Орієнтація на лактатдегідрогеназу А з катехіном ресенсибілізує ракові клітини шлунка SNU620/5FU до 5-фторурацилу Частина 1

Будь ласка, зв'яжітьсяoscar.xiao@wecistanche.comдля отримання додаткової інформації

Абстрактний:Стійкість до протипухлинних терапевтичних засобів виникає практично при кожному типі раку і стає серйозною складністю в лікуванні раку. Хоча 5-фторурацил (5ФУ) є вибором протипухлинної терапії раку шлунка в першій лінії, його ефективність обмежена через резистентність до ліків. Останнім часом змінений метаболізм раку, включаючи ефект Варбурга, перевагу гліколізу, а не окисного фосфорилювання для виробництва енергії, був прийнятий як ключовий механізм, що регулює стійкість до хіміотерапії. Таким чином, нами досліджено детальний механізм та можливу корисність антигліколітичних засобів при пом'якшенні резистентності до 5ФУ з використанням встановлених ракових клітинних ліній шлунка, СНУ620 та СНУ620/5ФУ. SNU620/5FU, ракова клітина шлунка, що має стійкість до 5ФУ, показала набагато вищу продукцію лактату та експресіюферменти, пов'язані з гліколізом, наприклад, лактатдегідрогеназа А(ЛДГК), ніж батьківські клітини SNU620. Щоб обмежити гліколіз, ми розглянули катехін та його похідні, які відоміпротизапальну,і протипухлинні натуральні продукти, оскільки раніше повідомлялося про епігалокатехін галлат як про супресора експресії ЛДГК. Катехін, найпростіше з'єднання серед них, надавав найвищий інгібуючу дію на вироблення лактату і активність ЛДГК. Крім того, комбінація 5FU і катехіну показала додаткову цитотоксичність і індукований реактивний кисневий вид (АФК) - опосередкований апоптоз в клітинах СНУ620/5ФУ. Таким чином, виходячи з цих результатів, ми пропонуємо катехін як кандидата на розробку нового ад'ювантного препарату, який знижує хемористентність до 5ФУ, обмежуючи ЛДХА.

Ключові слова:5-фторурацил;химорезистенція;гліколіз,;лактатдегідрогеназа; катехін

Будь ласка, натисніть тут, щоб дізнатися більше

1. Вступ

Значний прогрес був досягнутий у лікуванні раку шлунка хірургічною резекцією первинної пухлини та комбінованої хіміотерапії на основі 5-фторурацилу (5ФУ), такої як епірубіцин, цисплатин, а також фторурацил та доцетаксел, оксаліплатин та 5ФУ[1,21 На сьогоднішній день 5FU, аналог урацилу, який блокує синтез ДНК шляхом інгібування тимідилатсинтази [3], залишається загальновживаним хіміотерапевтичним препаратом для лікування раку шлунка [1, А4]. Однак клінічна ефективність хіміотерапії була незадовільною через рецидив первинного або метастатичного раку, пов'язаного з лікарською стійкістю [1,5].

Цистанче може підвищити імунітет

Кілька клітинних процесів розглядаються як ключові механізми, що лежать в основі хеморезистентності, включаючи активацію або інактивацію наркотиків, ремонтну техніку пошкодження ДНК, модифікації в лікарських мішенях, інактивацію апоптотичних шляхів і підвищену аутофагію [6,7]. Рак неоднорідний і різні види раку використовують як гліколіз, так і окислювальне фосфорилювання для енергетичного обміну [8]. Однак метаболічне перепрограмування, особливо аномальний аеробний гліколіз, було повідомлено як ключовий гравець у розвитку резистентності до хіміотерапевтичних препаратів, в тому числі до 5ФУ, при раку шлунка [9]. Лактатдегідрогеназа А (ЛДГГ) і піруватдегідрогеназа кінази (PDK) відомі як ключові регулятори аеробного гліколізу, що виробляють лактат з пірувату[10,11]. Комбінація дихлорацетату, встановленого інгібітора ПДК, відновлює чутливість до 5ФУ [12]. Крім того, LDHA, ключовий фермент, що каталізує перетворення пірувату в лактат, був повідомлений як потенційна мішень для лікування раку шлунка [13,14]. Нокдаун експресії ЛДГК в ракових клітинах пригнічує пухлиногенність за рахунок підвищення мітохондріального дихання і зниження життєздатності клітин [15]. Кілька інгібіторів ЛДГ, таких як FX11, PSTMB і GSK 2837808A, знижують рівень АТФ і генерують окислювальний стрес, і, нарешті, викликають апоптотичну загибель клітин [16-18]. Хоча дослідження продемонструвало, що інгібування ЛДГК мікроРНК-34а відновило стійкість до 5ФУ при раку товстої кишки [19], жодне попереднє дослідження не повідомляло про вплив генетичних або фармакологічних інгібіторів ЛДГ на хеморезистентність.

Поліфеноли зеленого чаю, включаючи катехін (СА), епікатехін (ЕК), галокатехін (ГК), епігалокатехін(EGC), епікатехін-3-галлат (ЕКГ) та епігалокатехін-3-галлат (EGCG), сприяють здоров'ю людини, запобігаючи та лікуючи кілька захворювань, включаючи запалення, діабет, серцево-судинні захворювання та злоякісний рак [20,21]. Серед поліфенолів EGCG підсилює хемочутливість 5FU при колоректальному раку і гепатоцелюлярних клітинах карциноми, активуючи шляхи AMPK і обмежуючи стовбуровість раку [22,23]. Крім того, повідомлялося, що EGCG інгібує ЛДГК, репресуючи його експресію в ракових клітинах молочної залози та підшлункової залози [24,25].

У цьому дослідженні ми висунули гіпотезу, що CA може бути кандидатом на ад'ювантний препарат для зниження резистентності до 5FU в ракових клітинах шлунка. Було досліджено, що інгібуюча дія СА та/або її поєднання з 5ФУ на активність ЛДГК тим самим індукувала мітохондріальні реактивні види кисню (АФК) та апоптотичну загибель клітин у 5ФУ-резистентних клітинах.

2. Результати

2.1. Гліколітичні характеристики 5ФУ-резистентних клітин

Посилена проліферація є характеристикою хеморезистентності, включаючи 5ФУ-резистентні ракові клітини [26,27]. По-перше, ми підтвердили стійкість до 5ФУ та довгострокові темпи зростання осередків СНУ620 та СНУ620/5ФУ. Коли ці клітини культивувалися із зазначеними концентраціями 5FU протягом 48 год, розрахункова доза, що викликала 50% інгібування росту (Gl50)у клітинах СНУ620/5ФУ (100,63 uM), була набагато вищою, ніж та, що викликала ГІСо в його батьківських клітинах СНУ620 (28,88 мкМ)(Рисунок 1А та Додатковий рисунок S1). Крім того, темпи зростання клітин СНУ620/5ФУ були швидшими, ніж у клітин СНУ620 (рис. 1В та додатковий рисунок S2). Оскільки хеморезистентність і швидкозростаючі характеристики могли бути пов'язані з підвищеними гліколітичними властивостями в ракових клітинах шлунка [28], швидкості позаклітинного закислення (ECAR) і норми споживання кисню (OCR) вимірювалися в обох клітинах в присутності оксамату, відомого інгібітора гліколізу, або ні. Результати показали, що клітини СНУ620/5ФУ значно виділяють більше лактату, ніж ті, що виділяються клітинами СНУ620, і згодом підкислюють культуральне середовище (рис. 1С і додатковий рисунок S3). Однак між цими клітинами не спостерігалося суттєвої зміни розпізнавання (рис. 1Д). Вимірювалися рівні експресії мРНК і білків ЛДГК. Експресія LDHA була вищою в клітинах SNU620/5FU, ніж у клітинах SNU620 (рис. 1E, F). Далі ми дослідили рівні мРНК та експресії білків ізотипів PDK і виявили, що рівні PDK2 та PDK3 були вищими у клітинах SNU620/5FU, ніж у клітинах СНУ620 (Додатковий рисунок S4A, B). Також було оцінено фосфорилювання субодиниці Е1α піруватдегідрогенази (PDHA1), яка була збільшена за допомогою PDK, і було виявлено, що вона вища в клітинах СНУ620/5ФУ, ніж у клітинах СНУ620 (Додатковий рисунок S4C). Крім того, ми використовували оксамат як інгібітор ЛДГК для подолання резистентності до 5ФУ в клітинах СНУ620/5ФУ. Ця сполука пригнічувала ріст клітин як у клітинах SNU620, так і в SNU620/5FU (додатковий рисунок S5). Крім того, лікування оксаматом і 5ФУ пригнічує ріст клітин, порівняно з індивідуальним лікуванням клітинами оксамату або 5ФУЇну СНУ620/5ФУ (рис. 1Г). Ці дані свідчать про те, що клітини SNU620/5FU з високою експрес-ЛОМК та інгібування активності ЛДГК можуть подолати стійкість клітин СНУ/5ФУ до 5ФУ.

Малюнок 1. Згідно з результатами, 5-фторурацилові (5ФУ)-резистентні клітини мають підвищену гліколітичну характеристику:(А)клітини СНУ620 та СНУ620/5ФУ оброблялися зазначеними концентраціями 5ФУ протягом 48 год. Життєздатність цих клітин оцінювалася за допомогою аналізу MTT;(B)рівні росту клітин SNU620 та SNU620/5FU вимірювалися щодня протягом 4 днів за допомогою аналізу MTT;(C,D)SNU620 та SNU620/5FU клітини оброблялися оксаматом (5mM) або ні протягом 24 годин, а значення ECAR та OCR оцінювалися аналізатором Seahorse XF;(E, F) вирази ЛДГА в клітинах SNU620 та SNU620/5FU були виявлені за допомогою qRT-ПЛР та західного блотового аналізу; (G) Клітини SNU620 та SNU620/5FU оброблялися оксаматом (25 мМ) та/або 5ФУ(10 мкМ) протягом 48 год. Результати відображаються як середні ± SEM.**p<0.01><><><0.01，and ##=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" ecar,="" extracellular="" acidification="" rates;="" ocr,="" oxygen="" consumption="" rates;="" ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

2.2. ЦА пригнічує діяльність ЛДХА

Виробництво лактату аналізувалося з ЦА та його похідними, включаючи EC, GC, EGC та EGCG, у клітинах SNU620/5FU. У порівнянні з цими похідними, СА знижувала вироблення лактату ефективніше (рис. 2А). Крім того, in vitro, активність ЛДГК, як скажімо, була підтверджена, і CA показала сильніший інгібуючий вплив на активність ЛДГК, ніж у її похідних (рис. 2В). Інгібуючі ефекти СА на активність in vitro LDHA і LDHB вимірювалися дозозалежним способом. ЦА інгібувала активність ЛДГК, не впливаючи на активність ЛДГБ (рис. 2С, D). Крім того, активність ЛДГГ та ЛДХБ вимірювалися за допомогою EGCG, який, як відомо, інгібує активність ЛДГК, і було виявлено, що дозазалежно знижується (додатковий рисунок S6A, B). Крім того, внутрішньоклітинні заходи ЛДГГ та ЛДХБ оцінювалися із зазначеними концентраціями СА в клітинах СНУ620/5ФУ. ЦА інгібувала активність ЛДГК дозованозалежним способом результатів in vitro, але не активності ЛДХБ (рис. 2Е, F). Рівні експресії білків p-PDHA1, PDK2, PDK3 та LDHA також вимірювалися в клітинах SNU620/5FU після лікування CA (Додатковий рисунок S7), і ми спостерігали, що вони не постраждали від цього лікування. Ці результати свідчать про те, що CA регулює діяльність ЛДГК, не впливаючи на її вираження.

2.3. Спосіб дії інгібування ЛДГГ ЦА

Для аналізу механізму інгібування активності ЛДГК на СА та її похідних проведено молекулярне моделювання зв'язуючої взаємодії між рекомбінантною ЛДГК людини та СА (рис. 3А,В). Результати показали, що CA може взаємодіяти із залишками T94, A95, Q99, R105, S136, R168, H192 і T247 ЛДХА. Серед них R105, S136 і R168 мають вирішальне значення для зв'язування субстрату (пірувату). Таким чином, ми припускали, що ЦА може заважати ділянкам зв'язування субстрату. Навпаки, EGCG прив'язаний до LDHA через інший сайт. Для подальшої перевірки способу дії інгібування ЛДГ ЦА були підтверджені ділянки Міхаеліса-Ментена і Ліневейвера-Берка різними концентраціями пірувату і СА. Активність ЛДХА була підвищена піруватозалежним дозозалежним способом. Однак вона була зворотна збільшенням ЦА. Так, результати сюжетів Міхаеліса-Ментена і Ліневейвера-Берка показали, що СА є неконкурентоспроможним інгібітором ЛДГК(рис. 3С, D). Крім того, дані ізотермічної титрованої калориметрії (ІТС) продемонстрували, що CA фізично зв'язується з LDHA значенням Kd 197 uM (Додатковий рисунок S8). Ці результати дають уявлення про те, що CA пригнічує активність LDHA через зв'язування місця зв'язування субстрату ЛДГК.

2.4. CA ресенсибілізує опір 5FU за рахунок зниження активності ЛДГГ

Ми оцінили цитотоксичний вплив СА на клітини СНУ620 і СНУ620/5ФУ і виявили, що СА пригнічує ріст в обох групах клітин (рис. 4А). Щоб переконатися, що гальмування росту було пов'язане з придушенням активності ЛДГК, експресія ЛДГК була скасована короткою рибонуклеїновою кислотою (шРНК) шпильки для ЛДХА (шЛДХА), а її експресія була відновлена трансфекцією LDHA, що експресує плазміду (Додаткова рис. S9A, B). У shLDHA-трансфектованих клітинах SNU620/5FU вироблення лактату та життєздатність клітин не були помітно змінені лікуванням СА, порівняно з ними пересмішаних клітин (рис. 4В, С). Крім того, інгібуючу дію росту СА посилювалося за рахунок відновлення експресії ЛДГК в клітинах ЛДГА-нокдауну SNU620/5FU (рис. 4Д). Далі клітини СНУ620 та СНУ620/5ФУ були досліджені після лікування СА та 5ФУ окремо або комбінації обох. Котреатація з СА і 5ФУ значно пригнічувала ріст клітин СНУ620/5ФУ (рис. 4Е). Крім того, комбіновані ефекти CA та 5FU були досліджені в декількох інших клітинних лініях, таких як АГС раку шлунка людини, рак підшлункової залози Panic-1, MIA PaCa-2 та клітини раку товстої кишки LS174T та RKO, порівняно з SNU620 та SNU620/5FUcells. Виробництво лактату і експресія ЛДГК показали хорошу кореляцію один з одним, і ці гліколітичні властивості відносно високі в SNU620/5FU, AGS і RKO (Додатковий рисунок S10A, B). Більш того, комбіноване лікування СА і 5ФУ значно знизило життєздатність клітин, в порівнянні з одноразовою обробкою 5ФУ в гліколітичних клітинах, включаючи АГС і РКО (Додатковий рисунок S10C). Однак спільна обробка з CA і 5FU істотно не гальмувала зростання в клітинах SNU620, Panic-1, MIA PaCa-2 і LS174T, які показали низькі експресії ЛДГК. Ці результати свідчать про те, що сенсибілізуючий ефект клітин, стійких до 5ФУ, може бути пов'язаний з його інгібуючою дією на активність ЛДГК.

Малюнок 2. Катехін (CA) інгібує активність ЛДГК, але не її експресію:(А)лактат продукції СНУ620/5ФУ вимірювалася після лікування похідними СА (10 мкМ) протягом 24 год;(B)in vitro активність ЛДХА оцінювалася при лікуванні похідними СА (10 уМ) та оксаматом (20 мМ);(С, D)in vitro, LDHA та ЛДХБ активність оцінювалася із зазначеними концентраціями СА; (E, F)клітини оброблялися зазначеними концентраціями СА протягом 24 год. Внутрішньоклітинні активності ЛДГГ і ЛДХБ вимірювалися за допомогою лізатів клітин як джерела ферментів. Результати відображаються як середнє значення ± SEM. **p<0.01><0.001, compared="" to="" the="" control="" (1st=""><><0.01,and><0.001,compared to="" the="" negative="" control="" (second="" column).ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a;="" ldhb,="" lactate="" dehydrogenase="" b.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Малюнок 4. Життєздатність клітин була інгібована шляхом обробки катехіном (СА) та 5-фторурацилом (5ФУ) у 5ФУ-резистентних клітинах:(А) життєздатність клітин СНУ620 та СНУ620/5ФУ оцінювалися після лікування зазначеними концентраціями СА протягом 48 год;(B)SNU620/5FU-pLKO.1 та SNU620/5FU-shLDHA клітин були оброблені КЛІТИНАМИ CA(10 μM) протягом 24 год. Виробництво лактату вимірювалося в культуральних середовищах клітин СНУ620/5ФУ-плЬКО.1 та СНУ620/5ФУ-шЛДХА;(С, Д)СНУ620/5ФУ-плЬКО.1, СНУ620/5ФУ-шЛДХА, СНУ620/5ФУ-шЛДХА+ЕВ, а також клітини СНУ620/5ФУ-шЛДХА+ЛДХА No2 оброблялися зазначеними концентраціями ЦА протягом 48 год. Життєздатність клітини вимірювалася за допомогою аналізу MTT;(E) клітини SNU620 та SNU620/5FU оброблялися ca (10 мкМ) та/або 5FU(10μM) протягом 48 год. Життєздатність цих клітин вимірювалася за допомогою аналізу MTT. Результати відображаються як середнє значення±SEM.*p<><0.01,and**><><0.05, ##=""><0.01, and="" ##t=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Ця стаття витягнута з Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms