Порушення регуляції РНК переносного елемента в мутантних 3D сфероїдах раку легенів KRAS(G12C)
Oct 27, 2023
АНОТАЦІЯ
Мутантний KRAS регулює транспозитивний елемент (TE) РНК і експресію гена, стимульованого інтерфероном (ISG), але залишається незрозумілим, чи різноманітні мутації в KRAS впливають на різні TE РНК у всьому геномі. Ми проаналізували транскриптоми тривимірних сфероїдів раку легенів людини, які містять мутації KRAS(G12C), щоб визначити ландшафт TE РНК, що регулюється мутантним KRAS(G12C). Ми виявили, що передача сигналів KRAS(G12C) необхідна для експресії LINE- і LTR-похідних TE РНК, які відрізняються від TE РНК, які раніше показали, що регулюються мутантними KRAS(G12D) або KRAS(G12V). Крім того, інгібування KRAS(G12C) спеціально посилює регуляцію ТЕ-РНК, отриманих із SINE, із наймолодшої підродини Alu AluY. Наші результати показують, що дисрегуляція TE РНК у клітинах раку легенів, викликаних KRAS, залежить від мутації, а також висвітлює підмножину молодих TE РНК, отриманих з Alu, які координовано активуються генами вродженого імунітету після інгібування KRAS(G12C).
Переваги cistanche tubulosa - Протипухлинний
ВСТУП
РНК переносного елемента (TE) періодично порушується в контексті раку 1. У мутантних клітинах раку легенів KRAS гени цинкового пальця KRAB (KZNF) значно знижуються, що призводить до аномальної регуляції TE РНК, отриманих від LINE, SINE та Елементи LTR 2,3. На додаток до TE РНК, довгі некодуючі РНК (lncRNA) також координовано регулюються сигнальними генами RAS 4, і їх моделі експресії подібним чином змінюються в багатьох видах раку 5-8. Що стосується TE РНК, їх активація при раку індукує стан вірусної мімікрії, що призводить до внутрішньої активації генів вродженого імунітету, таких як гени, стимульовані інтерфероном (ISG) 3,9,10. Зокрема, сімейство Alu SINE є переважним джерелом імуногенних TE РНК 11, які викликані епігенетичними змінами, спричиненими інгібіторами ДНК-метилтрансферази (DNMTi) або опосередкованим KRAS інгібуванням KZNF 3,9,10.
Щоб дослідити, як поширена мутація в KRAS впливає на ландшафт TE РНК у клітинах раку легенів, ми охарактеризували транскриптоми тривимірних сфероїдів раку легенів, які містять мутації KRAS(G12C) за наявності або відсутності мутантного інгібітора KRAS(G12C) 12. Ми показуємо що передача сигналів KRAS(G12C) необхідна для експресії TE-РНК, похідних від LINE та LTR, тоді як інгібування KRAS(G12C) спеціально посилює регуляцію як TE-РНК, похідних від SINE, так і підгрупи генів, пов’язаних з інтерфероном (IFN). Наші результати розкривають складну взаємодію між мутантною передачею сигналів KRAS і дисрегуляцією TE в клітинах раку легенів, де певний набір молодих елементів AluY регулюється в залежності від мутації.
Переваги cistanche tubulosa - Протипухлинний
РЕЗУЛЬТАТИ
Інгібування KRAS(G12C) змінює кодуючий і некодуючий транскриптом
Щоб визначити, як онкогенна передача сигналів KRAS(G12C) регулює кодуючий і некодуючий транскриптом, ми виконали секвенування РНК (RNA-seq) на 3D-мутантних сфероїдах раку легенів KRAS(G12C). Для RNA-seq ми використовували протокол повної довжини з 5'-унікальними молекулярними ідентифікаторами (UMI), щоб уможливити точний підрахунок РНК, одночасно пом’якшуючи зміщення ПЛР-ампліфікації 13 (Малюнок 1A). Ми порівняли транскриптоми сфероїдів раку легенів H358, оброблених інгібітором KRAS(G12C) ARS-1620 (ARS), з контрольними сфероїдами (обробленими ДМСО) (рис. S1A) і побачили, що лікування ARS суттєво знизило рівні фосфорильованих ERK (p-ERK) (Рисунок S1B), що вказує на те, що лікування ARS пригнічувало передачу сигналів KRAS(G12C) нижче. Пригнічення передачі сигналу KRAS(G12C) під час лікування ARS також було підтверджено зменшенням розміру сфероїда та життєздатності клітин (рис. S1C та S1D).
На рівні РНК ми оцінили відносну кількість різних біотипів і суперродин TE в 3D-сфероїдах раку легенів, оброблених ARS або DMSO, що виявило динамічні зміни в складі TE РНК після інгібування KRAS(G12C) (рис. 1B). Незважаючи на те, що ми виявили лише 32% генів, що кодують білки, анотованих GENCODE, і 15% генів lncRNA, 92-96% надродин TE (92% LTR, 95% SINE, 96% LINE) були представлені в нашій тезі UMI Дані RNA-seq, які виявляють широку дисрегуляцію TE РНК у керованому KRAS(G12C) транскриптомі. До чверті всіх виявлених молекул РНК у сфероїдах раку легенів, оброблених ARS, були отримані з TE, що вказує на те, що TE РНК представляють значну частину транскрипційного виходу мутантних клітин раку легенів KRAS(G12C).
Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему
Натисніть тут, щоб переглянути продукти Cistanche Enhance Imunity
【Запитуйте більше】 Електронна пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Далі ми визначили суттєво різну експресію генів між тривимірними сфероїдами раку легенів, обробленими ARS та DMSO, щоб ідентифікувати біологічні процеси, які регулювалися онкогенною передачею сигналів KRAS (G12C). Сфероїди раку легенів з інтактною передачею сигналів KRAS(G12C) були значно збагачені генами, залученими до контрольної точки G2M, мішеней E2F, мішеней MYC і мітотичного веретена (рис. 1C). Однак після інгібування KRAS(G12C) сфероїди раку легенів експресували значно вищі рівні генів, залучених до окислювального фосфорилювання, комплементу та альфа- та гамма-відповідей IFN (рис. 1C), що є додатковим підтверджуючим доказом участі сигналізації KRAS у регуляції IFN-споріднених генів 2,3.
Інгібування KRAS(G12C) координовано індукує ISG та молоді елементи AluY
Для подальшого з’ясування внутрішньої регуляції ISG при інгібуванні KRAS(G12C) ми визначили, які гени та TE значно відрізняються від експресії в кожному наборі генів і суперродині TE відповідно. Серед генів відповіді на альфа-інтерферон-гамма-інтерферон найсильнішим індукованим геном при інгібуванні KRAS(G12C) у сфероїдах раку легенів був RTP4 (рис. 2A), рецепторний транспортний білок, який негативно регулює передачу сигналів TBK1 14. Крім того, комплекс MHC класу I ген бета-2-мікроглобуліну (B2M), який періодично інактивується при раку легенів 15, також був значно активізований в обох пов’язаних з IFN наборах генів у сфероїдах раку легенів, оброблених ARS (рис. 2A).
Враховуючи пряму роль онкогенної передачі сигналів KRAS у регуляції 3 TE РНК, ми дослідили, які підродини TE РНК були залежними від мутантного KRAS(G12C). У сфероїдах раку легенів з інтактною передачею сигналів KRAS(G12C) ми виявили, що підродини LINE L1M6B і L1PA12 були сильно експресованими та залежними від KRAS(G12C), про що свідчить їх зниження регуляції у сфероїдах раку легенів, які отримували лікування ARS (рис. 2B). Крім того, хоча лише одна підродина ДНК MER44D залежала від передачі сигналів KRAS(G12C), понад десяток підродин LTR регулювалися мутантним KRAS(G12C), включаючи MLT1A0-int, LTR51, MER50B і LTR1B0 (рис. 2B). Навпаки, всі підродини SINE були значно посилені при інгібуванні KRAS(G12C) і координовано індуковані специфічними генами ISG (рис. 2A) у сфероїдах раку легенів. Усі ці РНК SINE TE були отримані з підродини AluY (рис. 2B), що вказує на те, що інгібування KRAS(G12C) порушує регуляцію певної підмножини молодих елементів AluY.
Інгібування KRAS(G12C) знижує регуляцію довгих некодуючих РНК
Для подальшого з’ясування впливу інгібування KRAS(G12C) на транскриптом ми дослідили всі значно диференційовано експресовані lncRNA у сфероїдах раку легенів, оброблених ARS або контролем DMSO. Ми виявили, що експресія великої кількості lncRNA залежить від передачі сигналів KRAS(G12C), оскільки багато з цих lncRNA значно знижуються при інгібуванні KRAS(G12C) (рис. 3A). Три з цих lncRNA зі зниженою регуляцією, AC114546.3, NCMAP-DT і AC073575.2, не мають відомих функцій, але перекриваються в антисмисловій орієнтації на кодуючі гени ZNF770, RCAN3 і ERP29 відповідно. Як клас некодуючих РНК, ми спостерігали широке зниження регуляції lncRNA під час лікування ARS у сфероїдах раку легенів (рис. 3B), що вказує на те, що експресія багатьох lncRNA залежить від сигналізації KRAS(G12C).
Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему
ДИСКУСІЯ
Тут ми показуємо, що онкогенна передача сигналів KRAS(G12C) потрібна для експресії специфічних надродин TE, а саме елементів LINE та LTR, а також підмножини lncRNA, додатково демонструючи, як передача сигналів RAS регулює некодуючий транскриптом 2-4. Ми також використовували 3D-сфероїдну модель раку легенів для наших експериментів з інгібіторами KRAS(G12C), оскільки було показано, що 3D-моделі точніше повторюють реакцію на ліки in vivo порівняно з 2D-моделями культури 16. Крім того, наше застосування повного UMI на основі UMI Техніка RNA-seq довжини 13 дозволила нам точніше зафіксувати склад і динаміку ТЕ РНК у наших сфероїдах раку легенів шляхом видалення ПЛР-дублікатів у наших даних RNA-seq.
Наші висновки узгоджуються з попередніми дослідженнями інгібування KRAS(G12C), де гени відповіді IFN альфа та гамма були активовані в клітинах раку легенів H358, оброблених ARS 17. На основі відомих імуногенних властивостей РНК, отриманих з Alu 11, наші результати свідчать про те, що специфічна регуляція молодих елементів AluY при інгібуванні KRAS(G12C) принаймні частково відповідає за сильну регуляцію ISG у сфероїдах раку легенів, оброблених ARS. Примітно, що значне збагачення генів, пов’язаних з IFN, у відповідь на лікування інгібіторами KRAS(G12C) не включає подальшу регуляцію ISG датчиків РНК, таких як MDA-5, RIG-I або PKR, які спочатку стають активованими в легеневі клітини у відповідь на онкогенний сигнал KRAS 2,3.
Раніше ми показали, що самої передачі сигналу мутантного KRAS достатньо, щоб індукувати регуляцію TE РНК у клітинах легенів людини, які були трансформовані in vitro 2,3, і наші результати, описані тут, поширюють ці спостереження на клітини раку легенів з іншою активуючою мутацією KRAS. Обидві мутації KRAS(G12D) або KRAS(G12V) індукують значне посилення підродини LTR12C у трансформованих легеневих клітинах 3, але ми не спостерігали значного збагачення LTR12C-похідних TE РНК у наших KRAS(G12C) сфероїдах раку легенів. Натомість ми спостерігали підвищення регуляції LTR51, LTR1B0, LTR14B і LTR28B, що свідчить про те, що різноманітні мутації посилення функції в KRAS регулюють різні аспекти транскриптому TE РНК.
Наша робота забезпечує всебічну оцінку того, як некодуючий транскриптом/транскриптом TE РНК динамічно реагує на інгібування KRAS(G12C). Майбутні дослідження можуть дати нове розуміння потенційної ролі некодуючих/TE РНК у механізмах стійкості до інгібіторів KRAS(G12C). Крім того, TE РНК, які виділяються з ракових клітин після інгібування KRAS, можуть служити біомаркерами позаклітинної РНК 2,3,5,18,19 відповіді та/або стійкості до терапії інгібіторами KRAS 20.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Клітинні лінії
Клітинні лінії раку легенів H358, що містять мутацію KRAS(G12C), культивували в середовищі RPMI 1640 (Invitrogen), доповненому 10% фетальної бичачої сироватки (Sigma) при 37°C, 5% CO2 у зволоженому інкубаторі. Усі клітинні лінії показали негативний результат на мікоплазму. Клітинні лінії були придбані в American Type Culture Collection (ATCC).
Дослідження життєздатності клітин
Для аналізу життєздатності сфероїдів 10 000 клітин на лунку висівали в круглодонні 96-планшети з низькою адгезією та інкубували при 37 градусах, 5% CO2 протягом 24 годин. Потім до клітин додавали серійно розведені ARS- 1620 або DMSO, і планшети інкубували в стандартних умовах культивування протягом 72 годин, при цьому свіжі середовища ARS і DMSO замінювали щодня. Життєздатність клітин вимірювали за допомогою набору для аналізу життєздатності клітин Cell Titer-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega) згідно з протоколом виробника. Сигнал люмінесценції зразків, оброблених ARS, нормалізували до контролю ДМСО. Люмінесценцію вимірювали на молекулярному приладі SpectraMax iD3.
Виділення РНК
Загальну масу РНК виділяли з приблизно 100 сфероїдів H358 (за умовою) за допомогою набору Quick-RNA Mini-Prep (Zymogen) згідно з протоколом виробника. РНК кількісно визначали за допомогою спектрофотометра NanoDrop-8000.
Підготовка бібліотеки RNA-seq
Адаптований протокол Smart-seq3 13 використовувався для створення бібліотек RNA-seq із повної РНК для підрахунку та оцінки повнорозмірних молекул РНК. Коротко, 10нг загальної РНК було зворотно транскрибовано за допомогою праймера олігоDT зі штрих-кодом (125 нМ) з подальшим перемиканням шаблону за допомогою олігонуклеотиду перемикача штрих-коду шаблону (125 нМ). Ці олігопослідовності служили праймерами для ПЛР-ампліфікації. Набір Nextera HT (Illumina) використовувався для перетворення бібліотек кДНК у бібліотеки секвенування з додаванням UMI-специфічного праймера для ампліфікації кінців кДНК, що містять молекулярні штрих-коди, як описано в протоколі Smart-seq3. Якість кДНК і бібліотеки оцінювали за допомогою високочутливого чіпа ДНК біоаналізатора Agilent і кількісно визначали за допомогою аналізу ДНК високої чутливості на Qubit 3.0.
Вестерн-блот
Приблизно 100 сфероїдів H358 (на стан) було виділено після обробки ARS або DMSO. Потім сфероїди інкубували на льоду в буфері RIPA, доповненому інгібітором протеази, протягом 15 хвилин. Потім лізати обертали при 10 000 RCF протягом 10 хвилин. Потім супернатант переносили в нову пробірку для подальшого приготування зразка SDS-PAGE в буфері Laemmli, кип’ятили протягом 5 хвилин при 95°C для кінцевої концентрації 1 мг/мл. SDS PAGE проводили для розділення білка за розміром з подальшим перенесенням на мембрану PVDF. Мембрани інкубували з первинними антитілами p-ERK (CST) і HSP90 (CST) протягом ночі при 4°C. Потім вторинні антитіла (Abcam) інкубували на мембранах, промитих 3 рази TBST, у блокуючому буфері для подальшого візуалізації.
Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему
Дедуплікація UMI
Парні зчитування кінцевого світла були обрізані адаптером за допомогою FastP 21 із налаштуваннями за замовчуванням. UMI було витягнуто зі зчитування та переміщено до назви зчитування за допомогою umi_tools_extract з пакета UMI-tools 22 із шаблоном штрих-коду, встановленим на «NNNNNNNN». Видалені зчитування UMI були вирівняні з HG38 за допомогою вирівнювача STAR із набором анотацій GENCODE v38. Вирівняні зчитування було дедупліковано за допомогою «UMI-tools dedup» із налаштуваннями за замовчуванням.
Аналіз RNA-seq
Усі файли fastq обрізали за допомогою Trimmomatic 2 (0.38) 23, а отримані обрізані файли оцінювали за допомогою FastQC 24, а потім обробляли за допомогою наступного аналітичного конвеєра: Salmon (1.3.0): псевдовирівнювання РНК -seq зчитує Salmon 25 з використанням таких аргументів: {{1{{20}}}}validateMappings –gcBias --seqBias --recoverOrphans --rangeFactorizationBins 4 за допомогою індекс, створений з файлу транскриптому GENCODE версії 35 fasta з використанням послідовностей-приманок для забезпечення вибіркового вирівнювання. Додатковий індекс з урахуванням TE був створений подібним чином, але доповнений послідовностями, згенерованими з доріжки Repeat Masker UCSC. DESeq2 (1.32.0): вихідні дані Salmon було імпортовано в об’єкт DESeq за допомогою tximport 26, а аналіз диференціального виразу було виконано зі стандартними аргументами 27. Усі результати були відфільтровані, щоб мати padj < 0,05. Там, де використовувалися дані підрахунку, вони були нормалізовані між зразками за допомогою DESeq.
Аналіз збагачення набору генів
Диференційно експресовані гени були ранжовані за зменшеними значеннями log2FoldChange, створеними DESeq2. Набори генів були отримані за допомогою пакета R msigdbr (7.4.1) і відфільтровані, щоб містити лише набори генів зі статусом «Hallmark». R-пакет fgsea (1.18.0) використовувався для створення оцінок збагачення набору генів, які були відфільтровані до результатів зі скоригованими значеннями p < 0.05.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Бернс, KH (2017). Переносні елементи при раку. Nat Rev Cancer 17, 415-424. 10.1038/nrc.2017.35.
2. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L., Kim, E., Malik, S., Fernandes, J., та ін. (2020). Епігеномне перепрограмування повторюваних некодуючих РНК і IFN-стимульованих генів мутантним KRAS. bioRxiv, 2020.2011.2004.367771. 10.1101/2020.11.04.367771.
3. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Hrabeta-Robinson, E., Behera, A., Peddu, V., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L. ., та ін. (2022). Мутантний KRAS регулює РНК переносного елемента та вроджений імунітет через гени цинкового пальця KRAB. Звіти клітинок 40. 10.1016/j.celrep.2022.111104.
4. Кім, Д.Х., Маринов, Г.К., Пепке, С., Сінгер, З.С., Хе, П., Вільямс, Б., Шрот, Г.П., Еловіц, М.Б., і Волд, Б.Дж. (2015). Аналіз одноклітинного транскриптома виявляє динамічні зміни в експресії lncRNA під час перепрограмування. Стовбурова клітина 16, 88-101. 10.1016/j.stem.2014.11.005.
5. Reggiardo, RE, Maroli, SV, and Kim, DH (2022). Біомаркери LncRNA запалення та раку. Adv Exp Med Biol 1363, 121-145. 10.1007/978-3-030-92034-0_7.
6. Шмітт, AM, і Чанг, HY (2016). Довгі некодуючі РНК у шляхах розвитку раку. Ракова клітина 29, 452-463. 10.1016/j.ccell.2016.03.010.
7. Рінн, Дж.Л., і Чанг, Г.Й. (2020). Довгі некодуючі РНК: молекулярні модальності функцій організму. Annu Rev Biochem 89, 283-308. 10.1146/annurev-biochem- 062917-012708.
8. Слек, Ф. Дж., Чіннаян, А. М. (2019). Роль некодуючих РНК в онкології. Комірка 179, 1033-1055. 10.1016/j.cell.2019.10.017.
9. Чіаппінеллі, Кетрін Б., Стріссель, Памела Л., Дерічард, А., Лі, Х., Хенке, К., Акман, Б., Хайн, А., Роте, Ніл С., Коуп, Леслі М. , Снайдер А. та ін. (2015). Інгібування метилювання ДНК викликає реакцію інтерферону при раку через дцРНК, включаючи ендогенні ретровіруси. Комірка 162, 974-986. 10.1016/j.cell.2015.07.011.
10. Рулуа Д., Лу Яу Х., Сінгханія Р., Ван Ю., Данеш А., Шен Ю. Шу, Хан Х., Лян Г., Джонс Пітер А. П'ю, Тревор Дж. та ін. (2015). ДНК-деметилюючі агенти націлені на клітини колоректального раку шляхом індукції вірусної мімікрії за допомогою ендогенних транскриптів. Комірка 162, 961-973. 10.1016/j.cell.2015.07.056.
11. Мехдіпур П., Мархон С.А., Еттаєбі І., Чакраварті А., Хоссейні А., Ван Ю., де Кастро Ф.А., Лу Яу Х., Ішак К., Абельсон С. ., та ін. (2020). Епігенетична терапія індукує транскрипцію інвертованих SINE і залежність від ADAR1. Природа 588, 169-173. 10,1038/с41586-020-2844-1.
12. Ostrem, JM, Peters, U., Sos, ML, Wells, JA, and Shokat, KM (2013). Інгібітори K-Ras(G12C) алостерично контролюють афінність GTP та ефекторні взаємодії. Nature 503, 548- 551. 10.1038/nature12796.
13. Hagemann-Jensen, M., Ziegenhain, C., Chen, P., Ramskold, D., Hendriks, GJ, Larsson, AJM, Faridani, OR, and Sandberg, R. (2020). Підрахунок одноклітинної РНК при розділенні алелів та ізоформ за допомогою Smart-seq3. Nat Biotechnol 38, 708-714. 10,1038/с41587-020- 0497-0.
14. Хе X., Ешбрук AW, Ду Y., Wu J., Hoffmann HH, Zhang C., Xia L., Peng YC, Tumas KC, Singh BK та ін. (2020). RTP4 пригнічує відповідь IFN-I та посилює експериментальну церебральну малярію та нейропатологію. Proc Natl Acad Sci USA 117, 19465- 19474. 10.1073/pnas.2006492117.
15. Перейра К., Гіменес-Ксав’єр П., Прос Е., Пахарес М.Дж., Моро М., Гомес А., Наварро А., Кондом Е., Моран С., Гомес- Лопес Г. та ін. (2017). Геномне профілювання отриманих від пацієнтів ксенотрансплантатів для виявлення раку легенів ідентифікує інактивацію B2M, що погіршує імунорозпізнавання. Clin Cancer Res 23, 3203-3213. 10.1158/1078-0432.CCR-16-1946.
16. Sen, C., Freund, D., and Gomperts, BN (2022). Тривимірні моделі легені: минуле, теперішнє та майбутнє: мініогляд. Biochem Soc Trans 50, 1045-1056. 10.1042/BST20190569. 17. Мугарза, Е., ван Малдегем, Ф., Бумеля, Дж., Мур, Ч., Рана, С., Ллоріан Сопена, М., Іст, П., Амблер, Р., Анастасіу, П., Ромеро -Клавіхо, П. та ін. (2022). Терапевтичне інгібування KRAS (G12C) забезпечує ефективний опосередкований інтерфероном протипухлинний імунітет при імуногенному раку легенів. Sci Adv 8, eabm8780. 10.1126/sciadv.abm8780.
18. Ходжа Р., Реджардо Р.Е., Озен М., Маролі С.В., Каррільо Д., Демірчі У. та Кім Д.Х. (2022). Сигнатури позаклітинної РНК мутантних клітин аденокарциноми легенів KRAS(G12C). bioRxiv, 2022.2002.2023.481574. 10.1101/2022.02.23.481574.
19. Ван Дж., Ма П., Кім Д.Х., Лю Б.Ф. та Демірчі У. (2021). До мікрофлюїдної ізоляції та виявлення екзосом для терапії пухлин. Nano Today 37. 10.1016/j.nantod.2020.101066.
20. Мур, А.Р., Розенберг, С.К., МакКормік, Ф., і Малек, С. (2021). RAS-цільова терапія. Nat Rev Drug Discov. 10,1038/с41573-021-00220-6.
21. Чень, С., Чжоу, Ю., Чен, Ю., і Гу, Дж. (2018). fastp: надшвидкий препроцесор FASTQ «все в одному». Біоінформатика 34, i884-i890. 10.1093/bioinformatics/bty560.
22. Сміт Т., Хегер А. та Садбері І. (2017). UMI-інструменти: моделювання помилок секвенування в унікальних молекулярних ідентифікаторах для підвищення точності кількісного визначення. Genome Res 27, 491- 499. 10.1101/гр.209601.116.
23. Bolger, AM, Lohse, M., and Usadel, B. (2014). Trimmomatic: гнучкий тример для даних послідовності Illumina. Біоінформатика 30, 2114-2120. 10.1093/bioinformatics/btu170.
24. Браун, Дж., Піррунг, М., і Маккью, Луїзіана (2017). Інформаційна панель FQC: інтегрує результати FastQC у веб-інтерактивний інструмент контролю якості FASTQ, що розширюється. Біоінформатика. 10.1093/bioinformatics/btx373.
25. Патро, Р., Даггал, Г., Лав, М.І., Ірізаррі, Р.А., і Кінгсфорд, К. (2017). Salmon забезпечує швидку кількісну оцінку експресії транскрипту з урахуванням упереджень. Nat Methods 14, 417-419. 10.1038/nmeth.4197.
26. Сонесон К., Лав М.І. та Робінсон доктор медицини (2015). Диференціальний аналіз для RNA-seq: оцінки на рівні транскриптів покращують висновки на рівні генів. F1000Res 4, 1521. 10.12688/f1000research.7563.2.
27. Лав М.І., Хубер В. та Андерс С. (2014). Модерована оцінка зміни кратності та дисперсії для даних RNA-seq за допомогою DESeq2. Genome Biol 15, 550. 10,1186/с13059-014- 0550-8.
ПОДЯКА
Ми дякуємо членам Kim Lab за корисні обговорення. Ця робота була підтримана коштами Інженерної школи Баскіна (до DHK). DC отримав підтримку від Програми дослідження хвороб, пов’язаних із курінням (T30DT0997), RER отримав підтримку від F99/K00 NIDDK KUH від Національного інституту здоров’я (1F99DK{). {7}}), а В. П. був підтриманий нагородою для підготовки до докторантури від Програми дослідження захворювань, пов’язаних із курінням (T32DT4904).
АВТОРСЬКИЙ ВНЕСОК
DHK концептуалізував дослідження, DC і DHK розробили дослідження, DC, JL і GM провели експерименти, RER і VP проаналізували дані, а DC і DHK написали статтю за допомогою авторів.
ФІГУРИ
Рисунок 1. Інгібування KRAS(G12C) змінює кодуючий і некодуючий транскриптом A. Схема експерименту. B. Розподіл підрахунків, призначених для кодування GENCODE, lncRNA та суперродин TE/повторів у оброблених ARS (ars) або оброблених DMSO (dmso) бібліотеках сфероїдної РНК-секвенації раку легенів, де кожен стовпець представляє біологічну репліку. C. Результати аналізу значного збагачення набору генів, які спостерігалися в сфероїдах раку легенів, які отримували DMSO (правий, позитивний NES) або ARS (лівий, негативний NES), з використанням диференціально експресованих генів, ранжированих за нормалізованим показником збагачення (NES).
Рисунок 2. Інгібування KRAS(G12C) координовано індукує ISG та молоді елементи AluY
A. Діаграми вулкана, що зображують значну диференціальну експресію, що спостерігається в ключових наборах генів між сфероїдами раку легенів, оброблених ДМСО (праворуч, позитивна зміна складності) або оброблених ARS (ліворуч, негативна зміна складки). B. Діаграми вулкана, що зображують значну диференціальну експресію, що спостерігається в суперсімействах ТЕ між сфероїдами раку легенів, оброблених ДМСО (праворуч, позитивна зміна складності) або оброблених ARS (ліворуч, негативна зміна складки).
Рисунок 3. Інгібування KRAS(G12C) знижує регуляцію довгих некодуючих РНК
A. Вулканічна діаграма значної диференційованої експресії РНК і lncRNA, що кодують білок GENCODE, між сфероїдами раку легенів, обробленими ДМСО (справа, позитивна складка) або ARS (ліворуч, негативна складка). B. Коробчатий графік значної диференціації експресії РНК, що кодує білок GENCODE, і lncRNA між сфероїдами раку легенів, обробленими ДМСО (верхня частина, позитивна зміна складності) або ARS (нижня частина, негативна зміна складки) (Wilcoxon).
ДОДАТКОВИЙ РИС
Малюнок S1.
A. H358 3D сфероїди раку легенів, які лікували ARS або DMSO. B. Вестерн-блот для p-ERK і HSP90 з використанням H358 3D сфероїдів раку легенів, оброблених ARS або DMSO. C. Вимірювання діаметра (у мікрометрах) (лівий графік) і життєздатності клітин (люмінесцентна життєздатність клітин Cell Titer-Glo® у відносних одиницях флуоресценції) (правий графік) сфероїдів раку легенів H358 3D, оброблених ARS або DMSO після 3 або 5 днів лікування (500 нМ ARS-1620 або ДМСО). D. Вимірювання діаметра (в мікрометрах) сфероїдів раку легенів H358 3D, оброблених різними концентраціями ARS-1620 (нМ) протягом 7 днів.
