Зчитувач РНК M6 A YTHDF2 контролює протипухлинний і противірусний імунітет NK-клітин. Частина 2

YTHDF2 необхідний для противірусної функції NK-клітин

Щоб визначити, чи впливає дефіцит Ythdf2 на противірусну активність NK-клітин, ми ввели 2,5 × 104 PFU MCMV мишам Ythdf2WT і мишам Ythdf2ΔNK.

Результати показали, що миші Ythdf2ΔNK були більш сприйнятливими до інфекції MCMV, як показано значною втратою ваги та підвищенням титрів вірусу в крові, селезінці та печінці порівняно з мишами Ythdf2WT (рис. 3, A і B; і рис. S2, A і B) .

Ми також спостерігали значне зниження відсотка та абсолютної кількості NK-клітин у селезінці та крові мишей Ythdf2ΔNK порівняно з мишами Ythdf2WT після інфікування (рис. 3, C і D; і рис. S2, C і D). Подальший аналіз показав, що NK-клітини мишей Ythdf2ΔNK мали значно нижчу експресію Ki67, ніж миші Ythdf2WT (рис. 3, E–G).

Проте життєздатність NK-клітин була подібною між мишами Ythdf2WT і мишами Ythdf2ΔNK, як показано за допомогою фарбування аннексином V (рис. S2 E). Ці дані вказують на те, що дефіцит YTHDF2 у клітинах NK призводить до дефекту клітинної проліферації, а не до виживання клітин під час вірусної інфекції. NK-клітини пригнічують інфекцію MCMV через активуючі рецептори Ly49H і Ly49D, і цей процес характеризується противірусною відповіддю, опосередкованою перфорином або IFN (Arase та ін., 2002; Лі та ін., 2009; Лох та ін., 2005; Орр). та ін., 2010; Sumaria та ін., 2009).

Ми виявили, що миші Ythdf2ΔNK значно зменшили кількість NK-клітин Ly49H+ і Ly49D+ у селезінці та крові порівняно з мишами Ythdf2WT після інфікування (рис. 3, H–J; і рис. S2, F–K).

Подальший аналіз показав, що хоча у відсотках лише клітини Ly49D+Ly49H+ показали різницю у мишей Ythdf2ΔNK порівняно з мишами Ythdf2WT, абсолютна кількість клітин Ly49D−Ly49H+ NK-клітин, Ly49D+Ly49H− NK-клітин та Ly49D+Ly49H+ NK-клітин у селезінки та крові було значно зменшено у мишей Ythdf2ΔNK порівняно з мишами Ythdf2WT після інфікування (рис. S2, L–W).

Наші дані свідчать про те, що контроль інфекції MCMV за допомогою YTHDF2, здається, в основному опосередковується Ly49D+Ly49H+ NK-клітинами. Продукція гранзиму B та IFN клітинами NK у мишей Ythdf2ΔNK була порівнянна з такою у мишей Ythdf2WT (рис. S2, X і Y).

Ми виявили значно знижене вироблення перфорину мишами Ythdf2ΔNK порівняно з мишами Ythdf2WT як у селезінці, так і в крові через 7 днів після зараження (рис. 3, K–M), що вказує на те, що YTHDF2 головним чином впливає на опосередковану сперфорином противірусну активність проти MCMV у клітинах NK. Ці дані припускають, що YTHDF2 має вирішальне значення для експансії NK-клітин і ефекторної функції під час інфекції MCMV.

YTHDF2 контролює гомеостаз NK-клітин і кінцеве дозрівання в стабільному стані

Наведені вище висновки про те, що дефіцит Ythdf2 у NK-клітинах посилює метастази пухлини та порушує здатність NK-клітин контролювати інфекцію MCMV, спонукали нас дослідити, чи потрібен YTHDF2 для підтримки NK-клітин у стабільному стані.

Як показано на рис. 4 A, частота та абсолютна кількість NK-клітин були значно знижені в периферичній крові, селезінці, печінці та легенях, але не в кістковому мозку (КМ) мишей Ythdf2ΔNK порівняно з мишами Ythdf2WT.

Однак не було значних змін між звичайним лімфоїдним попередником, пре-NK-клітинним попередником і очищеним NK-клітинним попередником (NKP) у BM (Fathman et al., 2011) між мишами Ythdf2WT і Ythdf2ΔNK (рис. S3 A), що вказує на те, що YTHDF2 може не впливати на ранній розвиток NK-клітин у нашій моделі.

Щоб дослідити потенційні механізми, відповідальні за зменшення кількості NK-клітин у мишей Ythdf2ΔNK, ми досліджували клітинну проліферацію, життєздатність і здатність до передачі NK-клітин після видалення Ythdf2 у стабільному стані. Відсоток проліферуючих NK-клітин був порівнянним у мишей Ythdf2WT і Ythdf2ΔNK, про що свідчить фарбування Ki67 (рис. S3 B).

Життєздатність NK-клітин також була еквівалентною між мишами Ythdf2WT і Ythdf2ΔNK, як показано за допомогою фарбування аннексином V (рис. S3 C). Щоб перевірити, чи впливає YTHDF2 на вихід NK-клітин з BM на периферію, мишам Ythdf2WT і Ythdf2ΔNK вводили внутрішньовенно антитіло проти CD45 для позначення імунних клітин і умертвляли через 2 хвилини, а їхні клітини BM аналізували.

Це дозволило нам кількісно визначити кількість NK-клітин у синусоїдальних і паренхіматозних ділянках кісткового мозку, що є показником переміщення NK-клітин із кісткового мозку в периферичну кров у стабільному стані (Leong et al., 2015). Результати показали значне зниження частоти CD45+ NK-клітин у мишей Ythdf2ΔNK порівняно з мишами Ythdf2WT у синусоїдах (рис. 4 B), що вказує на те, що дефіцит Ythdf2 погіршує вихід NK-клітин із BM у систему кровообігу in vivo .

Імунні клітини зазнають гомеостатичної проліферації під час лімфопенії, викликаної певними вірусними інфекціями або хіміотерапією (Sun et al., 2011). Хоча ми виявили, що YTHDF2 необхідний для проліферації NK-клітин у стабільному стані, ми спостерігали значне зниження проліферації клітин під час інфекції MCMV (рис. 3, E–G). Тому ми досліджували роль YTHDF2 у регулюванні гомеостатичної проліферації NK-клітин у лімфопенічних умовах in vivo.

Ми спільно перенесли однакову кількість NK-клітин селезінки від CD45.2 Ythdf2ΔNK мишей або конгенічних CD45.1 мишей до лімфоцит-дефіцитних Rag2-/-Il2rg-/- мишей. Результати показали, що більша частка NK-клітин була отримана від контрольних мишей CD45.1WT, ніж від мишей CD45.2 Ythdf2ΔNK на 3-й день після перенесення клітин (рис. S3 D).

Подальший аналіз продемонстрував, що зменшення кількості NK-клітин у мишей Ythdf2ΔNK було спричинене порушенням клітинної проліферації (рис. S3 E), але не клітинним апоптозом (рис. S3 F), що свідчить про те, що YTHDF2 стимулює гомеостатичну проліферацію NK-клітин in vivo за лімфопенічних умов.

Подальшу диференціацію мишачих NK-клітин можна класифікувати на незрілі (CD11b-CD27+), проміжні зрілі (CD11b+CD27+) і кінцеві зрілі (CD11b+CD27-) стадії на основі рівнів CD11b і CD27 ( Chiossone та ін., 2009; Geiger і Sun, 2016).

Ми виявили, що експресія Ythdf2 зростає з дозріванням і що CD11b−CD27+, CD11b+CD27+, CD11b+CD27− демонструють найнижчий, проміжний і найвищий рівні експресії Ythdf2 відповідно (рис. S3 G), вказуючи на те, що YTHDF2 може брати участь у дозріванні NK-клітин. Тому ми досліджували роль YTHDF2 у дозріванні NK-клітин, що визначається маркерами клітинної поверхні CD11b і CD27.

Ми виявили, що втрата Ythdf2 у NK-клітинах призвела до значного зниження частоти кінцевих зрілих NK-клітин та/або збільшення незрілих і проміжних зрілих NK-клітин у селезінці, печінці, легенях і крові, але не в BM (рис. 4 C і Рис. S3 H), що вказує на те, що YTHDF2 позитивно регулює термінальне дозрівання NK-клітин. Згідно з цими даними, рівні KLRG1, який є кінцевим маркером дозрівання NK-клітин, були значно нижчими у мишей Ythdf2ΔNK у селезінці, печінці та легенях, але не в BM порівняно з у мишей Ythdf2WT у відповідних органах або тканинах (рис. 4 D).

Щоб визначити, чи є зменшення кількості зрілих NK-клітин через дефіцит Ythdf2 властивим клітинам, ми створили химери у мишей Rag2−/−Il2rg−/− шляхом ін’єкції клітин BM мишей CD45.1 WT та CD45.2 Ythdf2ΔNK, змішаних у співвідношенні 1:1 співвідношення. Як показало проточна цитометрія через 8 тижнів після трансплантації, менша частка кінцевих зрілих NK-клітин була отримана з клітин CD45.2 Ythdf2ΔNK BM, ніж з контрольних клітин CD45.1 WT (рис. 4 E), що свідчить про те, що термінальне дозрівання NK-клітин контролюється YTHDF2 є внутрішньою клітиною.

Фактори транскрипції T-box Eomes і Tbet є критичними для дозрівання NK-клітин (Daussy et al., 2014; Gordon et al., 2012). Внутрішньоклітинне фарбування виявило значне зниження рівня білка Eomes у NK-клітинах мишей Ythdf2ΔNK порівняно з мишами Ythdf2WT (рис. S3 I). Крім того, ми виявили, що зниження рівня білка та мРНК Eomes конкретно відбувалося в кінцевих зрілих (CD11b+CD27−) NK-клітинах (рис. S3, J–L).

Однак, на відміну від Eomes, експресія Tbet була еквівалентною в клітинах NK між мишами Ythdf2ΔNK і Ythdf2WT (рис. S3, I і K), що вказує на те, що YTHDF2, можливо, регулює термінальне дозрівання клітин NK, націлюючись на Eomes.