Піноцембрін полегшує постінфарктну серцеву недостатність шляхом активації сигнального шляху Nrf2/HO-1 Частина 1

Будь ласка зв'яжітьсяoscar.xiao@wecistanche.comдля отримання додаткової інформації

Анотація

фон:Окислювальний стрес є важливим чинником прогресування серцевої недостатності. Поточне дослідження було проведено для того, щоб з’ясувати, чи здатний піноцембрін покращувати стан післяінфарктної серцевої недостатності (ПІСН) і механізми, що лежать в основі.

Натисніть тут, щоб дізнатися більше

Методи:Щурам перев'язували ліву передню низхідну артерію, щоб викликати інфаркт міокарда, а потім вирощували протягом 6 тижнів, щоб викликати хронічну серцеву недостатність. Потім піноцембрін вводили через день протягом 2 тижнів. Ефекти оцінювали за допомогою ехокардіографії, вестерн-блоттингу, фарбування за Массоном, біохімічних досліджень, імуногістохімії та флуоресценції. In vitro ми також культивували кардіоміоцити H9c2 і серцеві міофібробласти, щоб додатково підтвердити механізми.

Результати:Ми виявили, що індуковане PIHF погіршення серцевої функції значно полегшувалося введенням піноцембрину. Крім того, лікування піноцембрином також послаблювало відкладення колагену та посилювало рецептор 2 судинного ендотеліального фактора росту в прикордонній зоні інфаркту разом із ослабленим апоптозом, що було пов’язано з ослабленням окисного стресу, про що свідчить зменшення активних форм кисню (АФК) у тканині серця. і малоновий діальдегід (МДА) у сироватці крові, а також підвищення супероксиддисмутази (СОД). Це супроводжувалося підвищенням регуляції еритроїдного 2-зв’язаного з ядерним фактором шляху фактора 2 (Nrf2)/гемоксигенази-1(HO-1). Експерименти in vitro ми виявили, що специфічний інгібітор Nrf2 суттєво скасовує ефекти піноцембрину, включаючи антиоксидантні, антиапоптозні, антифіброзні та неоваскуляризаційні процеси, що додатково вказує на покращення PIHF піноцембрином у Nrf2/HO-1 шлях залежний спосіб.

Цистанхе може підвищити імунітет

Висновок:Піноцембрін покращував серцеві функції та ремоделювання в результаті PIHF за допомогою очищення від АФК та ​​активації шляху Nrf2/HO-1, що додатково послаблювало відкладення колагенових волокон і апоптоз, а також полегшувало ангіогенез.

Ключові слова:Піноцембрін, серцева недостатність, окислювальний стрес, Nrf2/HO-1

вступ

Серцева недостатність (СН), що характеризується низкою термінальних клінічних синдромів, що є результатом структурних та/або функціональних порушень серця, залишається глобальним тягарем для здоров’я, головною причиною якої є інфаркт міокарда (ІМ) (Ziaeian and Fonarow 2016; Galli and Ломбарді 2016; Ренго та ін.2013). Незважаючи на значні успіхи, досягнуті в лікуванні та якості медичної допомоги при серцевій недостатності, оцінюється поширеність 37,7 мільйонів осіб щороку в усьому світі, а також 50 відсотків смертності через 5 років після встановлення діагнозу серцевої недостатності (Go et al. .2014). Нинішню дилему можна частково пояснити тим, що постінфарктна СН (ПІСН) складається з широкого спектру патофізіологічних механізмів, до яких сучасні терапевтичні методи не можуть повністю віднестися.

Накопичувальні дослідження показали, що окислювальний стрес (ОС) переважно бере участь у патологічному прогресуванні ЗСН (Dubois-Deruy та ін. 2020; Ма та ін. 2019; Бабб та ін. 2017; Хабтемаріам 2019). ОС, в основному представлений Надмірне накопичення вільних радикалів/активних форм кисню (АФК), що містять гідроксильний радикал, супероксид, оксид азоту тощо (Dubois-Deruy та ін. 2020; Habtemariam 2019), було доведено, що воно може викликати окислювальну модифікацію або пошкодження ліпідів. , білків і ДНК, з розладами органел, запаленням, апоптозом у міоцитах та інтерстиціальним фіброзом (Dubois-Deruy та ін. 2020; Bubb та ін. 2017; Hermida та ін. 2018). Завдяки численним шкідливим ефектам АФК антиоксиданти враховуються в терапії PIHF, механізми якої полягають у прямому поглинанні АФК та/або стимуляції антиоксидантного захисту, що містить глутатіон, супероксиддисмутазу (СОД), каталазу тощо ( Habtemar-iam 2019). Проте, на жаль, застосування деяких антиоксидантів, ані вітаміну Е (Lee та ін., 2005), ані ресвератролу (Made та ін., 2015; Olesen та ін., 2014), не принесло задоволення при лікуванні серцево-судинних захворювань, про це свідчить збій у поліпшенні серцевої діяльності. Тому в терапії ПІГФ потрібні більш ефективні антиоксиданти.

Піноцембрін (Pino) ​​(хімічна структура показана на рис. 1A) є природною флавоноїдною сполукою, яку можна отримувати з меду, прополісу та кількох інших рослин (Lan et al.2015; Rasul et al.2013) на додаток до штучний синтез (Costa and Leitao 2011), який має протизапальну, антибактеріальну, анти- та протипухлинну дію (Rasul et al.2013; Ye et al.2019), а також виражену антиоксидантну дію (Kim et al.2020; Sangweni et al. .2020). Як було продемонстровано раніше, фенольна структура Піно, відповідальна за пряме усунення АФК, а також фенольні та нефенольні структури, які інтенсифікують антиоксидантний захист (Habtemariam 2019), пояснюють антиоксидантну дію Піно, за якою Піно було вивчено та застосовано в широкому різні захворювання, такі як нейродегенеративні захворювання, атеросклероз, індукована доксорубіцином токсичність кардіоміоцитів (Sangweni та ін. 2020; Sang та ін. 2012; Liu та ін. 2014). Однак, враховуючи те, що деякі антиоксиданти для лікування інфаркту міокарда та серцевої недостатності є недійсними або недостатніми для клінічного використання, чи може антиоксидантний ефект Піно бути реалізованим при лікуванні серцево-судинної недостатності, залишається недостатньо зрозумілим. Таким чином, це дослідження було проведено, щоб з’ясувати, чи може введення Піно сприятливо впливати на PIHE, обіцяючи бути новим або якщо не домінуючим, то принаймні допоміжним лікуванням.

Методи та матеріали

Модель тварин і протокол експерименту

56 самців щурів Sprague-Dawley, придбаних у дослідному центрі на тваринах Китайського університету трьох ущелин,

були вирощені в лікарні № 3 Уханя для тварин. Усі експерименти були офіційно дозволені та проведені в Ключовій кардіологічній лабораторії Хубея та відповідали Посібнику з догляду та використання лабораторних тварин, опублікованому Національним інститутом здоров’я США (публікація NIH №82-23, переглянута в 1996 році).

Щурам спочатку проводили перев'язку лівої передньої низхідної коронарної артерії (LAD) або фіктивну операцію. Коротко, щурів анестезували 3-відсотковим пентобарбіталом (2 мл/кг; Sigma-Aldridge, Сент-Луїс, США, внутрішньоочеревинно), з подальшою інтубацією трахеї та підтримкою дихання (дихальний об’єм: 5-10 мл, швидкість: 70 разів/хвилину). Подальше було проведено експозицію серця та LAD ліговано 7-0 мононитковими нейлоновими швами. Поява блідості верхівки серця або підйому сегмента ST на I відведенні електрокардіограми вказує на індукцію ІМ. Фіктивна операція пройшла ідентичні процедури, за винятком лігування LAD. Пеніцилін (200000 ОД) вводили внутрішньом’язово 1 раз на добу протягом тижня після операції.

Afterward, the rats were carefully raised for 6 weeks to produce PIHF. Rats were then randomly split into 4 groups:(i) sham+saline (sham group);(i)sham+Pino group;(ii)LAD ligation+saline(HF group);(iv)LAD ligation+Pino(HF+Pino group). Pinocembrin(5 mg/kg, purity>98 відсотків; Sigma-Aldridge) або такий же об'єм фізіологічного розчину вводили внутрішньовенно через хвостову вену через день протягом 2 тижнів. Дозування наведено в попередньому дослідженні (Lan et al.2017). Протокол був проілюстрований на фіг.1B.

Контрольні позитивні контрольні щури містили 3 групи: імітація плюс фізіологічний розчин (імітаційна група); лігування LAD плюс фізіологічний розчин (група HF); Лігування LAD плюс еналаприл (HF плюс група ACEI). Щурам проводили відповідні операції, за винятком того, що щурам групи HF плюс ACEI давали перорально 20 мг/кг еналаприлу.

Ехокардіографічні вимірювання

Серцеві функції оцінювали за допомогою трансторакальної ехокардіографії з використанням ультразвукової системи візуалізації (Vevo 2100, Visual Sonics Inc., Торонто, Канада), як повідомлялося раніше в нашій групі (Fo et al.2020). Внутрішній розмір лівого шлуночка на кінцево-діастолічній стадії (LVIDd) і кінцево-систолічній стадії (LVIDs), кінцевий систолічний і кінцевий діастолічний об’єм лівого шлуночка (LVESV і LVEDV) реєструвалися за допомогою двовимірної ехокардіограми в M-режимі протягом принаймні 3 послідовних циклів для кожного щура. Згодом розраховували фракцію викиду лівого шлуночка (LVEF) і фракційне вкорочення (FS), які відображали систолічну функцію.

Пробопідготовка

Після введення Піно та ехокардіографічних тестів щурів знову анестезували. Понад 2 мл венозної крові забирали з хвостової вени у вакуумні пробірки для збору крові, що містять етилендіамінтетраоцтову кислоту (EDTA), з послідовним центрифугуванням зі швидкістю 3000 об/хв протягом 15 хв і при температурі 4°C з подальшим виділенням супернатант сироватки та збереження при -80 "C. Потім серця швидко збирали. Частину зони кордону інфаркту кожного серця відрізали та заморожували в рідкому азоті для аналізу Вестерн-блот, а іншу тканину серця фіксували в 4 відсоток параформальдегіду більше 24 год.

Фарбування по Массону

Для виявлення відкладення колагену в прикордонній зоні інфаркту проводили фарбування за Массоном. Фіксовані параформальдегідом шлуночки заливали парафіном, а потім розрізали на 5- мкм ділянки. Потім зрізи пофарбували трихромом Массона, де колаген пофарбували в блакитний колір, міокард – у рожевий, а ядро ​​– у чорний. Частку відкладення колагену розраховували за допомогою програмного забезпечення Image J (NIH, Bethesda, MD) при збільшенні × 200.

Імуногістохімічний аналіз

Імуногістохімічний аналіз проводився для оцінки щільності рецептора фактора росту судинного ендотелію 2 (VEGFR2), активна регуляція якого сприяла ангіогенезу, що було благотворно та важливо для ослаблення ремоделювання (Rengo та ін. 2013). Шлуночкові зрізи виготовляли так само, як і з фарбуванням за Массоном, з подальшою депарафінізацією та регідратацією. Потім зрізи отримували теплоопосередковане відновлення антигену та обробляли 3% H, O, щоб блокувати ендогенну пероксидазу, з інкубацією 1 мкг/мл антитіла VEGFR2 (Abcam, ab9530) протягом 12 годин при 4 градусах. Після цього зрізи інкубували вторинним антитілом, міченим пероксидазою хрону (HRP) (1:200, сервіс, G1213) протягом 50 хвилин при 37°. Крім того, 3,3'-діамінобензидин використовувався для отримання позитивного фарбування, яке було показано темно-коричневим. Нарешті, середня оптична щільність VEGFR2 була проаналізована та розрахована за допомогою програмного забезпечення Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, США).

Аналіз кінцевої дезоксинуклеотидилтрансферази, опосередкованої міченням кінця розрізу (TUNEL)

Згодом апоптоз був виявлений за допомогою аналізу TUNEL. Раніше виготовлені парафінові маси, які вбудовують тканину шлуночків, розрізали на інші зрізи для аналізу TUNEL з подальшим фарбуванням TUNEL згідно з інструкціями виробника комерційного набору для аналізу (Roche, Швейцарія; 11684817910). Коротко, зрізи шлуночків піддавали дії реагенту TUNEL, де TdT і dUTP змішували у співвідношенні 1:9, протягом 1 години при кімнатній температурі після інкубації протеїнази K і розриву клітинної мембрани. Нарешті, флуоресцентні зображення спостерігали на довжині хвилі 530 нм, яка була викликана випромінюванням з довжиною хвилі 450 нм (збільшення × 400). Швидкість апоптозу тканин шлуночків у кожній групі аналізували та розраховували програмним забезпеченням Image Software.

Вестерн-блот

Ми застосовуємо Вестерн-блот, щоб з’ясувати механізми, за допомогою яких Піно покращив PIHF. Процедури вилучення та підготовки зразків білків нагадували ті, що були описані раніше в нашому дослідженні (Chen et al.2020a). Мембрани досліджували антитілами проти ядерного фактора еритроїдного 2-спорідненого фактора 2 (Nrf2), гемоксигенази{{ 4}}(HO-1;1:2000, Abcam, ab189491),p53(1:1000, технологія передачі сигналів клітин, 2524S), BCL-2 (1:1000, технологія передачі сигналів клітин, 2870P) ,bax (1:1000, Abcam, ab32503), розщеплена каспаза-3(1:1000, технологія клітинної сигналізації, 9664 T), колаген I (1:1000, Affinity, AF7001), гліцеральдегід-3- фосфатдегідрогенази (GAPDH, Service, GB12002), з подальшою візуалізацією за допомогою HRP-мічених вторинних антитіл (Service, G1213 і G1214) і реагентів хемілюмінесценції. Блот-зображення були остаточно проаналізовані та визначені кількісно за допомогою програмного забезпечення Image J.

Культивування та утилізація кардіоміоцитів H9c2 in vitro. Кардіоміоцити H9c2, отримані з шлуночків серця щурів, які були придбані в Американській колекції типових культур (CRL-1446), культивували для подальшої перевірки ефектів Pino in vitro. Кардіоміоцити H9c2 культивували в середовищі Ігла (DMEM)/F12, модифікованому Дульбекко, яке містило 10 відсотків фетальної сироватки великої рогатої худоби (Sijiqing, Ханчжоу, Китай) при температурі 37 градусів і атмосфері, що складалася з 95 відсотків повітря та 5 відсотків СО. Клітини були висіяні в 6-планшети з лунками після вирощування до 90 відсотків, крім того, сироваткове середовище, що містить 25 мкМ ізопреналіну (ISO), згодом було замінено нормальним середовищем у 3 лунках, щоб інкубувати клітини протягом 48 годин, щоб імітувати стан HF, оскільки СН також характеризується надмірною активацією симпатичного тонусу та стимуляцією β-адренорецепторів, що генерує АФК (Velusamy et al. 2020). Потім клітини були розділені на 6 груп: (i) контрольна група; (ii) контрольне середовище, додане 25 мкМ Піно протягом 4 годин (контроль плюс група Піно); （i） контрольне середовище, інкубуване спільно з 25 мкМ Піно та 5 мкМ ML385 протягом 4 годин (інгібітор Nrf2; MCE, Нью-Джерсі, США) (контроль плюс Pino плюс група ML385); (iv) група ISO; v. Середовище ISO з інкубацією 4-h з 25 мкМ Піно (група ISO плюс Піно); vi. ISO плюс 25 мкМ Піно плюс 5 мкМ група ML385. Концентрація та час інкубації препаратів посилаються на попередні дослідження або інструкції (Jin et al.2015; Oliveira et al.2017).

Культивування кардіальних міофібробластів новонароджених щурів та аналіз проліферації

Міофібробласти серця новонароджених щурів (CMF) культивували для дослідження впливу Піно на секрецію колагену. CMF були розділені за допомогою неонатальних щурів віком 3 дні, посилаючись на раніше продемонстровані методи (Cui та ін. 2021). Ізольовані та подрібнені серця кілька разів перетравлювали 0.125% трипсину, потім суміш із 0.25% трипсину та 0,08% колагенази кілька разів, потім центрифугували та пересаджували в чашку Петрі для збору клітин із супернатанту. Потім середовище замінювали сироватковим середовищем, подібним до того, яке використовували для культури кардіоміоцитів H9c2 після адгезії протягом 90 хвилин. CMF були знищені так само, як і кардіоміоцити H9c2. Ми також застосували набір для підрахунку клітин-8(CCK-8) аналіз (Dojindo, Японія) для виявлення проліферації CMF при досягненні щільності 1,5×10 градусів у кожній лунці, використовуючи зчитувач мікропланшетів на довжина хвилі 450 нм, де більш високе значення вказує на посилену активність проліферації.

виявлення АФК

Здатність Pino поглинати АФК вимірювали за допомогою флуоресцентного зонда дигідроетидію (DHE; Beyotime, Шанхай, Китай). DHL, який розчиняли в ДМСО, розбавляли до 5 мкМ для заморожених зрізів або додавали до сироваткового середовища для розведення до тієї ж концентрації відповідно до інструкцій. Серця, фіксовані параформальдегідом, заморожували, а потім нарізали шматочками до 4- мкм. Зрізи або кардіоміоцити H9c2 спільно інкубували з розчином DHE протягом 30 хвилин при температурі 37 градусів, потім знімали за допомогою інвертованого флуоресцентного мікроскопа (IX70; Olympus, Токіо, Японія). Коротко кажучи, ядро, яке було заповнене ДНК і РНК, було пофарбоване в чіткий червоний колір через спорідненість між нуклеїновою кислотою та DHE. Крім того, сильніша інтенсивність флуоресценції вказувала на більше накопичення ROS.

Біохімічні дослідження

Біохімічні дослідження були проведені для визначення змін сироваткового BNP, SOD та малонового діальдегіду (MDA) у сироватці та клітинному супернатанті, що вказувало на фенотип HF та захист від окислення відповідно. Концентрацію вимірювали за допомогою відповідних наборів для біохімічного аналізу згідно з інструкціями виробника (Jiancheng, Nanjing, China).

Ця стаття взята з Chen et al. Mol Med (2021) 27:100 https://doi.org/10.1186/s10020-021-00363-7