відповідно до наших результатів E6 TCR, сконструйовані Т-клітини, що експресують KRASG12V-специфічний TCR, також здатні розпізнавати B-LCL, що експресують фрагмент KRASG12V, але не WT KRAS, спрямовані до ендосоми шляхом включення MITD, що свідчить про те, що це TCR розпізнає ендогенно оброблений і представлений антиген (рис. 5D).
Рисунок 4. Аутологічні пухлинні клітини не представляють ендогенний E61-15 на MHC-II до CD4+ Т-клітин. (А)
Рисунок 5. Ідентифікація HLA-DRB5*01:01–обмеженого, KRASG12V-специфічного TCR у крові пацієнта з протоковою аденокарциномою підшлункової залози. (А)
Щоб ідентифікувати обмежувальний алель HLA, ми повторили ці експерименти пептидної стимуляції з використанням B-LCL, що експресують різні комбінації генів HLA. B-LCL, що експресують загальний гаплотип HLA-B7-DR15-DQ6, можуть стимулювати сконструйовані Т-клітини, тоді як B-LCL без цих алелів не можуть (рис. 5E). Зрештою, стимуляція цих клітин за допомогою пептидного імпульсу IHW03304, лінії клітин DAP3 миші, трансфікованої HLA-DRB5*01:01 людини, підтвердила це як обмежувальну молекулу HLA (рис. 5F). Пухлинні клітини MHC-II+ NCI-H2444 і DAN-G не представляють епітоп, отриманий з KRASG12V, для CD4+ Т-клітин. Далі ми досліджували здатність пухлинних клітин безпосередньо представляти епітопи, отримані з KRASG12V, на MHC-II. Щоб отримати HLA-сумісні клітинні лінії MHC-II+ для цих досліджень, ми трансдукували клітинні лінії KRASG12V+ NCI-H2444 і DAN-G, отримані з раку легенів і підшлункової залози людини, відповідно, за допомогою CIITA і конструкції, що кодує HLA-DRB5*01: 01 з усіченим репортерним геном CD34 (рис. 6A). Згідно з нашими попередніми результатами, пухлинні клітини MHC-II+, що експресують обмежувальний алель HLA, були нездатні стимулювати TCR-інженерні Т-клітини, якщо клітини-мішені спочатку не стимулювали екзогенним пептидом (рис. 6B). Важливо, що в загальнодоступних даних секвенування не було перелічених соматичних мутацій у презентаційних генах MHC-II (а саме, HLADMA, HLADMB, CD74) ні для NCI-H2444, ні для DAN-G (23). Клітини NCI-H2444 CIITA росли без пригнічення в присутності Т-клітин, сконструйованих за допомогою TCR, тоді як клітини NCI-H2444 CIITA, які отримували імпульс пептиду KRASG12V, мали сповільнений ріст пухлини (рис. 6C). Відповідно до результатів, отриманих для HNSCC-56, CD8+ Т-клітини, що експресують HLA-A*03:01– обмежений, KRASG12V-специфічний TCR (24), змогли розпізнати клітини NCI-H2444, але не Клітини CaSki, які експресують HLA-A*03:01, але не експресують KRASG12V (рис. 6D). Ці результати демонструють, що окремий онкоген, присутній у цитозолі, також не може бути представлений пухлинними клітинами MHC-II+, незважаючи на те, що він ефективно представлений на MHC-I. Експресія коінгібіторних лігандів, таких як ліганд програмованої клітинної смерті 1 (PD-L1), пухлинними клітинами обмежує передачу сигналу TCR в Т-клітинах (25). Щоб визначити, чи може цей механізм перешкоджати розпізнаванню пухлинних клітин MHC-II+ CD4+ T-клітинами, ми культивували CD4+ T-клітини, що експресують наш KRASG12V-специфічний TCR або E6-специфічний F12 TCR з NCI-H2444 CIITA та HNSCC-56 CIITA, відповідно, з або без анти-PD-L1-блокуючих Abs. Блокування взаємодії PD-L1/PD-1 було недостатнім для сприяння розпізнаванню пухлинних клітин (додатковий малюнок 3). Подібним чином додавання анти-CD28 агоністів Ab не модулювало розпізнавання пухлинних клітин. Ці результати свідчать про те, що за цей фенотип відповідає відсутність презентації антигену, а не наявність або відсутність коінгібіторних або костимулюючих сигналів відповідно. Деякі дослідження показують, що ендогенні білки, інтерналізовані з плазматичної мембрани, переважно завантажуються на MHC-II для презентації порівняно з іншими субклітинними компартментами (26). Хоча білки KRAS часто асоціюються з мембранами через ліпідні модифікації, вони не експресують трансмембранний домен, і ці взаємодії не є стабільними (3, 27). Тому ми прийшли до висновку, що прикріплення імуногенного фрагмента KRASG12V до плазматичної мембрани пухлинних клітин може забезпечити пряме розпізнавання антигену CD{103}} Т-клітинами. Однак пухлинні клітини, що експресують конструкцію KRASG12V-MITD, про що свідчить експресія пов’язаного з P2A репортера EGFP, так само не здатні стимулювати TCR-інженерні CD4+ Т-клітини (додатковий малюнок 4). Ці результати свідчать про те, що субклітинна локалізація онкогену не є єдиним визначальним фактором прямого представлення MHC-II пухлинними клітинами. Крім того, ці результати свідчать про те, що надмірна експресія антигену недостатня для сприяння презентації MHC-II. Наші результати наразі свідчать про те, що пухлиноспецифічні CD4+ Т-клітини можуть з більшою ймовірністю розпізнавати антигени, представлені APC, ніж самі пухлинні клітини. Таким чином, ми оцінили здатність HLADRB5*01:01+ DC презентувати антигени, отримані з екзогенних білків. HLA-сумісні DC, створені in vitro, були здатні стимулювати TCR-інженерні CD4+ Т-клітини, що експресують KRASG12V-специфічний TCR, коли незрілі DC або стимулювали пептидом KRASG12V 20-mer, або годували повним білком KRASG12V, але не білок KRAS WT (рис. 6E). Ці результати свідчать про те, що хоча TCR не може розпізнавати ендогенні антигени, представлені пухлинними клітинами, він може розпізнавати перехресно представлені екзогенні антигени в контексті DC.
cistanche tubulosa - покращує імунну систему
Обговорення
Метою цього дослідження було визначити, чи можуть TCR, виділені з природних праймованих Т-клітин, отриманих від пацієнтів з раком, розпізнавати пухлинні клітини, що експресують онкогени. Щодо класу I (HLA-A*02:01)–обмеженого, HPV-16 E629-38 TCR, отриманого з TIL HNSCC, визнання, можливо, не дивно, було підтверджено як для лінії аутологічних пухлинних клітин і добре охарактеризована HLA-сумісна та E6-експресуюча пухлинна клітина, CaSki (важливо, дивіться малюнок 2). Ті самі TIL (рис. 1) також містили значну кількість IFN-продукуючих E6-специфічних CD4+ Т-клітин (рис. 3), які, навпаки, не розпізнавали E6- експресують пухлинні клітини, навіть якщо вони були індуковані експресувати достатню кількість поверхневого MHC класу II правильного презентуючого алеля (DQA1*01:02/DQB1*05:02) за допомогою обробки IFN або трансдукції CIITA (рис. 4). Експресія CIITA індукує не лише поверхневу експресію білків MHC-II, але також HLA-DM та молекул інваріантного ланцюга, які необхідні для процесингу та презентації антигену (28). HLA-сумісні B-клітини, навпаки, розпізнавались цим TCR, коли антиген був спрямований на шлях MHC-II. Подібна ситуація спостерігалася у випадку KRASG12V-специфічного, HLA-DRB5*01:01-обмеженого TCR, який міг розпізнавати HLA-сумісні B-клітини, але не MHC-II-експресуючі пухлинні клітини, коли антиген був спрямований на Шлях презентації MHC-II. Обидва TCR мали достатню функціональну авідність, щоб опосередкувати розпізнавання ендогенно експресованих антигенів за умов, описаних вище, і обидва могли опосередкувати цитотоксичність навантажених пептидом клітин-мішеней. Це останнє спостереження відображає обставину, представлену в кількох звітах про цитотоксичні CD4+ Т-клітини, хоча наші дані розширюють контекст цього спостереження, показуючи, що ендогенна експресія вихідного антигену та індукція MHC-II IFN- є малоймовірною для створення фізіологічної мішені на пухлинних клітинах епітелію для TCR проти ядерних або мембранно-асоційованих антигенів. Недавні дослідження раку сечового міхура та меланоми людини виявили генетичні сигнатури, що відповідають цитотоксичним CD4+ T-клітинам серед TIL (14, 15). Функціонально ці цитотоксичні CD4+ TIL здатні безпосередньо розпізнавати MHC-II-залежну пухлину, що зрештою призводить до цільового лізису гранзимами у спосіб, подібний до їхніх аналогів CD8+. Однак терапевтичний переклад цих знахідок може бути обмежений тим фактом, що деякі солідні пухлини експресують MHC-II. Дійсно, результати 2 незалежних досліджень показали, що лише приблизно одна третина пацієнтів з меланомою мають будь-які пухлинні клітини MHC-II+, і частота цих клітин у пухлині часто становить менше 10% (15, 29). Натомість переважаючим клітинним джерелом MHC-II у мікрооточенні пухлини є інфільтрація лейкоцитів (26).
Рисунок 6. Пухлинні клітини MHC-II+ KRASG12V+ не представляють епітопи, отримані з KRASG12V, для CD4+ Т-клітин. (А)
Хоча деякі клітини солідної пухлини дійсно експресують або конститутивну, або індуцибельну MHC-II, наші результати показують, що, незважаючи на наявність онкоген-специфічних CD4+ T-клітин серед TIL та PBMC, ці клітини не можуть безпосередньо розпізнавати та лізувати експресію антигену Пухлинні клітини MHC-II+, тоді як епітопи з того самого білка можуть бути ефективно представлені CD8+ T-клітинам на MHC-I (13). Це свідчить про те, що просто експресії цільового антигену може бути недостатньо для розпізнавання CD4+ Т-клітинами підмножини пухлин, які експресують MHC-II. Крім того, ці результати виявляються узгодженими для багатьох типів пухлин, оскільки клітинні лінії, досліджувані в цьому дослідженні, включають ті, що походять від HNSCC, аденокарциноми легенів і раку підшлункової залози. Пряме розпізнавання Т-клітинами CD4+ клітинних ліній меланоми, що експресують MHC-II природним шляхом або після трансдукції CIITA, повідомлялося в 2 дослідженнях (30, 31). Проте в обох цих дослідженнях значна частка тестованих TCR не розпізнала пухлинні клітини безпосередньо. Незрозуміло, чи представляють ці TCR клонотипи «побіжних спостерігачів», які не розпізнають пухлинні антигени, або пухлиноспецифічні TCR, які не здатні розпізнати свій споріднений антиген через недоліки презентації антигену, такі як ті, що висвітлюються в цьому дослідженні. Олівейра та ін. (31) продемонстрували, що пряме розпізнавання Т-клітинами CD4+ було обмежено 2 меланомами з надзвичайно високим мутаційним тягарем пухлини, що свідчить про те, що цей фенотип може призвести до додаткових необхідних змін, що дозволяють MHC-II презентувати пухлинні антигени. Хоча приєднання MITD до імуногенного фрагменту KRASG12V не призвело до прямого розпізнавання пухлинних клітин CD4+ Т-клітинами, дослідження описали зміщення для ендогенних пептидів, отриманих із мембранно-зв’язаних білків, елюованих із MHC-II, імовірно через переробку мембран (26, 32). Антиген меланоми Trp1 існує в плазматичній мембрані, що може сприяти прямому представленню CD4+ Т-клітин пухлинними клітинами B16 (33). Інший антиген, асоційований з меланомою, gp100, презентується пухлинними клітинами CD4+ Т-клітинам у спосіб, що залежить від трансмембранного домену gp100 (34). У недавній роботі, присвяченій дослідженню ролі неоантиген-специфічних CD4+ Т-клітин у моделі мишачої саркоми, епітопи, отримані з мутованої субодиниці інтегрину, також мембранно-зв’язаного білка, були елюйовані з MHC-II на CIITA-трансдукованій пухлині клітини (35). Наші результати свідчать про те, що, незважаючи на те, що пов’язані з мембраною білки можуть переважно транспортуватися до ендосом для прямого представлення на MHC-II, присутності одного імуногенного мембранного білка недостатньо для сприяння такому представленню. Було описано інші некласичні шляхи презентації, які можуть забезпечити доступ цитозольних або ядерних білків до MHC-II, включаючи пов’язану з аутофагією презентацію внутрішньоклітинних білків і транспортера, пов’язану з процесингом антигену, залежну від презентації CD4+ Т-клітин, за допомогою чого антигенні пептиди, ймовірно, переносяться з MHC-I на MHC-II під час рециркуляції мембрани (36, 37). Повідомлялося про пряме MHC-II-залежне розпізнавання аутологічних пухлинних клітин CD4+ Т-клітинами, специфічними для епітопів E7 (38, 39); однак обидва ці дослідження стосувалися білків E7, що експресуються менш поширеними онкогенними субтипами ВПЛ (а саме ВПЛ-33 і ВПЛ-59), представленими клітинами раку шийки матки на молекулах HLA-DR. Таким чином, можливо, що підтип ВПЛ, гістологія пухлини та обмежувальні алелі HLA також можуть бути важливими факторами в диференціальній презентації ядерних антигенів ВПЛ на пухлинних клітинах MHC-II+. Хоча наші дані свідчать про те, що пряма цитотоксичність пухлини не є ймовірним механізмом E6- і KRASG12V-специфічних CD4+ T-клітин, описано інші протипухлинні механізми CD4+ T-клітин, і адоптивний перенос пухлиноспецифічних CD4+ Т-клітин у хворих на рак продемонстрував протипухлинну активність (7, 40, 41). Таким чином, MHC-II-обмежені TCR, такі як ті, що були виявлені в цьому дослідженні, можуть бути корисними для ACT у пацієнтів-людей, враховуючи, що такі TCR націлені на епітопи, отримані з драйверних онкобілків, обмежених HLA-гаплотипами, оціненими в 1,27% і 16,10% білих США. населення відповідно для HLADQA1*01:02/DQB1*05:02 та HLA-DRB5*01:01 (42). Примітно, що CD4+ Т-клітини сприяють праймінгу пухлиноспецифічних CD8+ Т-клітин шляхом ліцензування DC, що несуть антиген, у залежний від CD40L спосіб (43–45). Ми демонструємо, що специфічний для KRASG12V TCR, ідентифікований у цьому дослідженні, розпізнає перехресно представлені антигени в контексті DC, що свідчить про те, що ці клітини можуть сприяти формуванню протипухлинного імунітету за допомогою цієї функції. CD{100}} T-клітини також можуть надавати локальну допомогу CD8+ T-клітинам у пухлинах шляхом секреції цитокінів, таких як IL-2 та IFN-, підтримуючи CD8+ T-клітини виживання та вербування до пухлини (46). Крім того, CD4+ TIL можуть розпізнавати антигени в мікрооточенні пухлини на мієлоїдних клітинах, таких як макрофаги. Дійсно, доклінічні дослідження продемонстрували, що за відсутності MHC-II на пухлинних клітинах адаптивно перенесені Trp1 CD4+ Т-клітини все ще можуть проявляти протипухлинний імунітет, залежний від IFN- і корелюючи з підвищеною цитотоксичною активністю макрофагів (47). Однак це явище, здається, залежить від секреції пухлинного антигену, яка, як ми також припускаємо, є мінімальною у випадку більшості онкогенів. Загалом наше дослідження підкреслює селективність прямої презентації ендогенних антигенів пухлинними клітинами MHC-II+ і демонструє, що ні експресія CIITA, ні наявність мембраннозв’язаного антигену не є достатніми для сприяння прямому розпізнаванню пухлинних клітин CD{{115} } Т-клітини. Потрібні додаткові дослідження, щоб охарактеризувати, які антигени можуть бути представлені безпосередньо пухлинними клітинами MHC-II+ за яких умов, щоб повністю зрозуміти залежну від контексту роль CD4+ T-клітин у раку.
цистанхе рослина, що підвищує імунну систему
методи
Культура клітин. TIL збирали та культивували, як описано раніше (48). Коротко, тканину первинної пухлини розрізали на фрагменти розміром 2–3 мм, які поміщали в 24-лунковий планшет і культивували в RPMI-1640 з додаванням 1{{102}}% сироватка АВ людини, пеніцилін-стрептоміцин, HEPES, гентаміцин і 6,000 МО/мл IL-2. Екстравазовані TIL культивували шляхом заміни половини середовища кожні 2–3 дні. Первинні людські Т-клітини з периферичної крові культивували в середовищі 50:50, що складається з 50% AIM V плюс 50% RPMI-1640 з додаванням 10% сироватки АВ людини, пеніцилін-стрептоміцин (100 ОД/ мл кожного; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 300 МО/мл ІЛ-2, 5 нг/мл ІЛ-7 та 5 нг/мл ІЛ-15. Лінії пухлинних клітин, отримані пацієнтом, були створені та культивовані, як описано раніше (17). Коротко, тканину первинної пухлини розрізали на фрагменти розміром менше 2 мм і дисоціювали за допомогою GentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec). Пухлинні клітини ресуспендували в F-середовищі, що містить 5 мкМ інгібітор кінази Rho, і висівали на шар опромінених фібробластів 3T3 (30 Гр). Після початкового культивування пухлинні клітини розмножували в суміші 3:1 опроміненого 3T3-кондиціонованого середовища та F-середовища, що містить 5 мкМ інгібітор кінази Rho. CaSki (ATCC), NCI-H2444 (ATCC), DAN-G (ATCC), J76 Jurkat (ATCC), 3T3-CD40L і B-LCL підтримували в середовищі RPMI з додаванням l-глутаміну та HEPES ( 10 мМ; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 10% FBS, 1 мМ піруват натрію (Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1 × MEM незамінних амінокислот (Gibco, Thermo Fisher Scientific) і пеніцилін-стрептоміцин (100 ОД/ мл кожен; Gibco). Ми підтримували 293GP (ATCC) у середовищі DMEM з 10% FBS і пеніцилін-стрептоміцином (100 ОД/мл кожного; Gibco, Thermo Fisher Scientific). Клітини IHW03304, GM3107, KAS011, D8 і D66 були подарунками Алессандро Сетте (Інститут імунології Ла Хойя). аналізи ELISPOT. TIL або PBMC поміщали по 100 000 клітин на лунку в планшети ELISPOT, вкриті антиінтерферонними антитілами (1-D1K, Mabtech). Клітини повторно стимулювали пулами пептидів HPV-16 E6 і E7 PepMix (JPT), пулами пептидів, що представляють вибрані онкогенні мутації, або зазначеними окремими пептидами в дозі 5 мкг/мл для пулів або 10 мкг/мл для пептидів протягом 22 годин до розвитку Пластини ELISPOT згідно інструкції виробника (Mabtech). Для позитивного контролю використовували 5 мкг/мл фітогемаглютиніну-L. Культура експансії ex vivo. PBMC були висіяні з пулом пептидів, що представляє вибрані онкогенні мутації при 5 мкг/мл. Свіже середовище, що містить 10 МО/мл IL-2, було додано на 4, 7 і 10 день. На 14 день PBMC повторно стимулювали для використання в аналізах ELISPOT або секреції цитокінів. Секвенування TCR. TIL або PBMC повторно стимулювали 5 мкг/мл HPV-16 E6 PepMix (JPT) або пептидом KRASG12V, а клітини, що секретують IFN, флуоресцентно позначали за допомогою набору Human IFN-Secretion Assay відповідно до інструкцій виробника (Miltenyi Biotec). . Поодинокі клітини IFN- + були відсортовані в 96-лунковий планшет за допомогою FACSAria (BD Biosciences), а RNA-Seq проводили за допомогою Illumina Miseq для ідентифікації парних TCR і ланцюгів. Для ідентифікації E6-специфічного клону CD4+ TCR клітини, що секретують IFN, були відсортовані, як зазначено вище, а послідовності TCR і TCR були ампліфіковані за допомогою вкладеної мультиплексної ПЛР, як описано раніше (49). Продукти ПЛР були подані на секвенування за Сенгером (ETON Biosciences). Для частотного аналізу TCR PBMCs до та після 14-денної експансії ex vivo із зазначеними пептидами були надіслані до Adaptive Biotechnologies. Аналіз експресії ВПЛ. РНК виділяли з клітин первинної пухлини Hu-56 і лінії пухлинних клітин і відправляли на об’ємну RNA-Seq. Зчитування парного кінця секвенування було зіставлено за допомогою BWA (v0.7.12) (50) на повний геном HPV (номер доступу GenBank NC_001526.2) і його відповідний транскриптом. Отриманий файл карти вирівнювання послідовності було перетворено на відсортовану бінарну карту вирівнювання та проіндексовано з подальшим підрахунком зіставлених зчитувань за допомогою SAMtools (v1.2) (50). Секвенування всього екзому. Секвенування цілого екзома та RNA-Seq були виконані в Інституті імунології La Jolla Sequence Core за допомогою наборів Agilent для захоплення цілого екзома та Illumina відповідно. Біозразки FFPE були розповсюджені Онкологічним центром Мурса до Tempus для секвенування наступного покоління разом із відповідною еталонною ДНК з використанням зразків периферичної крові. Послідовність, зчитана з секвенування екзома пухлини, і нормальні зразки були вирівняні з еталонним геномом GRCh38 за допомогою SpeedSeq Align (v0.1.0) (51). Варіанти екзомів ідентифікували за допомогою SpeedSeq Somatic, а варіанти анотували за допомогою SNPeff (v4.3i) (52). Дані RNA-Seq і секвенування цілого екзому для цього рукопису були завантажені в NCBI BioProject, номер доступу PRJNA924789. Т-клітинна ретровірусна трансдукція. Нуклеотидні послідовності TCR були синтезовані та клоновані в кістяку ретровірусу MSGV1 за допомогою BioXP 3200 (Codex). Послідовність була оптимізована за кодоном для експресії в клітинах людини. Константні області TCR людини були замінені на константні області TCR миші із замінами для посилення поверхневої експресії та сприяння переважному сполученню (53, 54). Людські PBMC були виділені з лейкоцитів. CD4+ або CD8+ Т-клітини видаляли за допомогою магнітної селекції, а негативну фракцію, що містила всі лімфоцити, що залишилися, культивували в Т-клітинному середовищі з 50 нг/мл анти-CD3 Ab (OKT3) протягом 2 днів.
Переваги cistanche tubulosa - Протипухлинний
Ретровірусні супернатанти TCR були створені котрансфекцією клітин 293GP вектором MSGV1, що містить відповідну послідовність TCR і плазміду RD113. Через два дні після трансфекції ретровірусні супернатанти збирали та використовували свіжими або замороженими при –80 градусах. Трансдукцію проводили на покритих RetroNectin пластинах (Takara), як описано раніше (5). Експресію постійної області TCR миші оцінювали за допомогою проточної цитометрії для визначення ефективності трансдукції. TCR-інженерні Т-клітини використовували не раніше ніж на 7-й день після початкової стимуляції. Функціональні аналізи Т-клітин. Ми спільно культивували 5 × 104 TIL, трансдуковані Т-клітини або клітини J76 Jurkat з 1 × 105 B-LCL, які пульсували протягом ночі із зазначеними концентраціями пептиду, або 5 × 103 пухлинних клітин, посіяних попереднього дня в {{16} }пластини з U-подібним або плоским дном відповідно. Якщо було вказано, анти-CD28 агоністи (клон CD28.2, BioLegend) або анти-PD-L1 блокуючі (клон 29E.2A3, BioLegend) АТ додавали до співкультур Т-клітин і пухлинних клітин у концентрації 5 і 10 мкг/мл відповідно. Для аналізу цитокінів і маркерів активації в якості позитивного контролю використовували 1× Cell Activation Cocktail (BioLegend), що містить PMA та іономіцин. Для досліджень блокування HLA 20 мкг/мл наступних АТ додавали до B-LCL з пептидним імпульсом принаймні за 2 години до додавання Т-клітин: анти-HLA-DQ (Tü169, BioLegend), анти-HLA-DR (L243, BioLegend) або контроль ізотипу IgG2a миші (MOPC-173, BioLegend). Якщо було зазначено, пухлинні клітини культивували протягом 72 годин з 10 нг/мл рекомбінантного IFN- перед додаванням Т-клітин. Супернатанти збирали через 18–24 години, IFN- вимірювали методом ELISA (Thermo Fisher Scientific), а осад клітин фарбували для проточної цитометрії. Аналіз цитотоксичності проводили шляхом спільного культивування Т-клітин з пухлинними клітинами при вказаному співвідношенні ефектор-мішень. Коротко, 5 × 103 пухлинних клітин висівали та культивували протягом ночі перед додаванням Т-клітин у вказаних співвідношеннях. Лізис клітин-мішеней визначали за допомогою аналізатора клітин xCELLigence Real-Time Cell Analyzer (ACEA Biosciences), який оцінював електричний опір через прилипання клітин кожні 30 хвилин до кінця експерименту. Дані аналізували за допомогою пакета програмного забезпечення xCELLigence RTCA, і результати повідомляли як клітинний індекс, нормалізований до 1 на момент додавання Т-клітин. Аналіз презентації MHC-II. Синтетичні ДНК-конструкції, що кодують наступне, були створені та клоновані в MSGV1 за допомогою BioXP 3200 (Codex): N-кінцеві 25 амінокислот гена HLA-B людини, а потім перші 50 амінокислот HPV-16 E6 або 25 амінокислот KRASG12V, злитих із С-кінцевими 55 амінокислотами людського HLA-B, саморозщеплюваного елемента T2A та кодуючої послідовності EGFP. Вірусні супернатанти генерували, як описано вище, а аутологічні B-LCL трансдукували на планшетах, покритих RetroNectin, після нічної стимуляції на шарі опромінених (0,5 Гр) клітин 3T3, що експресують CD40L людини (3T3-CD40L). Ефективність трансдукції оцінювали шляхом кількісного визначення експресії EGFP проточною цитометрією. Трансдуковані B-LCL стимулювали 3T3-CD40L у присутності 200 МО/мл рекомбінантного людського IL-4 (PeproTech) протягом 2 послідовних раундів по 2–3 дні до спільного культивування з аутологічними TIL. Генерація DC для аналізів презентації антигену. DC були створені за допомогою методу пластикової адгезії. Заморожені PBMC розморожували та висівали в середовище DC (RPMI-1640 з додаванням l-глутаміну, 5% термоінактивованої людської AB сироватки та 100 ОД/мл кожного пеніциліну-стрептоміцину) протягом 2 годин при 37 градусах. Неприклеєні клітини видаляли промиванням теплим PBS, а прилиплі клітини культивували в середовищі DC з додаванням 800 ОД/мл GM-CSF (Tonbo, Cytek Biosciences) і 500 ОД/мл IL-4 (PeproTech) протягом 6 днів . Ми додали 1 мкг/мл пептиду KRASG12V або 20 мкг/мл білка KRASG12V або WT KRAS (Abcam) безпосередньо до незрілих DC протягом ночі. Наступного дня DC збирали та спільно культивували з Т-клітинами, сконструйованими TCR, у співвідношенні 1:1 протягом ночі перед оцінкою посилення CD137 за допомогою проточної цитометрії. Ретровірусна трансдукція пухлинних клітин. Кодуюча послідовність CIITA людини була синтезована (Integrated DNA Technologies) і клонована в MSGV1 компанією Gibson Assembly. Кодуючі послідовності HLADRB5*01:01 і ланцюги, розділені послідовністю P2A, були синтезовані (Integrated DNA Technologies) і клоновані в модифікований лентивірусний вектор pHAGE перед послідовністю T2A, а потім укороченою репортерною послідовністю CD34 компанією Gibson Assembly. Ретровірусні супернатанти генерували з MSGV1, як описано вище. Лентивірусні супернатанти були створені котрансфекцією клітин 293T плазмідами pHAGE, tat, rev, gag/pol і vsv-g. Супернатанти вірусу збирали через 24 години та концентрували центрифугуванням у пробірках Amicon Ultra 5 (MilliporeSigma). Пухлинні клітини висівали і через 1 день середовище замінювали ретровірусним або лентивірусним супернатантом з додаванням 10 мкг/мл полібрену. Через чотири години супернатант, що містить вірус, аспірували та замінили культуральним середовищем. Пухлинні клітини MHC-II+ і CD34+ сортували за допомогою сортувальника клітин FACS Fusion (BD Biosciences). Проточна цитометрія. Клітини мітили моноклональними антигенами, кон’югованими флуорохромом, до таких антигенів: анти-CD3–PE людини (OKT3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD4–PE–Cyanine7 (SK3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD8–APC (Hit8a, Tonbo). , Cytek Biosciences), CD34–Alexa Fluor 647 (581, BioLegend), CD69–PerCP– Cyanine5.5 (FN50, BioLegend), CD137–PE (4B4-1, Miltenyi Biotec), PD-1 –BV650 (EH12.2H7, BioLegend), HLA-II–APC (Tü39, BioLegend) і проти мишачого TCR -APC (H57-597, Tonbo, Cytek Biosciences). Мертві клітини фарбували DAPI або LIVE/DEAD Fixable Aqua (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). Тетрамер E629-38– HLA-A*02:01–PE було зібрано та помічено Центром NIH Tetramer Core Facility. Клітини фарбували 1 мкг/мл тетрамеру протягом 1 години на льоду. Фарбування на поверхневі антигени проводили протягом 15 хвилин на льоду. Для внутрішньоклітинного фарбування цитокінів (ICS) Т-клітини спільно культивували з APC з пептидним імпульсом протягом 4–6 годин у присутності Brefeldin A. Клітини пермеабілізували та фарбували на внутрішньоклітинні цитокіни за допомогою набору Cytofix/Cytoperm Kit (BD Biosciences) після поверхневого фарбування. , відповідно до інструкцій виробника. Для фарбування цитокінів використовували наступні кон’юговані з флуорохромом АТ: IFN- –APC (4S.B3, BioLegend), IL-2–FITC (MQ1- 17H12, BioLegend), TNF- –BV785 (Mab11). , BioLegend) і Granzyme B–PE (QA16A02, BioLegend). Дані були отримані за допомогою проточного цитометра FACSCelesta (BD Biosciences) і проаналізовані за допомогою програмного забезпечення FlowJo v10.7. Статистика. Статистичний аналіз проводили за допомогою Prism 8 (програмне забезпечення GraphPad). Для порівнянь ICS використовувався непарний 2-хвостий t-тест. Для порівняння опосередкованого пригнічення Т-клітинної сигналізації, що блокує HLA, було використано 2-дисперсійний аналіз. Р <0,05 вважали статистично значущим. Схвалення дослідження. Деідентифіковані зразки людини, використані в цьому дослідженні, були отримані за інформованою згодою через протокол UCSD IRB 101391CX «Фенотипування пухлинного середовища та виділення клітин». Учасники дослідження надали письмову інформовану згоду.
Список літератури
1. Ханахан Д., Вайнберг Р.А. Ознаки раку: наступне покоління. Стільниковий. 2011;144(5):646–674.
2. Шамседдін А. А. та ін. Пухлинний імунітет та імунотерапія раку, пов'язаного з ВПЛ. Рак Discov. 2021;11(8):1896–1912.
3. Сімансу Д. К. та ін. Передовий огляд білків RAS та їх регуляторів у захворюваннях людини. Стільниковий. 2017;170(1):17–33. 4. De Vos Van Steenwijk PJ та ін. Несподівано великий поліклональний репертуар ВПЛ-специфічних Т-клітин готовий до дії у пацієнтів з раком шийки матки. Cancer Res. 2010;70(7):2707–2717.
5. Стеванович С та ін. Ландшафт імуногенних пухлинних антигенів в успішній імунотерапії вірусно індукованого епітеліального раку. Наука. 2017;356(6334):200–205.
6. Bhatt KH та ін. Профілювання HPV-16-специфічних Т-клітинних відповідей виявляє широку антигенну реактивність у пацієнтів з раком ротоглотки. J Exp Med. 2020;217(10):e20200389.
7. Veatch JR та ін. Інфільтруючі пухлини BRAF V600E -специфічні CD4 + T-клітини корелювали з повною клінічною відповіддю на меланому. J Clin Invest. 2018;128(4):1563–1568.
8. Veatch JR та ін. Ендогенні Т-клітини CD4+ розпізнають неоантигени у пацієнтів з раком легенів, включаючи рецидивуючі онкогенні мутації KRAS і ERBB2 (Her2). Cancer Immunol Res. 2019; 2 (13): 910–922.
9. Cafri G та ін. Т-клітини пам'яті, націлені на онкогенні мутації, виявлені в периферичній крові пацієнтів з епітеліальним раком. Нац комун. 2019; 10 (1): 449.
10. Tran E та ін. Т-клітинна трансферна терапія, націлена на мутантний KRAS при раку. N Engl J Med. 2016;375(23):2255–2262.
11. Дрейпер Л. М. та ін. Націлювання на ВПЛ-16+ епітеліальні ракові клітини Т-клітинами генної інженерії TCR, спрямованими проти E6. Clin Cancer Res. 2015; 21 (19): 4431–4439.
12. Jin BY та ін. Сконструйовані Т-клітини, націлені на E7, опосередковують регресію раку вірусу папіломи людини на моделі миші. JCI Insight. 2018;3(8):e99488.
13. Ведмідь А.С., та ін. Біохімічна та функціональна характеристика мутантних епітопів KRAS підтверджує цей онкобілок для імунологічного націлювання. Нац комун. 2021;12(1):4365.
14. Oh DY та ін. Внутрішньопухлинні CD4+ Т-клітини опосередковують протипухлинну цитотоксичність при раку сечового міхура людини. Стільниковий. 2020; 181 (7): 1612–1625.
15. Cachot A та ін. Пухлиноспецифічні цитолітичні CD4 Т-клітини забезпечують захисний імунітет проти раку людини. Sci Adv. 2021;7(9):eabe3348.
16. Доран С.Л. та ін. Генна терапія рецепторів Т-клітин для епітеліальних раків, асоційованих з вірусом папіломи людини: перше дослідження на людині фази I/II. J Clin Oncol. 2019;37(30):2759–2768.
17. Лю Х та ін. Умовне перепрограмування та довгострокове розмноження нормальних і пухлинних клітин із біозразків людини. Nat Protoc. 2017;12(2):439–451.
18 Veatch JR та ін. Неоантиген-специфічні CD4+ T-клітини в меланомі людини мають різні стани диференціації та корелюють із функцією CD8+ T-клітин, макрофагів і B-клітин. Ракова клітина. 2022;40(4):393–409.
19. Лоурі Ф. Дж. та ін. Молекулярні сигнатури протипухлинних неоантиген-реактивних Т-клітин метастатичного раку людини. Наука. 2022;375(6583):877–884.
20. Kreiter S та ін. Підвищення ефективності презентації антигену шляхом зв’язування антигенів із сигналами передачі MHC класу I. J Immunol. 2008; 180 (1): 309–318.
21. Зарецький Я.М., та ін. Мутації, пов’язані з набутою стійкістю до блокади PD-1 при меланомі. N Engl J Med. 2016;375(9):819–829.
22. Грос А та ін. Розпізнавання неоантигенів раку шлунково-кишкового тракту людини циркулюючими лімфоцитами PD-1+. J Clin Invest. 2019; 129 (11): 4992–5004.
23. Scholtalbers J, et al. TCLP: онлайн-каталог ліній ракових клітин, що включає тип HLA, передбачувані нео-епітопи, вірус і експресію генів. Genome Med. 2015; 7 (1): 118.
24. Джуня В., Чой Дж., винахідники; BioNTech US Inc., правонаступник. Конструкції Т-клітинного рецептора та їх використання. Патент США № US202103040215A1. 4 листопада 2021 р.
25. Шарп А.Х., Паукен К.Е. Різноманітні функції інгібіторного шляху PD1. Nat Rev Immunol. 2018;18(3):153–167.
26. Abelin JG та ін. Визначення процесингу ліганду HLA-II і правил зв’язування за допомогою мас-спектрометрії покращує прогноз епітопу раку. Імунітет. 2019;51(4):766–779.
27. Silvius JR та ін. K-ras4B і пренільовані білки, у яких відсутні «другі сигнали», динамічно асоціюються з клітинними мембранами. Mol Biol Cell. 2006;17(1):192–202.
28. Chang CH, Flavell RA. Трансактиватор II класу регулює експресію багатьох генів, які беруть участь у презентації антигену. J Exp Med. 1995; 181 (2): 765–767.
29. Rodig SJ та ін. Білки MHC надають диференціальну чутливість до блокади CTLA-4 і PD-1 при нелікованій метастатичній меланомі. Sci Transl Med. 2018;10(450):eaar3342.
30. Ahmadzadeh M, et al. Регуляторні Т-клітини CD4+ людини, що інфільтрують пухлину, демонструють чіткий репертуар TCR і демонструють реактивність до пухлини та неоантигену. Sci Immunol. 2019;4(31):eaao4310.
31. Олівейра Г та ін. Ландшафт допоміжних і регуляторних протипухлинних CD4+ Т-клітин у меланомі. природа 2022;605(7910):532–538.
32. Rock KL, et al. Представте себе! За молекулами MHC класу I та MHC класу II. Trends Immunol. 2016;37(11):724–737.
33. Takechi Y та ін. Білок меланосомної мембрани є мішенню на поверхні клітини для лікування меланоми. Clin Cancer Res. 1996; 2 (11): 1837–1842.
34. Lepage S, Lapointe R. Меланосомальні націлені послідовності з gp100 є важливими для MHC класу II-обмеженого ендогенного епітопу презентації та мобілізації в ендосомальних компартментах. Cancer Res. 2006;66(4):2423–2432.
35. Alspach E та ін. Неоантигени MHC-II формують імунітет пухлини та відповідь на імунотерапію. природа 2019;574(7780):696–701.
36. Dengjel J, et al. Аутофагія сприяє представленню MHC класу II пептидів із внутрішньоклітинних вихідних білків. Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102(22):7922–7927.
37. Matsuzaki J, et al. Некласичні шляхи обробки антигену необхідні для прямого розпізнавання пухлини МНС класу II специфічними CD4+ Т-клітинами NY-ESO-1-. Cancer Immunol Res. 2009; 2 (4): 341–350.
38. Höhn H та ін. CD4+ лімфоцити, що інфільтрують пухлину при раку шийки матки, розпізнають обмежені HLA-DR пептиди, надані вірусом папіломи людини-E7. J Immunol. 1999;163(10):5715–5722.
39. Höhn H та ін. Пептиди E7 вірусу папіломи людини типу 33, представлені HLA-DR*0402 Т-клітинам, які інфільтрують пухлину при раку шийки матки. J Virol. 2000;74(14):6632–6636.
40. Lu YC та ін. Лікування пацієнтів з метастатичним раком з використанням основного комплексу гістосумісності класу II з обмеженим T-клітинним рецептором, націленим на антиген зародкової лінії раку MAGE-A3. J Clin Oncol. 2017;35(29):3322–3329.
41. Tran E та ін. Імунотерапія раку на основі специфічних для мутації CD4+ Т-клітин у пацієнта з епітеліальним раком. Наука. 2014;344(6184):641–645.
42. Gonzalez-Galarza FF, et al. Оновлення бази даних мережі частот алелів (AFND) 2020: класифікація даних золотого стандарту, дані про генотип у відкритому доступі та нові інструменти для запитів. Nucleic Acids Res. 2020; 48 (d1): D783–D788.
43. Schoenberger SP та ін. Допомога Т-клітин цитотоксичним Т-лімфоцитам опосередковується взаємодіями CD40-CD40L. природа 1998;393(6684):480–483.
44. Ahrends T, et al. Т-клітини CD4+ допомагають надати ефекторну програму цитотоксичних Т-клітин, включаючи пригнічення коінгібіторних рецепторів і посилення інвазивності тканин. Імунітет. 2017;47(5):848–861.
45. Ferris ST та ін. cDC1 первинні та ліцензовані CD4+ Т-клітинами для індукції протипухлинного імунітету. природа 2020; 584 (7822): 624–629.
46. Бос Р., Шерман Л.А. Допомога CD4+ Т-клітин у пухлинному середовищі необхідна для рекрутування та цитолітичної функції CD8+ Т-лімфоцитів. Cancer Res. 2010;70(21):8368–8377.
47. Haabeth OAW та ін. CD4+ Т-клітини — опосередковане відторгнення MHC класу II-позитивних пухлинних клітин залежить від секреції антигену та непрямої презентації на APC господаря. Cancer Res. 2018;78(16):4573–4585.
48. Dudley ME та ін. Створення культур лімфоцитів, що інфільтрують пухлину, для використання в адаптивній терапії для пацієнтів з меланомою. J Immunother. 2003; 26 (4): 332–342.
49. Dash P та ін. Одноклітинний аналіз репертуару Т-клітинних рецепторів. Методи Mol Biol. 2015; 1343: 181-197.
50. Лі Х та ін. Формат вирівнювання послідовності/карти та інструменти SAM. Біоінформатика. 2009; 25 (16): 2078–2079.
51. Chiang C та ін. SpeedSeq: надшвидкий аналіз та інтерпретація персонального геному. Нац методи. 2015;12(10):966–968.
52. Cingolani P, et al. Програма для анотування та прогнозування ефектів однонуклеотидних поліморфізмів, SnpEff: SNPs у геномі штаму Drosophila melanogaster w1118; iso-2; iso-3. Муха (Остін). 2012;6(2):80–92.
53. Хага-Фрідман А та ін. Включення трансмембранних гідрофобних мутацій у TCR посилює його поверхневу експресію та функціональну авідність Т-клітин. J Immunol. 2012;188(11):5538–5546.
54. Cohen CJ та ін. Посилена протипухлинна активність Т-клітин, створених для експресії Т-клітинних рецепторів із другим дисульфідним зв’язком. Cancer Res. 2007;67(8):3898–3903.
