Ліпокалін, асоційований з нейтрофільною желатиназою, демонструє сильнішу здатність пригнічувати збільшення кісти клітин ADPKD порівняно з несекретованою формою

Ключові слова: ADPKD;ліпокалін, асоційований з нейтрофільною желатиназою; 3D культура

НОВІ ТРАВИ ДЛЯ

1. Вступ

Полікістоз нирок (ПКН), одне з найпоширеніших спадкових захворювань, характеризується розвитком заповнених рідиною кіст уздовж кількох сегментів нефрону [1]. ADPKD є найпоширенішою формою PKD, яка є проявом PKD у дорослому віці, при якому у більшості пацієнтів симптоми не розвиваються до досягнення ними сорокового віку [2]. ADPKD є результатом мутацій у генах PKD1 (85%) або PKD2 (15%), які кодують поліцистин-1 (PC1) та поліцистин-2 (PC2) відповідно [3,4]. Дефекти PC1 або PC2 пов’язані з аномальним підвищенням проліферації ниркових епітеліальних клітин і подальшим спричиненням утворення кіст [5–7]. У міру прогресування ADPKD кісти збільшуються та порушують нормальну архітектуру нирок, що зрештою призводить до ниркової недостатності. Однак механізм, задіяний у ADPKD, є складним і його ще належить дослідити. Функціональна втрата PC1 та/або PC2 при ADPKD призводить до зниження внутрішньоклітинної концентрації кальцію, послаблення чутливої ​​до кальцію аденілілциклази (AC) і додатково призводить до підвищення рівня внутрішньоклітинного циклічного аденозинмонофосфату (cAMP) [8,9]. цАМФ стимулює проліферацію епітеліальних клітин і секрецію рідини для сприяння збільшенню кісти шляхом активації протеїнкінази A (PKA) і шляху Ras/B-Raf/MEK/ERK, що йде далі [10,11]. Було продемонстровано, що дисфункція аутофагії виникає у ADPKD рибок даніо та мишей in vitro [12] та моделей in vivo у щурів [13]. Аутофагія є ключовим механізмом, який підтримує гомеостаз клітин і органів шляхом деградації та переробки органел, довгоживучих білків і поживних речовин [14,15]. Перехресні переговори виникають між шляхом mTOR аутофагії та шляхами апоптозу, який нерегульований у PKD [16]. Лікування активаторами аутофагії, такими як рапаміцин і карбамазепін, може значно послабити утворення кіст [12]. Раніше ми створили мишачу модель ADPKD під назвою Pkd1L3/L3 (на генетичному фоні C57BL/6) [17], вставивши сайт loxP і фланковану loxP mc1-neo касету в інтрони 30 і 34 гена Pkd1 відповідно (L3 означає три сайти loxP в алелі), щоб створити умовну мутацію гена. Миші Pkd1L3/L3 виробляли низькі рівні (20% від контролю) PC1, що викликало агресивний ріст кісти та збільшення об’єму нирок зі збільшенням віку [17]. Крім того, модель клітин ADPKD (клітинна лінія 2L3) була створена шляхом трансдукції вірусом SV40 первинних ниркових епітеліальних клітин мишей Pkd1L3/L3 для індукції безсмертних клітинних ліній [18].

Ліпокалін, асоційований з нейтрофільною желатиназою (NGAL), 22-kD секретований білок, розглядається як біомаркер ушкоджень нирок, у тому числі ПКД у дорослих [19] (але не у дітей [20]), хронічної хвороби нирок [21 ], гостра ішемія нирок [22]. Механізм підвищення білка NGAL у сечі пацієнта не з’ясований, було припущено, що накопичений NGAL у сечі пов’язаний з розпадом ниркових епітеліальних клітин у результаті пошкодження [23]. Деякі дослідження показали, що NGAL відіграє захисну роль проти пошкоджень нирок, розташування ішемії [24] і пригнічення прогресування кісти [25], тоді як деякі дослідження припускають, що NGAL може брати участь у прогресуванні кісти [26] і розвитку пухлини [27]. ]. Рецептор NGAL (NGAL-R, Slc22a17) експресується в багатьох епітеліальних тканинах, включаючи ниркові нефрони [28]. Зчеплення NGAL та NGAL-R може секвеструвати внутрішньоклітинне залізо та додатково індукувати апоптоз [29], що пов’язано зі стратегією виснаження заліза вродженої імунної системи проти бактеріальної інфекції [30].

Було показано, що введення екзогенного NGAL посилює апоптоз клітин Pkd1−/− і додатково зменшує ріст кіст in vitro [25]. У попередній роботі ми створили Pkd1L3/L3 × NGAL−/− мишей та Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg мишей шляхом схрещування Pkd1L3/L3 мишей з NGAL нокаутними та трансгенними мишами відповідно [31]. Ми виявили, що надмірна експресія NGAL у моделі миші ADPKD (миші Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg) зменшує прогресування кісти та подовжує тривалість життя мишей Pkd1L3/L3, що супроводжується змінами в ряді молекулярних шляхів, залучених до проліферації, апоптозу та фіброз [31]. Однак основний механізм впливу NGAL на полегшення прогресування ADPKD залишається загадковим.

У цьому дослідженні було створено 3D-платформу клітинної культури для тестування прогресування кісти Pkd1L3/L3 ниркових епітеліальних клітин (клітин 2L3) з додаванням рекомбінантного білка NGAL миші (mNGAL) або надекспресії трансгенного NGAL in vitro. Крім того, було вивчено вплив психіки на шляхи проліферації, апоптозу та аутофагії. Крім того, механізм NGAL у клітинах 2L3 було з’ясовано шляхом вивчення ефектів надекспресії секретованого NGAL (pN + LS) і несекретованого NGAL (pN − LS) у клітинах 2L3. Ефект і можливий механізм білка NGAL у клітинах ADPKD були частково вивчені в цьому дослідженні.

2. Матеріали та методи

2.1. клітинні лінії

Клітинна лінія Pkd1L3/L3 (2L3) була створена за допомогою трансдукції вірусом SV40 первинних ниркових епітеліальних клітин мишей 2L3, мишачої моделі ADPKD, для індукції безсмертної клітинної лінії [17,18]. Первинні ниркові клітини були інфіковані під час їхнього другого пасажу за допомогою набору для імморталізації вірусу Lenti SV40 (Capital Biosciences Inc., Gaithersburg, MD, USA). Клітини інкубували в 5% CO2 при 37 ◦C і обробляли полібреном (8 мкг/мл) протягом ночі в шестилунковому планшеті. На наступний день супернатант вірусу видаляли, а клітини інкубували у свіжому середовищі. Після досягнення злиття клітини пересівали в чашку 10- см із культуральним середовищем і вважалися клітинами першого пасажу (P1). SV40-трансформовані клони були відібрані та виділені за допомогою кілець клонування [17,18]. Клітинну лінію M-1 (Pkd1+/+), придбану в BCRC (Сіньчжу, Тайвань), використовували як лінію клітин дикого типу.

2.2. Культура клітин

Клітини проходили кожні три дні. Щоб перевірити IC50 mNGAL у клітинах ADPKD, клітини 2L3 висівали в 24-лункові планшети (6000 клітин/лунка) з 500 мкл середовища, описаного вище, та інкубували протягом 16 год. Потім клітини обробляли рекомбінантним mNGAL (0, 20, 40, 80, 160, 320 мкг/мл) або рапаміцином (1 мкМ, від Sigma, Сент-Луїс, Міссурі, США) протягом наступних 0, 8, 24 або 48 h (n=4).

2.3. Фарбування лектином

Щоб перевірити, чи походять клітини M{{0}} і 2L3 з ниркових канальців подібного походження, фарбування лектину лектином Lotus tetragonolobus (LTL, який є диференційованим маркером проксимальних канальців, міченим флуоресцеїном) і аглютиніном Dolichos biflorus (DBA , який є диференційованим маркером збірної протоки, міченим родаміном). LTL і DBA були придбані у Vector Laboratories (Берлінгейм, Каліфорнія, США). Для спостереження за клітинами клітини, культивовані на покривному склі, промивали фосфатно-сольовим буфером (PBS) тричі протягом 10 хвилин, а потім фіксували 4% параформальдегідом (PFA) у PBS протягом 30 хвилин. Після пермеабілізації 0,4% Triton X-100 у PBS (PBST) протягом 20 хвилин клітини блокували 10% кінської сироватки в PBST протягом 1,5 години. Клітини фарбували LTL (20 мкг/мл) та DBA (20 мкг/мл) протягом 1 години при 37 ◦C. Ядра фарбували DAPI (1 мкг/мл) протягом 5 хв. Зразки промивали PBST тричі протягом 10 хвилин між етапами.

2.4. Лізат ДНК і генотипування

Для генотипування гена Pkd1 використовували ПЛР-прямий (50 -TGTGTTGTTCTTTGTGGCAGTCAG-30 ) і зворотний (50 -ATTCTCAATGACTGACTTGGGCTC-30) праймери для ампліфікації послідовностей геномної ДНК. Зразки нагрівали при 94 ◦C протягом 5 хвилин, а потім виконували 30 циклів (94 ◦C протягом 1 хвилини, 56 ◦C протягом 1 хвилини, 72 ◦C протягом 1 хвилини), потім 72 ◦C протягом 10 хвилин і 25 ◦ C протягом 5 хв. Після ампліфікації за допомогою ПЛР продукти ДНК змішували з барвником із завантаженням 6× і аналізували за допомогою 1% агарозного трис-борат-EDTA (TBE) гелю.

2.5. Кількісна полімеразна ланцюгова реакція зворотної транскрипції в реальному часі (RT–qPCR)

Загальну РНК із клітинної лінії виділяли за допомогою набору для екстракції gDNA MagQu (MagQu, Новий Тайбей, Тайвань) з подальшою обробкою ДНКазою I (Вортінгтон, Лейквуд, Нью-Джерсі, США) і зберігали в ddH2O при -80 ◦C. Якість і концентрацію РНК визначали за допомогою 1% TBE агарозного гелю та спектрофотометра NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). Матричну РНК зворотно транскрибували в кДНК за допомогою набору для синтезу кДНК першого ланцюга RevertAid (Thermo Fisher Scientific) у присутності інгібітора РНКази RNaseOUTTM (G-Biosciences, Сент-Луїс, Миссурі, США). Кожну реакцію готували в загальному об’ємі 20 мкл, включаючи загальну РНК (100 нг), праймер Oligo (dT)18 (1 мкл), 5X реакційний буфер (4 мкл), інгібітор РНКази RiboLock (20 ОД), суміш dNTP ( 1 мМ), зворотна транскриптаза RevertAid (200 ОД) і вода без нуклеаз. Для синтезу кДНК першого ланцюга зразки нагрівали при 42 ◦C протягом 1 години, а потім реакцію припиняли нагріванням при 70 ◦C протягом 1 хвилини.

Кількісну оцінку експресії генів проводили за допомогою системи ПЛР у реальному часі StepOne™ (Applied Biosystems, Norwalk, CT, USA). Кожен зразок готували в загальному об’ємі 20 мкл, включаючи ген-специфічні прямі (100 нМ), зворотні (100 нМ) праймери (табл. 1), матрицю кДНК (100 нг), ORATM SEE qPCR Green ROX H Mix (1× , high GmbH, Kraichtal, Німеччина) та ПЛР води. Зразки нагрівали при 95 ◦C протягом 2 хв, потім 40 циклів (95 ◦C протягом 5 с, 65 ◦C протягом 25 с), а потім аналізували криву плавлення (95 ◦C протягом 15 с, 60 ◦C протягом 1 хв). 95 ◦C протягом 15 с), використовуючи систему ПЛР у реальному часі StepOne™. Дані були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення StepOne™ (версія 2.3). Для нормалізації використовували експресію гена Gapdh.

2.6. Аналіз життєздатності клітин

Життєздатність клітин визначали за допомогою тіазолілового синього тетразолію броміду (аналіз МТТ) (Sigma). Розчин МТТ (0,5 мг/мл) додавали до кожної лунки та інкубували при 37 ◦C протягом 2 год. Щоб розчинити фіолетові кристали формазану, додавали диметилсульфоксид (DMSO, Sigma) до кожної лунки після видалення середній і MTT рішення. Оптичну щільність (OD) кожного зразка при 570 нм вимірювали за допомогою пристрою для зчитування ELISA (Thermo Fisher Scientific).

2.7. Аналіз проліферації клітин

Аналіз проліферації клітин бромдезоксиуридином (BrdU) (Millipore, Берлінгтон, Массачусетс, США) проводили для аналізу проліферації клітин M-1 і 2L3. Щоб порівняти здатність до проліферації клітин M-1 і 2L3, клітини культивували в 96-лункових планшетах (5 × 103 клітин/лунка) протягом 24 годин. За 2 години до закінчення інкубаційного періоду до середовища додавали BrdU. Щоб дослідити вплив mNGAL на проліферацію клітин 2L3, клітини 2L3 спочатку культивували в 96-лункових планшетах (2 × 103 клітин/лунку) протягом 16 годин з подальшою обробкою mNGAL ще протягом 8, 24 і 48 годин. BrdU додавали до середовища за 2 години до закінчення періоду інкубації їжі. Потім клітини фіксували фіксуючим розчином (200 мкл/лунка) при 37 ◦C протягом 30 хвилин, після чого інкубували з антитілом для виявлення BrdU (100 мкл/лунка) при 37 ◦C протягом 1 години та кон’югованим з пероксидазою козячим антимишачим антитілом. (100 мкл/лунка) при 37 ◦C протягом 30 хв. Клітини тричі промивали промивним буфером і промокали паперовими рушниками між вищеописаними етапами.

Після інкубації з субстратом пероксидази TMB (100 мкл/лунку) при 37 ◦C протягом 30 хвилин у темряві реакцію зупиняли стоп-розчином (100 мкл/лунку). Нарешті, OD450 кожного зразка вимірювали за допомогою пристрою для зчитування ELISA (Thermo Fisher Scientific).

2.8. Аналіз апоптозу

Для аналізу апоптозу за допомогою проточної цитометрії клітини 2L3 висівали в 6-лункові планшети (1,8 × 105 клітин/лунку) з 2 мл середовища та інкубували протягом 16 годин. Потім клітини обробляли mNGAL (0, 600, 1200 мкг/мл) ще протягом 0, 4 або 12 годин, збирали та фарбували аннексином V-FITC і PI (BD Biosciences, Сан-Хосе, Каліфорнія, США). ) для аналізу за допомогою проточної цитометрії через 4 та 12 годин відповідно (n=3 для контролю та mNGAL). Для встановлення компенсації та квадрантів перед аналізом використовували незабарвлені клітини, клітини, пофарбовані лише аннексином V-FITC, і клітини, пофарбовані лише PI.

2.9. Вестерн-блот аналіз

Клітини збирали та лізували за допомогою RIPA з додаванням суміші інгібіторів протеази (1:100) і фосфатази (1:100). Після інкубації протягом 30 хвилин при 4 ◦C лізати клітин центрифугували протягом 15 хвилин при 13400 × g (Eppendorf 5415R, Гамбург, Німеччина) при 4 ◦C. Концентрації білка вимірювали за допомогою аналізу BCA. Рівні кількості білка (25 мкг білка із завантаженням барвника 1:2/лунка) електрофоретично розділяли за допомогою SDS-PAGE (10%) і переносили на 1 годину на мембрани PVDF. Потім мембрани блокували 5% знежиреним молоком у трис-буферному фізіологічному розчині з 0,1% Tween-20 (TBST) протягом 2 годин при кімнатній температурі. Після промивання TBST три рази протягом 10 хвилин мембрани інкубували з первинними антитілами (табл. 2) протягом ночі при 4 ◦C, після чого інкубували 1- год з кон’югованими з HRP вторинними антитілами (табл. 3).

2.10. Тривимірна культура клітин (3D культура)

Тривимірну культуру проводили з використанням матриці Matrigel (Corning, NY, USA) для оцінки утворення кісти. Клітини 2L3 висівали в 96-планшети з лунками (1000 клітин/лунка) на попередньо сформованому матригелі (40% у середовищі). Після того, як клітини були прикріплені до гелю, до клітин було додано більше Matrigel, щоб утворити структуру, подібну до сендвіча (рис. 6). Клітини підтримували в 3D культурі при 37 ◦C і 5% CO2. Клітини обробляли форсколіном (20 мМ, Sigma) з 1 по 3 день, щоб індукувати утворення кісти. Після індукції утворення кісти форсколіном клітини обробляли mNGAL (2 мг/мл) або без нього з 4 по 8 день, а середовище змінювали щодня. Утворення кіст спостерігали під мікроскопом щодня, а діаметр, площу та кількість кіст вимірювали за допомогою ImageJ. Імуноцитохімію (ICC) проводили на 8-й день на чашці або покривних скельцях. Спостереження за кістами проводили за допомогою конфокальної мікроскопії (ZEISS, Oberkochen, Німеччина).

2.11. Імуноцитохімія (ICC)

Для спостереження за цистами цисти, культивовані за допомогою Matrigel в лунках або на покривних скельцях, тричі промивали PBS протягом 10 хв, а потім фіксували 4% параформальдегідом (PFA) у PBS протягом 30 хв. Після пермеабілізації 0,4% PBST протягом 20 хвилин, кісти були заблоковані 10% кінської сироватки в PBST протягом 2 годин. Цисти фарбували первинними антитілами проти Е-кадгерину (1:500; Cell Signaling Technology, Денверс, Массачусетс, США) і актину (1:1000; Millipore) протягом ночі при 4 ◦C, а потім фарбували флуоресцентними вторинними антитілами (таблиця 3). в темряві 1 год при кімнатній температурі. Ядра фарбували DAPI (1 мкг/мл) протягом 5 хв. Зразки промивали PBST тричі протягом 10 хвилин між етапами.

2.12. Конфокальна мікроскопія

Щоб підтвердити, що сферичні конструкції, які спостерігалися в 3D-культурі, були цистами, покривні скельця з 3D-культури були встановлені на предметні скла з монтажним середовищем Fluoromount-G (SouthernBiotech, Бірмінгем, Алабама, США) і зображені за допомогою конфокального мікроскопа. Конфокальна візуалізація була виконана з масляним імерсійним об’єктивом 63×. Різні оптичні z-зрізи кісти 2L3 у 3D культурі були отримані за допомогою модуля Z-stack у програмному забезпеченні мікроскопа ZEISS ZEN (Oberkochen, Німеччина). Оптичні зрізи кіст були реконструйовані в Z-стек або 3D-відео за допомогою програмного забезпечення мікроскопа ZEISS ZEN.

2.13. Плазмідна конструкція та вірусна інфекція

Послідовність NGAL миші (534 bp) була вставлена ​​у вектор pSecTag2B (Invitrogen, Карлсбад, штат Каліфорнія, США) у рамці та нижче за течією лідерної послідовності ланцюга Igκ миші для надмірної експресії секретованого білка NGAL. Навпаки, лідерна послідовність ланцюга Igκ миші у вищеописаній плазміді була видалена для надмірної експресії несекретованого білка NGAL. pSecTag2B-NGAL з лідерною послідовністю або без неї (pN + LS або pN − LS відповідно) був розроблений для вивчення зв’язку між NGAL і рецептором NGAL. Щоб забезпечити правильне введення конструкцій, NheI та NotI використовували для розщеплення pN + LS або pN − LS за допомогою NEBuffer 2 (New England Biolabs, Іпсвіч, Массачусетс, США) при 37 ◦C протягом 2 годин з подальшим аналізом за допомогою 1% ТБЕ гель.

Щоб отримати стабільні клони, клітини 2L3 інкубували в середовищі DMEM/F12 (300 мкл/лунку), доповненому 10% термонеактивним FBS, 1% P/S, полібреном (8 мкг/мл) і лентивірусом (200 мкл) у 6-лунковий планшет при 37 ◦C протягом 24 годин. Потім супернатант вірусу видаляли, а клітини промивали PBS та інкубували зі свіжим середовищем, що містить бластицидин (4 мкг/мл), для відбору інфікованих клітин. Селекційне середовище змінювали кожні 3 дні. Інфіковані клітини збирали через тиждень після відбору бластицидином для вестерн-блоттингу та RT-QPCR для аналізу рівня експресії mNGAL.

2.14. Імуноферментний аналіз (ELISA)

Кількісне визначення NGAL, що секретується клітинами, проводили за допомогою твердофазного сендвіч-набору ELISA з мишачим ліпокаліном{{0}} (Lcn2) (Thermo Fisher Scientific). Супернатант клітинного середовища збирали, центрифугували для видалення залишків клітин і зберігали при -80 ◦C. Для стандартної кривої готували 8-кратні серії розведень стандартного білка NGAL миші (0, 0,024, 0,195, 1,563, 12,5, 100 нг/мл). Стандарти (100 мкл/лунку) і зразки (100 мкл/лунку 10 мкг загального білка з клітинного лізату або нерозведеного супернатанту) додавали до 96-лункового планшета та інкубували при 37 ◦C протягом 2,5 годин. Кожну лунку інкубували з кон’югатом біотину (100 мкл/лунку) при 37 ◦C протягом 1 години, а потім з розчином стрептавідину-HPR (100 мкл/лунку) при 37 ◦C протягом 45 хвилин з обережним струшуванням. Розчин відкидали, а лунку промивали

Після інкубації з субстратом ТМВ (100 мкл/лунку) при 37 ◦C протягом 30 хв у темряві реакцію зупиняли додаванням стоп-розчину (50 мкл/лунку). Нарешті, OD450 кожного зразка вимірювали за допомогою пристрою для зчитування ELISA (Thermo Fisher Scientific).

2.15. Статистичний аналіз

Усі дані показані як середнє ± стандартне відхилення (SD). Для множинних середніх порівнянь дані були проаналізовані за допомогою t-критерію Стьюдента та одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA) за допомогою пост-тестів Тьюкі в R studio. Відмінності вважалися статистично значущими, коли значення p < 0.05.