Зчитувач РНК M6 A YTHDF2 контролює протипухлинний та противірусний імунітет NK-клітин, частина 6
Feb 22, 2024
Модель метастатичної меланоми та виклик MCMV
Клітини B16F10 (105) вводили мишам внутрішньовенно. Через 14 днів після ін'єкції мишей піддавали евтаназії для посмертного аналізу. Метастатичні вузлики в легенях аналізували макроскопічно та підраховували. Клітинну лінію B16F10 надала Hua Yu (City of Hope, Лос-Анджелес, Каліфорнія). Мишей Ythdf2ΔNK і Ythdf2WT інфікували внутрішньовенною ін’єкцією штаму Сміта MCMV (2,5 × 104 PFU), який було придбано в Американській колекції типових культур (VR-1399). Зразки периферичної крові отримували через підщелепну пункцію на 0, 4 і 7 день після інфікування.
Вузлики метастазування в легенях — це вузлики, утворені клітинами злоякісної пухлини з інших місць, які мігрують у легені через кров або лімфатичну систему. Для багатьох пацієнтів це звичайний прояв раку легенів.
Однак, незважаючи на те, що метастази в легенях становлять загрозу для фізичного здоров’я пацієнтів, прямого зв’язку між цим і пам’яттю немає. Тому ми повинні активно протистояти проблемам раку легенів і вузликам метастазів у легенях і не дозволяти негативним емоціям і тривозі впливати на наше фізичне та психічне здоров’я.
У той же час ми можемо підтримувати і покращувати пам'ять за допомогою деяких позитивних методів. Наприклад, тренуйте пам’ять, як-от математичні розрахунки, читання, прослуховування музики, ігри тощо. Крім того, дотримання хороших життєвих звичок, таких як регулярні фізичні вправи, достатній сон, здорове харчування тощо, також може покращити нашу пам'ять.
Найголовніше – зберігати позитивний настрій. Незалежно від того, з якими труднощами ви зіткнетеся, ви повинні вірити у свої сили та гнучкість своєї нервової системи, і завдяки позитивним налаштуванням і реакціям ви зрештою успішно подолаєте труднощі.
Коротше кажучи, хоча метастатичні вузлики в легенях становлять загрозу для фізичного здоров’я, вони не пов’язані безпосередньо з пам’яттю. Ми повинні сприймати це позитивно, підтримувати та покращувати свою пам’ять, змінюючи спосіб життя та підтримуючи хороше ставлення. Видно, що нам потрібно покращити пам’ять, і Cistanche deserticola може значно покращити пам’ять, оскільки Cistanche deserticola також може регулювати баланс нейромедіаторів, наприклад підвищувати рівень ацетилхоліну та факторів росту. Ці речовини дуже важливі для пам'яті та навчання. Крім того, Cistanche deserticola може також покращити кровообіг і сприяти доставці кисню, що може гарантувати, що мозок отримує достатню кількість поживних речовин і енергії, тим самим покращуючи життєздатність і витривалість мозку. Видно, що нам потрібно покращити пам’ять, і Cistanche deserticola може значно покращити пам’ять, оскільки Cistanche deserticola також може регулювати баланс нейромедіаторів, наприклад підвищувати рівень ацетилхоліну та факторів росту. Ці речовини дуже важливі для пам'яті та навчання. Крім того, Cistanche deserticola може також покращити кровообіг і сприяти доставці кисню, що може гарантувати, що мозок отримує достатню кількість поживних речовин і енергії, тим самим покращуючи життєздатність і витривалість мозку.
Клацніть знати добавки для покращення пам’яті
Для вимірювання вірусного навантаження в периферичній крові, селезінці та печінці було виділено ДНК за допомогою QIAGEN DNeasy Blood and Tissue Kit для аналізу КПЦР. Були використані такі праймери: MCMV-IE1, 59-AGCCACCAACATTGACCACGCAC-39 (прямий) і MCMVIE1, 59-GCCCCAACCAGGACACACAACTC-39 (зворотний).
Лікування мишей in vivo IL-15
Для лікування мишей in vivo IL-15 мишам Ythdf2ΔNK і Ythdf2WT вводили 2 мкг внутрішньовенно внутрішньовенно рекомбінантного людського IL-15 (кат. № 745101; Національний інститут раку) протягом 5 днів. Лікованих і контрольних мишей потім евтаназували для проточної цитометрії.
Проточна цитометрія
Одноклітинні суспензії готували з BM, крові, селезінки, печінки та легенів мишей Ythdf2ΔNK і Ythdf2WT, як описано раніше (Wang et al., 2018b). Аналіз проточною цитометрією та сортування клітин проводили на LSRFortessa X-20 та FACSAriaFusion Flow Cytometer (BD Biosciences) відповідно.
Дані були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення NovoExpress (Agilent Technologies).
Використовувалися наступні мічені флуоресцентним барвником антитіла від BD Biosciences, BioLegend, Invitrogen або Cell Signaling Technology: CD3ε (145-2C11), CD19 (1D3), Gr-1 (RB6-8C5 ),TER-119 (TER-119), CD11c (N418), CD4 (GK1.5), CD8 (53-6.7),CD122 (5H4), CD132 (TUGm2), NK1.1 (PK136), CD11b (M1/70), CD27 (LG.3A10), CD117 (2B8), CD127 (SB/199), CD135 (A2F10.1), KLRG1 (2F1), CD45 ({{46) }}F11), CD45.1 (A20), CD45.2 (104), IFN- (XMG1.2), 2B4 (m2B4), гранзим B (QA16A02), перфорин (S16009A), Ly49H (3D10), Ly49D ( 4e5), CD69 (H1.2F3), CD226(TX42.1), NKG2D (CX5), NKG2A (16A11), NKp46 (29A1.4), TIGIT(1G9), PD-1 (J43), аннексин V, Ki67 (b56), Tbet (4b10) і Eomes (WD1928), фосфо-p44/42 Erk1/2 (Thr202/Tyr204, #9101), фосфо-Akt (Ser473, #5315), рибосомальний білок фосфо-S6 фосфо-Stat3 (Tyr705, №9145) і фосфо-Stat5 (Tyr694, №9539).
Для оцінки проліферації NK-клітин клітини мітили 5 мкМ CTV (Invitrogen) згідно з протоколом виробника перед перенесенням їх мишам-реципієнтам. Внутрішньоклітинне фарбування Ki67, Tbet та Eomes проводили шляхом фіксації та пермеабілізації за допомогою набору для фарбування Foxp3/транскрипційного фактора (eBioscience).
Для виявлення фосфорильованих білків очищені NK-клітини селезінки попередньо обробляли рекомбінантним людським IL-15 (50 нг/мл) протягом 1 години, а потім фіксували Phosflow Fix Buffer I з подальшою пермеабілізацією Phosflow Perm Buffer III (BD Biosciences) і фарбували за допомогою антитіла.
Передача адоптивної клітини
Для оцінки впливу дефіциту Ythdf2 на дозрівання NK-клітин, суміш 5 × 106 клітин BM у співвідношенні 1:1 від мишей CD45.1 або Ythdf2ΔNK CD45.2 були спільно перенесені в Rag2-/-Il2rg-/-мишей. Відновлення реципієнтів оцінювали за допомогою проточної цитометрії через 8 тижнів після трансплантації.
Для експериментів з гомеостатичною проліферацією, спричиненою лімфопенією, однакову кількість очищених NK-клітин селезінки від CD45.1 або Ythdf2ΔNK CD45.2 мишей було спільно перенесено в Rag2−/−Il2rg−/− мишей з подальшою оцінкою відносного відсотка перенесених WT та Ythdf2ΔNK NK-клітин у селезінці реципієнтів Rag2−/−Il2rg−/− за допомогою проточної цитометрії у вказані моменти часу.
Для моделі метастатичної меланоми 106 IL-2-розширених NK-клітин від мишей Ythdf2ΔNK або Ythdf2WT вводили внутрішньовенно мишам Rag2−/−Il2rg−/−. Через 1 день мишам внутрішньовенно вводили клітини B16F10 (105). Через 14 днів після ін'єкції мишей піддавали евтаназії для посмертного аналізу. У деяких експериментах клітини мітили CTV (5 мкМ, Invitrogen) для відстеження клітинної проліферації перед перенесенням.
Тест на торгівлю in vivo
Для виявлення переміщення NK-клітин із BM у периферичну кров мишам C57BL/6 вводили 1 мкг внутрішньовенно APC-міченого антитіла проти CD45. Через дві хвилини після ін’єкції антитіл мишей негайно евтаназували, а клітини BM збирали для проточної цитометрії після фарбування клітин антитілами CD3 і NK1.1. Паренхіматозні NK-клітини ідентифікували за відсутністю фарбування CD45, тоді як синусоїдальні NK-клітини ідентифікували за наявністю мічення CD45. Таким чином, співвідношення NK-клітин у синусоїдах (CD45+) до таких у паренхіматозних областях (CD45−) вказує на переміщення NK-клітин із BM у периферичну кров у стабільному стані.
RT-qPCR у реальному часі та імуноблот
РНК виділяли за допомогою RNeasy Mini Kit (QIAGEN), а потім зворотно транскрибували в кДНК за допомогою PrimeScript RT Reagent Kitwith gDNA Eraser (Takara Bio) згідно з інструкціями виробника. Рівні експресії мРНК аналізували за допомогою SYBRGreen PCR Master Mix і QuantStudio 12K Flex Real-TimePCR System (обидва від Thermo Fisher Scientific). Послідовності праймерів наведено в таблиці S1.
Імуноблоттинг проводили відповідно до стандартних процедур, як описано раніше (Denget ін., 2015; Ю та ін., 2006). Використовувалися наступні антитіла: METTL3 (номер за кат. 15073-1-AP; Proteintech), METTL14 (номер за кат. 26158-1-AP; Proteintech), YTHDF1 (номер за кат. 17479-1-AP) ; Proteintech), YTHDF2 (номер кат. RN123PW; MBL), YTHDF3 (номер кат..25537-1-AP; Proteintech), ALKBH5 (номер кат. ab195377; Abcam),FTO (номер кат. ab124892; Abcam), MDM2 (№ за кат. 33-7100; Invitrogen), TDP-43 (№ за кат. PA5-29949; Invitrogen) і -actin (№ за кат. {{20) }}Ig; Proteintech).
аналіз нокдауну siRNA
IL-2–expanded NK cells were transfected with Accell mouse Tardbp siRNA (cat. no. E-040078-00-0005; Dharmacon) or Mdm2 siRNA (cat. no. E-041098-00-0005; Dharmacon) using Accell delivery media (Dharmacon) according to the manufacturer's instructions in the presence of IL-15 (50 ng/ml). The Accell eGFP control pool was used as siRNA control. The transfection efficiency was >90%, як виміряно проточною цитометрією. Ефективність генного нокдауну визначали за допомогою КПЦР та імуноблоттингу. Через 3 дні після трансфекції апоптоз клітин і проліферацію аналізували за допомогою проточної цитометрії, як описано вище.
Репортерний аналіз люциферази
Область промотора Ythdf2 у діапазоні від –2,000 bp до +100 bp TSS була ампліфікована з мишачих NK-клітин і клонована в apGL4-Basic Luciferase Reporter Vector (Promega) для створення apGL{ {5}}Репортерна плазміда Ythdf2. Клітини HEK293T, придбані в ATCC, були котрансфіковані репортерними плазмідами pGL4-Ythdf2, а також плазмідами надекспресії STAT5a або STAT5b або безпорожнім вектором разом із репортерною плазмідою pRL-TK Renilla (Promega) для нормалізації ефективності трансфекції. Клітини збирали для лізису через 24 години після трансфекції, і люциферазна активність була кількісно визначена флуориметрично за допомогою Dual-Luciferase System (Promega). Послідовності праймерів для клонування промотора Ythdf2 і плазмід надекспресії STAT5a і STAT5b наведено в таблиці S1.
ЧІП аналізи
Дослідження ChIP проводили з використанням набору Pierce Magnetic ChIP Kit (номер по каталогу 26157; Thermo Fisher Scientific) відповідно до інструкцій виробника. Коротко кажучи, рівну кількість ананти-анти-фосфо-Stat5 (Tyr694, кат. № 9351; Cell Signaling Technologies) або відповідного контрольного нормального кролячого IgG окремо використовували для осадження зшитих ДНК-білкових комплексів, отриманих із 5 × 106 очищених первинних NK-клітин миші, які попередньо обробляли IL-15 (50 нг/мл) протягом 1 години. Після відновлення перехресного зшивання ДНК, імунопреципітована зазначеним антитілом, була перевірена за допомогою КПЦР. Послідовності всіх праймерів наведено в таблиці S1.
Дослідження цитотоксичності ex vivo
Ex vivo цитотоксичність NK-клітин оцінювали за допомогою стандартних аналізів 51Crrelease. Лінії клітин мишачої лімфоми RMA-S (MHC клас Ideficient) і RMA (MHC клас I достатній) клітини, подарунок Andre´Veillette (Університет Макгілла, Монреаль, Канада), були використані як клітини зірки. Мишей лікували внутрішньовенною ін'єкцією поліінозинової: поліцитидилової кислоти [полі (I: C); 200 мкг/миша] протягом 18 год. Полі(I:C)-активовані NK-клітини виділяли із селезінки за допомогою набору для виділення NK-клітин EasySepMouse (STEMCELL Technologies). Очищені клітини NK спільно культивували з клітинами-мішенями у співвідношенні 5:1, 2,5:1 та 1,25:1 у присутності IL-2 (50 ОД/мл).
m6A-послідовність
Очищені NK-клітини селезінки розмножували за допомогою IL-2 (1,000 Од/мл, кат. №. Масовий Ro 23-6019; Національний інститут раку) in vitro протягом 7 днів. Загальну РНК виділяли за допомогою реагенту TRIzol (Thermo FisherScientific) із 50 мільйонів IL-2-розширених NK-клітин. Поліаденільована РНК була додатково збагачена загальною РНК за допомогою набору для очищення мРНК Dynabeads (Invitrogen). Зразки мРНК були фрагментовані на фрагменти довжиною 100-nt за допомогою реагентів для фрагментації РНК (Invitrogen).
Фрагментовану мРНК (5 мкг мРНК) використовували для імунопреципітації m6A з використанням антитіла m6A (202003; Synaptic) відповідно до стандартного протоколу набору Magna MeRIP m6A (Merck Millipore). РНК було збагачено за допомогою RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research) для створення бібліотеки за допомогою набору KAPA RNA HyperPrep Kit (Roche). Секвенування було виконано в установі геноміки City of Hope на апараті Illumina HiSeq 2500 з режимом одноразового зчитування 50-bp. Зчитування секвенування були зіставлені з геномом миші за допомогою програмного забезпечення HISAT2 v101 (Kim et al., 2015).
Картовані зчитування імунопреципітації та бібліотеки вхідних даних були надані за допомогою пакета R exomePeak (Meng та ін., 2014). m6Apeaks були візуалізовані за допомогою програмного забезпечення Integrative Genomics Viewer (http://www.igv.org). Мотив зв'язування m6A був проаналізований MEME (https://meme-suite.org) і HOMER (http://homer.ucsd.edu/homer/motif). Викликані піки були анотовані шляхом перетину з архітектурою гена за допомогою Rpackage ChIPseeker (Yu et al., 2015).
StringTie was used to assess expression levels for mRNAs from input libraries by calculating the total exon fragments/mapped reads in millions × exon length in kb (Pertea et al., 2015). The differentially expressed mRNAs were selected with log2(fold change) >1 orlog2 (згортання змін)<−1 and P < 0.05 using the R package edgeR (Robinson et al., 2010).
YTHDF2 RIP-seq
50 мільйонів IL-2-розширених NK-клітин збирали та двічі промивали холодним PBS, а клітинний осад лізували 2 об’ємами буфера для лізису (10 мМ Hepes, pH 7,6, 150 мМ KCl, 2 мМ EDTA, 0,5% NP-40, 0,5 мМ дитіотреїтол, суміш інгібіторів протеази 1:100 [Thermo Fisher Scientific] та 400 ОД/мл інгібітора РНКази SUPERase-In [Thermo Fisher Scientific]).
Лізат інкубували на льоду протягом 5 хвилин і центрифугували протягом 15 хвилин, щоб очистити лізат. Одну десяту об'єму клітинного лізату зберігали як вхідний матеріал. Залишок клітинного лізату інкубували з 5 мкг анти-YTHDF2 (кат. № RN123PW; MBL), який з’єднали з білком A Magnetic Beads (кат. № 10001D; Invitrogen) при 4 градусах протягом 2 годин з легким обертанням. Після цього кульки промивали п’ять разів 1 мл крижаного промивного буфера (50 мМ HEPES, pH 7,6, 200 мМ NaCl, 2 мМ EDTA, 0,05% NP-40, 0,5 мМ дитіотреїтолу та 200 ОД/мл РНКази інгібітор).
Імунопреципітовані зразки піддавали розщепленню протеїназою K у промивних буферах, доповнених 1% SDS та 2 мг/мл протеїнази K (ThermoFisher Scientific), інкубували зі струшуванням при 1200 об/хв при 55 градусах протягом 1 години. Загальну РНК екстрагували як з вхідної, так і з імунопреципітованої РНК шляхом додавання 5 об’ємів реагенту TRIzol, а потім Direct-zol RNA Miniprep (Zymo Research).
Бібліотека кДНК була створена за допомогою набору KAPA RNA HyperPrep Kit (Roche) і секвенована на платформі Illumina HiSeq 2500. Пікові результати виклику з імунопреципітацією та вхідними бібліотеками були згенеровані пакетом R RIPSeeker (Li та ін., 2013). HOMER використовувався для пошуку мотивів розподілу даних у пікових областях. Викликані піки були анотовані шляхом перетину з архітектурою гена та транскрипту за допомогою ChIPpeakAnno (Zhu та ін., 2010).
аналіз стабільності мРНК
Очищені NK-клітини селезінки мишей Ythdf2ΔNK і Ythdf2WT культивували з IL-15 (50 нг/мл). Через 3 дні після культивування клітини обробляли актиноміцином D (5 мкг/мл, кат. № A9415; Sigma) протягом зазначеного часу. Клітини без обробки використовували через 0 годин. Клітини збирали в зазначений час, і загальну РНК екстрагували з клітин для КПЦР. Період напіврозпаду мРНК розраховували за допомогою методу, попередньо описаного Weng et al. (2018). Послідовності праймерів наведено в таблиці S1.
Онлайн аналіз бази даних
Ми використали онлайн-ресурс BioGPS (http://biogps.org) для аналізу тканиноспецифічної експресії Ythdf2. Набори РНК-seqdata були з GEO під номерами доступу. GSE106138, GSE113214 і GSE25672. Нормалізовані дані аналізу RNA-seq було експортовано, а z-показник експресії генів візуалізовано за допомогою функції Heatmap.2 у бібліотеці gplots Rlibrary
Статистика
Непарні t-тести Стьюдента (двосторонні) проводили за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism. Односторонній або двосторонній ANOVA проводили, коли порівнювали три або більше незалежних груп. Значення P були скориговані для багаторазового порівняння з використанням процедури Холма-Сідака. P < 0.05 вважалося значущим. *, P < {{10}}.05; **, P < 0,01; і ***, P <0,001.
Додаткові матеріали онлайн
На рис. S1 показано рівні білка YTHDF2 в імунних клітинах, включаючи клітини NK, у відповідь на стимуляцію IL-15, інфекцію MCMV і прогресування пухлини; покоління мишей зі специфічною для NK-клітин делецією Ythdf2. На рис. S2 показано титри вірусу в селезінці та печінці мишей, інфікованих MCMV, а також відсоток і абсолютну кількість NK-клітин Ly49H+ та/або Ly49D+ у мишей, інфікованих MCMV. На рис. S3 показано проліферацію, виживання, дозрівання та експресію активуючих і інгібіторних рецепторів NK-клітин мишей Ythdf2WT і Ythdf2ΔNK. На рис. S4 показано регуляцію експресії YTHDF2 за допомогою передачі сигналів IL-15-STAT5 та експресію компонентів рецепторів IL-15, шляху PI3K–AKT і шляху MEK–ERK у клітинах NK із Ythdf2WT та Ythdf2ΔNK миші. На рис. S5 показано аналізи RNA-seq, m6A-seq і RIP-seq на транскриптомі в клітинах NK. У таблиці S1 наведено праймери, використані в дослідженні.
Доступність даних
Дані RNA-seq, m6A-seq і RIP-seq були збережені в Національному центрі біотехнологічної інформації GEO під номером доступу. GSE174027. Решта даних, які підтверджують висновки цього дослідження, доступні у відповідних авторів за запитом.
Подяки
Цю роботу підтримали Національні інститути здоров’я (NS106170, AI129582, CA247550, CA163205, CA223400, CA068458 і CA210087), Товариство лейкемії та лімфоми (1364-19), Каліфорнійський інститут регенеративної медицини (DISC2COVID{{ 9}}), а також нагороду Breast Cancer Alliance 2021 Exceptional Project Award. Ця робота також була частково підтримана нагородою USDA (USDA/NIFA 2020-67017-30843).
Внесок авторів: С. Ма, Дж. Ю та М. А. Каліджурі задумали та розробили проект. С. Ма, Дж. Янь, Дж. Чжан і Дж. Ю проводив експерименти та/або аналізував дані. Z. Chen, L.-S.Wang, JC Sun і J. Chen надали реактиви та матеріальну підтримку. S. Ma, J. Yu, J. Chen і MA Caligiuri написали, рецензували та/або переглянули статтю. Усі автори обговорили результати та прокоментували рукопис.
Розкриття інформації: Дж. Чен повідомив про "інше" від Genovel BiotechCorp. за межами представленої роботи та є науковим засновником Genovel Biotech Corp. і науковим консультантом расової онкології. Ніяких інших розкриттів не повідомлялося.
Список літератури
1.Arase, H., ES Mocarski, AE Campbell, AB Hill, and LL Lanier. 2002. Пряме розпізнавання цитомегаловірусу шляхом активації та інгібування рецепторів NK-клітин. Наука. 296:1323-1326.
2. Аяла, Ю. М., Т. Містелі та Ф. Е. Баралле. 2008. TDP-43 регулює фосфорилювання білка ретинобластоми шляхом пригнічення експресії циклінзалежної кінази 6. Proc. Natl. акад. Sci. США. 105:3785-3789.
3. Барбієрі, І., К. Целепіс, Л. Пандолфіні, Дж. Ши, Г. Міллан-Замбрано, С. К. Робсон, ´D. Аспріс, В. Мігліорі, А. Дж. Банністер, Н. Хан та ін. 2017. Зв’язаний з промотором METTL3 підтримує мієлоїдний лейкоз шляхом m6A-залежного контролю трансляції. природа 552:126-131.
4. Бекнелл Б. і М. А. Каліджурі. 2005. Інтерлейкін-2, інтерлейкін-15 та їх роль у природних клітинах-кілерах людини. Adv. Immunol. 86:209–239.
5. Бертолі К., Дж. М. Скотхайм і Р. А. де Брюїн. 2013. Контроль транскрипції клітинного циклу під час G1 та S фаз. Нац. Преподобний мол. Cell Biol. 14:518–528.
6. Безман, Н. А., К. С. Кім, Дж. К. Сан, Г. Мін-Оо, Д. У. Хендрікс, Ю. Камімура, Д. А. Бест, А. В. Голдрат і Л. Л. Ланьє. Консорціум проекту імунологічного геному. 2012. Молекулярне визначення ідентичності та активації природних клітин-кілерів. Нац. Immunol. 13:1000-1009.
7. Карсон, WE, JG Giri, MJ Lindemann, ML Linett, M. Ahdieh, R. Paxton, D.Anderson, J. Eisenmann, K. Grabstein, and MA Caligiuri. 1994. Інтерлейкін (IL) 15 — це новий цитокін, який активує природні клітини-кілери людини через компоненти рецептора IL-2. J. Exp. Мед. 180:1395-1403.
8. Карсон, WE, TA Fehniger, S. Haldar, K. Eckhert, MJ Lindemann, CF Lai, CM Croce, H. Baumann і MA Caligiuri. 1997. Потенційна роль інтерлейкіну-15 в регуляції виживання природних клітин-кілерів людини.J. Clin. Інвестувати. 99:937-943.
9. Чан, К. Дж., М. Дж. Сміт і Л. Мартінет. 2014. Молекулярні механізми активації природних клітин-кілерів у відповідь на клітинний стрес. Cell DeathDiffer. 21:5–14.
10.Chen, X., J. Han, J. Chu, L. Zhang, J. Zhang, C. Chen, L. Chen, Y. Wang, H. Wang, L. Yi та ін. 2016. Комбінована терапія NK-клітинами EGFR-CAR та онколітичним вірусом простого герпесу 1 для метастазів раку молочної залози в мозок. Oncotarget. 7: 27764–27777.
For more information:1950477648nn@gmail.com
