Сучасний стан нейропротекції при вроджених вадах серця. Частина 3
Mar 08, 2024
3.2. Напівкількісна оцінка ектопічної мітохондріальної ДНК
Зображення фарбування Hsp60 (мітохондріальний матрикс) і фарбування гістоном-H2B (ядерний маркер) були вилучені із зображень фарбування дцДНК. Потім за допомогою функції «AdjustThreshold» програмного забезпечення lmage] (Національний інститут охорони здоров’я) зображення були двійкові.
Мітохондрії — це енергетичні фабрики в клітинах, відповідальні за синтез АТФ для забезпечення необхідної клітинам енергії. Мітохондріальний матрикс — це внутрішня рідина мітохондрій, яка містить різноманітні ферменти та іони та є ключовим місцем для різних біохімічних реакцій мітохондрій. Пам'ять є однією з найважливіших когнітивних здібностей людини. Хоча це може здатися непов’язаним, вони тісно пов’язані.
Дослідження показують взаємодію між мітохондріальним матриксом і пам’яттю. Ферменти та іони в мітохондріальному матриксі можуть безпосередньо впливати на збудливість нейронів, регулюючи енергетичний метаболізм і стан іонних каналів у нейрональних клітинах, таким чином впливаючи на пам’ять. Крім того, у мітохондріальному матриксі є різноманітні сигнальні молекули, які можуть передаватися до наступних нейронів через аксони та синапси нейронів, впливаючи на ефективність передачі сигналу нейронів, таким чином впливаючи на формування та консолідацію пам’яті.
При цьому діяльність пам'яті безпосередньо впливає і на стан мітохондріального матриксу. Діяльність пам’яті збільшить споживання енергії нейронами та сприятиме окислювально-відновній реакції в мітохондріальному матриксі, тим самим впливаючи на метаболічний рівень мітохондрій та внутрішньоклітинний іонний баланс, додатково впливаючи на збудливість та ефективність передачі сигналу нейронів.
Тому підтримка хорошого здоров’я мітохондрій має вирішальне значення для підтримки хорошої функції пам’яті. Дотримуючись хороших життєвих звичок, таких як регулярне харчування, помірні фізичні вправи, достатній сон тощо, ви можете допомогти зберегти здоров’я мітохондріального матриксу. Крім того, функція пам’яті також може бути посилена за допомогою відповідного фармацевтичного втручання для стимулювання біохімічних реакцій і передачі сигналів у мітохондріальному матриксі.
У повсякденному житті ми можемо тренувати пам’ять багатьма способами, наприклад читанням, навчанням, мисленням, іграми тощо. У той же час ми також повинні приділяти увагу підтримці доброго здоров’я, щоб краще підтримувати здоров’я мітохондріальної матриці. Я вірю, що завдяки цим зусиллям ми, безумовно, матимемо кращу пам’ять і краще справлятимемося з різноманітними викликами в житті та роботі. Видно, що нам потрібно покращити пам’ять, і Cistanche deserticola може значно покращити пам’ять, оскільки Cistanche deserticola також може регулювати баланс нейромедіаторів, наприклад підвищувати рівень ацетилхоліну та факторів росту. Ці речовини дуже важливі для пам'яті та навчання. Крім того, Cistanche deserticola також може покращити кровообіг і сприяти доставці кисню, що може гарантувати, що мозок отримує достатню кількість поживних речовин і енергії, тим самим покращуючи життєздатність і витривалість мозку.
Клацніть знати добавки для покращення пам’яті
Ми вибрали точки dsDNA розміром від 2 до 20 мкм' (округлість 0.1-1.0) за допомогою функції «Аналіз-Аналіз частинок». якщо необхідно, оригінальні зображення досліджувалися для остаточного підрахунку. Якби сигнал гістону H2B був малим. потім віднімаються зображення показали структури, схожі на пончики.
Вони являють собою цитозольну дцДНК ядерного походження і повинні бути виключені з числа цитозольних дцДНК мітохондріального походження. Діапазон розмірів можна змінювати відповідно до типу клітин або походження гістологічних зразків. На малюнку lE показано приклад підрахунку ектопічної мітохондріальної ДНК
точки за допомогою 1B D.
Альтернативно, зображення фарбування Hsp60 віднімали від зображень фарбування дцДНК. Потім кількість точок дцДНК підраховували за допомогою функцій «Налаштування порогу «Аналіз-аналіз частинок». Згодом точки дцДНК без сигналу гістону H2B підраховували шляхом прямого спостереження. Останній метод підходить, коли зображення гістону H2B показують низьке відношення сигнал/шум.
Загалом цей метод може чітко показати ектопічну мітохондріальну ДНК, що просочується в цитоплазму, і дозволяє об’єктивно та статистично оцінити таку ектопічну мітохондріальну ДНК у клітинах.
4. Обговорення
У нашому дослідженні ми розробили метод, який дозволяє підраховувати цитоплазматичну мітохондріальну ДНК. Повідомлялося про виявлення цитоплазматичної мітохондріальної ДНК за допомогою методів імунофлуоресценції, але в більшості випадків ці методи не були кількісними для оцінки цитоплазматичної мітохондріальної ДНК [15,25]. В іншому дослідженні була проведена краплинна ПЛР для кількісного визначення циркулюючої мітохондріальної ДНК [9].
нещодавно Sato et al. [26,27] опублікували чудовий протокол для оцінки цитоплазматичної ДНК за допомогою імунофлуоресцентної мікроскопії з використанням антитіл Lamin B1 (LMNB1) як маркера ядерної структури та субодиниці 4 цитохром-с-оксидази (COX4) як маркера мітохондріальної структури. Цей протокол здається дуже корисним для кількісного визначення цитоплазматичної дцДНК ядерного походження.
Однак, коли ми спробували визначити маркери ЦОГ4 або інші мітохондріальні мембрани, включаючи внутрішні та зовнішні маркери, було дуже важко точно відрізнити цитоплазму від мітохондрій.
Наприклад, якщо ми спостерігали кільцеві сигнали за допомогою маркера мітохондріальної мембрани та спостерігали сигнали дцДНК всередині, то ця дцДНК могла б представляти або мітохондріальну ДНК всередині кільцевих мітохондрій (нормальна), або цитоплазматичну мітохондріальну ДНК поза мітохондріями, схожими на бублик (ектопічна). Таким чином, ми використовували Hsp60 як маркер, що позначає їхмітохондріальний матрикс, щоб оцінити ектопічну мітохондріальну ДНК у цитоплазмі.
Як описано в нещодавньому огляді [23], існує багато різних типів цитоплазматичної ДНК ядерного походження, і більшість із них є позитивними щодо маркерів гістонів. Через обмеження комбінації антитіл, що використовуються для потрійного фарбування, ми використовували гістон H2Bas як маркер гістонів.
Однак, якщо це обмеження буде усунено, H2AX може бути кращим маркером для цитоплазматичної дцДНК ядерного походження. Гістон-H2B-негативна цитоплазматична дцДНК рідко спостерігалася в контрольних клітинах HeLa, використаних у цьому дослідженні, але така дцДНК ядерного походження може бути присутньою, якщо використовуються інші клітинні лінії або умови.
Гібридизація in situ мітохондріальної ДНК, використана в нашій недавній статті, підходить для якісної оцінки, але може бути важко використовувати гібридизацію in situ для кількісної оцінки [8].
Гібридизація in situ піддає зразок дії високих температур, що може призвести до деформації або шуму деяких частин зразка. З іншого боку, імуноцитохімічний метод, представлений у цій статті, може отримувати сигнали з низьким фоновим шумом. У нашій нещодавній роботі ми показали, що мітохондріальна ДНК витікає в цитоплазму, токсичну для клітин людини та рибок даніо. клітини. Ми також спостерігали, що кількість цитозольних мітохондріальних ДНК була збільшена в посмертних тканинах мозку пацієнтів із хворобою Паркінсона [8].
Ці рядки доказів свідчать про те, що підвищена кількість ектопічної мітохондріальної ДНК, яка виділяється з мітохондрій, може викликати гостре та хронічне запалення, що призводить до різних захворювань, включаючи хворобу Паркінсона та серцеву недостатність; таким чином, посилення деградації цитозольного ДНК або інгібування його сенсорів може бути потенційною терапевтичною мішенню для цих захворювань [8,28].
Метод, представлений у цій статті для кількісної оцінки ектопічної мітохондріальної ДНК, є важливим інструментом для подальших досліджень у цій галузі.
Авторські внески: HM і MTH сформулювали гіпотези, розробили більшість експериментів, провели експерименти, проаналізували дані та написали рукопис. Н.М. проводив експерименти, пов'язані з культивуванням клітин. Усі автори прочитали та погодилися з опублікованою версією рукопису.
Фінансування: Ця робота була підтримана грантами AMED (номер гранту JP21gm6110028 та JP19dm0107154 (HM)), Наукової фундації Такеда (HM), JSPS KAKENHI (номер гранту JP14516799 (HM), JP 16690735 (HM) та JP 17925674 (HM) ), JST (Moonshot R&D; номер гранту JPMJMS2024 (HM)) і Grants-in-Aid від TBRF (номер гранту TBRF-RF 21-135 (HM)).
Заява про доступність даних: дані та інструменти, описані в цьому рукописі, доступні за запитом.
Подяка. Ми висловлюємо подяку Сінано Кобаясі за участь у корисних обговореннях і постійну підтримку. Ми висловлюємо подяку Токійському фонду біохімічних досліджень (TBRF) за надання постдокторської стипендії для іноземних дослідників MH (TBRF-RF 21-135).
Конфлікт інтересів: автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів.
Список літератури
1. Лі, XD; Ву, Дж.; Гао, Д.; Ван, Х.; Сонце, Л.; Chen, ZJ Основна роль сигналізації cGAS-cGAMP у противірусному захисті та імуноад'ювантних ефектах. Наука 2013, 341, 1390–1394. [CrossRef] [PubMed]
2. Ансарі, М.А.; Датта, С.; Veettil, MV; Дутта, Д.; Ікбал, Дж.; Кумар, Б.; Рой, А.; Чікоті, Л.; Сінгх, В.В.; Chandran, B. Індуковане розпізнаванням генома герпесу ацетилювання ядерного IFI16 має важливе значення для його цитоплазматичної транслокації, реакцій запалення та IFN. PLoS Pathog. 2015, 11, e1005019. [CrossRef] [PubMed]
3. Орцаллі, MH; Брукема Н.М.; Diner, BA; Генкс, округ Колумбія; Елде, Північна Кароліна; Крістеа І.М.; Knipe, DM cGAS-опосередкована стабілізація IFI16 сприяє вродженій передачі сигналів під час інфекції вірусу простого герпесу. Proc. Natl. акад. наук. США 2015, 112, E1773–E1781 [CrossRef] [PubMed]
4. Вудворд, Дж. Дж.; Явароне, AT; Portnoy, DA c-di-AMP, що секретується внутрішньоклітинною Listeria monocytogenes, активує відповідь інтерферону типу хазяїна. Наука 2010, 328, 1703–1705. [CrossRef] [PubMed]
5. Доу, З.; Гош, К.; Візіолі, М.Г.; Чжу, Дж.; Сен, П.; Wangensteen, KJ; Сіміті, Дж.; Лан, Ю.; Лін, Ю.; Чжоу, З.; та ін. Цитоплазматичний хроматин викликає запалення при старінні та раку. Nature 2017, 550, 402–406. [CrossRef]
6. Такахаші, А.; Лу, Т.; Окада, Р.; Камачі, Ф.; Ватанабе, Ю.; Вакіта, М.; Ватанабе, С.; Кавамото, С.; Міята, К.; Перукарня Г.Н.; et al. Пониження регуляції цитоплазматичних ДНКаз пов'язане з накопиченням цитоплазматичної ДНК і SASP у старіючих клітинах. Нац.комун. 2018, 9, 1249. [CrossRef]
7. МакАртур К.; Уайтхед, Л.В.; Хаддлстон, Дж.М.; Лі, Л.; Падман, Б.С.; Оорсхот, В.; Geoghegan, ND; Чаппаз, С.; Девідсон, С.; Чин, Г. С.; та ін. Макропори BAK/BAX сприяють грижі мітохондрій і витоку мтДНК під час апоптозу. Наука 2018, 359, eaao6047. [CrossRef]
8. Мацуї, Х.; Іто, Дж.; Мацуї, Н.; Уечі, Т.; Онодера, О.; Какіта, А. Цитозольна дцДНК мітохондріального походження індукує цитотоксичність і нейродегенерацію в клітинних моделях хвороби Паркінсона та рибок даніо. Нац. Комун. 2021, 12, 3101. [CrossRef]
9. Слітер Д.А.; Мартінес, Дж.; Хао, Л.; Чень, X.; Сонце, Н.; Тара, Д.; Фішер Т.Д.; Бурман, JL; Лі, Ю.; Чжан, З.; та ін. Parkin і PINK1 пом'якшують запалення, викликане STING. Nature 2018, 561, 258–262. [CrossRef]
10. Хоу, Ю.; Вей, Ю.; Лаутруп, С.; Ян, Б.; Ван, Ю.; Кордоньє, С.; Маттсон, депутат; Крото, DL; Bohr, VA Додавання NAD(+) зменшує нейрозапалення та старіння клітин у моделі трансгенної миші з хворобою Альцгеймера за допомогою cGAS-STING. Proc. Нац.акад. наук. США 2021, 118, e2011226118.
For more information:1950477648nn@gmail.com
