Сучасний стан нейропротекції при вроджених вадах серця. Частина 1

Анотація:

Наявність ектопічної ДНК у цитоплазмі викликає запалення та загибель клітин. Широко повідомлялося, що витік ядерної ДНК у цитоплазму можна в основному відчути за допомогою циклічної GMP-AMP-синтази (cGAS).

ДНК — це молекула, яка визначає генетичну інформацію кожної людини і міститься в кожній нашій клітині. Останні дослідження показують, що ДНК може просочуватися в цитоплазму певними шляхами і впливати на нашу пам’ять.

Це явище часто зустрічається у літніх людей і людей з когнітивними порушеннями. Коли ДНК просочується в цитоплазму, це заважає нормальним функціям клітини та підвищує ризик втрати пам’яті та когнітивних розладів.

Однак ми не повинні почуватися пригніченими та безнадійними через це. Існує багато способів покращити пам’ять і когнітивні здібності, які допоможуть нам підтримувати здоров’я мозку.

По-перше, необхідно вести здоровий спосіб життя. Це включає в себе збалансоване харчування, достатній сон, помірні фізичні вправи та зменшення стресу. Ці практики сприяють здоров’ю мозку, тим самим запобігаючи витоку ДНК і покращуючи пам’ять.

По-друге, потрібна когнітивна підготовка. Це може включати математичні ігри, читання, навчання новим навичкам тощо. Ці дії можуть допомогти стимулювати мозок і сприяти нейрогенезу, щоб уникнути витоку ДНК.

Нарешті, зберігайте позитивний настрій. Емоційна нестабільність і надмірний стрес можуть спричинити зміни в хімії мозку, що сприяє витоку ДНК. Тому нам потрібно навчитися сприймати життєві труднощі позитивно та зберігати оптимістичний настрій.

Підводячи підсумок, хоча витік ДНК у цитоплазму може вплинути на пам’ять, ми можемо покращити здоров’я мозку, уникнути витоку ДНК і, зрештою, покращити нашу пам’ять, дотримуючись правильного способу життя, беручи участь у когнітивних тренінгах і зберігаючи позитивне мислення. Пам'ять і когнітивні здібності. Можна побачити, що нам потрібно покращити пам’ять, і Cistanche deserticola може значно покращити пам’ять, оскільки Cistanche deserticola є традиційним китайським лікарським матеріалом, який має багато унікальних ефектів, одним із яких є покращення пам’яті. Ефективність Cistanche deserticola пояснюється багатьма активними інгредієнтами, які він містить, включаючи дубильну кислоту, полісахариди, флавоноїдні глікозиди тощо. Ці інгредієнти можуть сприяти здоров’ю мозку різними шляхами.

Натисніть «Знай 10 способів покращити пам’ять».

Нещодавно ми повідомили, що отримана з мітохондрій цитоплазматична дволанцюгова ДНК (dsDNA), яка уникла лізосомальної деградації, викликає значну цитотоксичність у культивованих клітинах та in vivo. Передбачається, що цитоплазматична мітохондріальна ДНК бере участь у різних захворюваннях і розладах, і публікується все більше і більше робіт, які підтверджують це. З іншого боку, сучасний метод оцінки мітохондріальної ДНК у цитоплазмі може бути не кількісним.

Тут ми докладно представляємо метод оцінки ектопічних клітин мітохондріальної ДНК. Цей метод корисний у фундаментальних дослідженнях, а також у вивченні старіння, хвороби Паркінсона, хвороби Альцгеймера, серцевої недостатності, аутоімунних захворювань, раку та інших станів.

Ключові слова: ектопічна ДНК; мітохондріальна ДНК; мітохондріальний фактор транскрипції А (TFAM); хвороба Паркінсона.

1. Введення

ДНК містить важливу інформацію для виживання та успадкування, і її необхідно захистити від різних стресових факторів, включаючи окислювачі та мутагени. Еукаріотичні клітини містять мітохондрії, які виробляють енергію разом із великою кількістю активних форм кисню за допомогою аеробного дихання.

Таким чином, в еукаріотичній клітині ДНК існує в ядрі або мітохондріях, упакованих усередині ядерної або мітохондріальної мембрани відповідно. Проте ДНК може бути присутня в цитоплазмі за певних умов, наприклад під час вірусних або невірусних інфекцій [1– 4].

Навіть у деяких неінфекційних станах (наприклад, старіння або різні вікові розлади або рак) ДНК може просочуватися в цитоплазму з ядра або мітохондрій [5–7].

ДНК у цитоплазмі може бути запальною та токсичною для клітин. Широко повідомлялося, що витік ядерної ДНК у цитоплазму індукує запалення, цитотоксичність і секреторний фенотип, пов’язаний зі старінням (SASP), головним чином через циклічну GMP-AMP-синтазу (cGAS) - стимулятор генів інтерферону (STING) [ 5,6].

Нещодавно ми повідомили, що цитозольна дволанцюгова ДНК (dsDNA) мітохондріального походження, що виходить із лізосомальної деградації, як було показано, індукує цитотоксичність і нейродегенерацію в клітинних моделях хвороби Паркінсона [8]. Наявність або збільшення такої ектопічної ДНК часто вказували на репрезентативних мікроскопічних зображеннях і непрямих доказах, а не на зростанні самого витоку ДНК.

Очікується, що оцінка цієї ектопічної ДНК ставатиме все більш важливою не лише для базових досліджень, але й для досліджень старіння та інших захворювань, таких як хвороба Паркінсона, хвороба Альцгеймера, бічний аміотрофічний склероз, серцева недостатність, аутоімунні захворювання, діабет, неалкогольний стеатогепатит (НАСГ) і рак. Повідомляється, що шлях cGAS–STING є вирішальним не лише у старінні, але й у патогенезі цих захворювань [8–17].

Ймовірно, через окислювальні умови навколо мітохондрій і відсутність ефективної системи відновлення ДНК для мітохондріальної ДНК, мітохондріальна ДНК набагато більш сприйнятлива до мутацій або пошкоджень, ніж ядерна ДНК [18,19].

На відміну від ядерної ДНК, мітохондріальна ДНК існує в кількох копіях в одній клітині та синтезується за потреби. Тому мітохондріальна ДНК може мати набагато більше шансів потрапити в цитоплазму під час старіння або злоякісних захворювань, таких як вікові розлади, мітохондріальна дисфункція , або раки.

Виявлення та вимірювання такої цитоплазматичної мітохондріальної ДНК може бути важливим для розуміння патогенезу різних захворювань і старіння, а також може стати біомаркером і терапевтичною мішенню.

Ми розробили напівкількісний метод для оцінки ектопічної мітохондріальної ДНК, що просочується в цитоплазму, і тут ми детально описуємо цей метод. Ця стаття дає змогу об’єктивно оцінити витік мітохондріальної ДНК і є корисною при вивченні різних патологій захворювань.

2. Матеріали та методи

2.1. Клітинні лінії, лікування siRNA та кількісний ПЛР (кПЦР) аналіз

Клітини HeLa були отримані з клітин раку шийки матки пацієнтки (ATCC, CCL-2). Клітини HeLa культивували при 37 ◦C під 5% CO2 у модифікованому Eagle Medium Dulbecco (DMEM) (Nacalai Tesque, Кіото, Японія) з додаванням 10% фетальної бичачої сироватки (FBS) (Biowest, Nuaillé, Франція) та розчину пеніцилін-стрептоміцину ( 100 одиниць/мл пеніциліну G і 100 мкг/мл стрептоміцину сульфату, Вако, Осака, Японія).

За день до трансфекції клітини HeLa висівали на чашки з щільністю 600 клітин/мкл. Експресія цікавих генів була приглушена в клітинах HeLa за допомогою Stealth RNAi siRNA (мітохондріальний транскрипційний фактор A, TFAM: HSS144251, глюкоцереброзидаза, GBA: HSS178140, Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA) у реагенті для трансфекції Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) згідно з інструкції виробника (кінцева концентрація РНК 10 нМ).

Через три дні після нокдауну siRNA загальну клітинну РНК виділяли за допомогою TRIzolreagent відповідно до інструкцій виробника (Thermo Fisher Scientific). Шаблони кДНК синтезували з очищеної РНК за допомогою набору ProtoScript II First StrandcDNA Synthesis Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) з праймерами оліго (dT)20. qPCR проводили з використанням TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio, Kusatsu) , Японія) і проаналізовано в Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Takara Bio). У цьому дослідженні використовували праймери GBA (TGCTGCTCAACATCCTTGCC), GBA (TAGGTGCGGATGGAGAAGTCAC), TFAM (GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC), TFAM (GCATCTGGTTCTGAGCTTTA), гліцеральдегід{1}}фосфатдегідрогеназу (GAPDH) (CAGCCTCAAGATCATC). AGCA) і GAPDH реверс (TGTGGTCATGAGTCCTTCCA).

Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism версії 9.3.1 (програмне забезпечення GraphPad, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Для порівняння середніх арифметичних між двома групами використовували двосторонній t-критерій Стьюдента. Дані представлені як середні та ± стандартні помилки середніх.

2.2. Імунофлуоресцентне виявлення ектопічної мітохондріальної ДНК та аналіз зображення

За день до трансфекції клітини HeLa висівали з щільністю 600 клітин/мкл. Експресію цікавих генів припиняли в клітинах HeLa за допомогою Stealth RNAi miRNA (Thermo Fisher Scientific) у реагенті для трансфекції Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) відповідно до інструкції виробника (кінцева концентрація РНК 10 нМ).

Через три дні після нокдауну siRNA клітини піддавали імунофлуоресцентному фарбуванню. Для виявлення мітохондріальної ДНК антитіла до dsDNA (Abcam, Кембридж, Великобританія, клон 35I9, кат. № ab27156, RRID: AB_470907 або EMD Millipore, Billerica, MA, США, клон AC-30-10 , Cat# CBL186, RRID: AB_11213573) продемонстрував краще співвідношення сигнал/шум, ніж Hoechst 33258, DAPI або Picogreen. Тут ми об’єднали три первинні антитіла: антитіла до dsDNA (35I9 ДНК) (Abcam, кат. № ab27156, RRID: AB_470907), анти-гістонові антитіла H2B (Abcam, кат. № ab134211) і антитепло- антитіло проти шокового білка-60 (Hsp60) (Abcam, кат. № ab46798, RRID: AB_881444).

Можна вибрати інші антитіла або флуоресцентно позначити гістоном, або альтернативно можна використовувати Hsp60, але необхідно оптимізувати умови потрійного фарбування для кожної комбінації.

Клітини двічі промивали фосфатно-сольовим буфером (PBS) і фіксували охолодженим метанолом протягом 10 хв при 4 ◦C. Крім того, для фіксації можна використовувати 4% параформальдегід (PFA), але фонові сигнали здаються набагато більше у зразках, фіксованих PFA. Після фіксації клітини тричі промивали забуференим фосфатом фізіологічним розчином з Tween 20 (PBST) по 5 хвилин кожен. Клітини пермеабілізували PBS, що містить 0,2% (мас./об.) Triton X-100 протягом 10 хв.

Після триразового промивання PBST протягом 5 хвилин кожен раз клітини інкубували з 2% (w/v) бичачого сироваткового альбуміну (BSA) у PBST протягом 30 хвилин. Клітини інкубували з єдиним первинним антитілом, антитілом проти гістону H2B (1/400, Abcam, кат. № ab134211), розведеним у 2% (мас./об.) BSA у PBST O/N при 4 ◦C. Після триразового промивання PBST протягом 5 хв кожного разу клітини інкубували з Alexa Fluor 488-AffiniPure Donkey анти-Chicken IgY(IgG) (H+L) (1/200, Wako, Cat# {{17) }}), розведений у 2% (w/v) BSA у PBST протягом 1 години при кімнатній температурі (RT).

Після триразового промивання протягом 5 хвилин кожного разу PBST клітини інкубували з первинними антитілами та антитілами до dsDNA (35I9 ДНК) (1/800, Abcam, Cat # ab27156, RRID: AB_470907) і анти -Hsp60 антитіла (1/400, Abcam, Cat # ab46798, RRID: AB_881444), розведені в 2% (w/v) BSA в PBST, наносили на 1 годину при кімнатній температурі або на ніч (O/N) при 4◦C.

Після триразового промивання PBST протягом 5 хвилин кожного разу клітини інкубували з високоперехресно адсорбованими Alexa Fluor 680-кон’югованими анти-кролячими IgG(H+L) (1/200, Thermo Fisher Scientific, кат. № A10043). , RRID: AB_2534018) ​​і Donkeyanti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594) (1/200, Abcam Cat# ab150108, RRID: AB_2732073), розведені в 2% (w/v) BSA в PBST протягом 1 години при кімнатній температурі.

Клітини тричі промивали PBST протягом 5 хвилин кожен раз, і зразок аналізували за допомогою конфокального мікроскопа A1R+ (Nikon, Токіо, Японія).

For more information:1950477648nn@gmail.com