Швидке одночасне визначення шести ефективних компонентів у Cistanche Tubulosa методом ближньої інфрачервоної спектроскопії

1. вступ

Цистанхея (Hoffmg. Et Link) — багаторічна фанерогамна рослина родини Оробанхові (Orobanchaceae). Більшість видів, що належать до роду Cistanche, використовувалися як лікарські рослини протягом тисячоліть у Китаї; мають репутацію найкращого тоніка; і відомі як «Женьшень пустель». Cistanche tubulosa — облігатний паразит коренів багаторічної рослини тамарикса китайського. Це було задокументовано в Китайській фармакопеї як автентичне джерелоCistanches Herba(Китайська назва: Roucongrong) з видання 2005 року. Сучасні фармакологічні дослідження видів Cistanche були розпочаті у 1980-х роках. Фармакологічні дослідження показали, що екстракти рослин Cistanche мають широкий спектр дії, наприклад, лікування ниркової недостатності та старечих запорів, покращення здатності до навчання та запам’ятовування, проти хвороби Альцгеймера, підвищення імунітету, проти старіння, втоми тощо. В останні три десятиліття комплексні та систематичні фармакологічні дослідження були поєднані з фітохімічними дослідженнями, щоб висвітлити матеріальну основу корисного впливу коренів рослин цистанхеї. Ці опитування показують, що фенілетаноїдні глікозиди (PhGs) були основними ефективними компонентами в рослинах Cistanche, які відіграють ключову роль у лікуванні ниркової недостатності, імпотенції, запобіганні старінню та хворобі Альцгеймера. Вміст двох PhG (ехінакозид і вербаскозид) вимагався в китайській фармакопеї. Тим часом вуглеводи, такі як маніт, сахароза, глюкоза та фруктоза в рослинах Cistanche, мають проносну функцію та кластери вуглеводівРослини цистанчівикористовувалися для лікування запорів.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПІДВИЩЕННЯ ТЕСТОСТЕРОНУ PHGS75% ECH 30% ДІЯ 12%

Дикі ресурси C. tubulosa в основному поширені в районі, що оточує пустелю Такламакан на півдні Сіньцзянського автономного району в Китаї. Подібно до багатьох інших видів, які використовуються як традиційні китайські ліки (ТКМ), C. tubulosa має велике економічне значення та майже вимер у своєму дикому середовищі існування через надмірний збір. Вирощування C. tubulosa почалося в 1990-х роках у Китаї, щоб забезпечити постачання сировини для Cistanches Herba, а також захистити ресурси диких рослин. Станом на 2017 рік у префектурі Хотан у Сіньцзяні існує майже 13 тисяч га культивованих C. tubulosa. Для розширення вирощування та покращення якості C. tubulosa потрібні досягнення в технології посадки.

Основною метою культивування C. tubulosa є виробництво Cistanches Herba, багате цими ефективними компонентами. Однак вміст ефективних компонентів вCistanches Herba, такі як PhG та олігосахариди, під час виробництва можуть значно впливати багато факторів. Необхідно вивчити систему визначення якості C. tubulosa в реальному часі. Тому необхідно розробити високопродуктивний метод, щоб виконати вимогу аналізу великої кількості зразків протягом короткого періоду часу. Традиційно визначення основних ефективних компонентів, таких як PhG і вуглеводи, у C. tubulosa зазвичай досягалося за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Незважаючи на точність і надійність, збір і обробка даних займає багато часу і праці. Крім того, багато часу та зусиль вимагає також підготовка зразків, яка зазвичай включає подрібнення, екстракцію та фільтрацію аналізів ВЕРХ. Тому для отримання відносно великого обсягу даних потрібен чіткий принцип і простий в експлуатації інструмент. На щастя, спектроскопія ближнього інфрачервоного діапазону (NIRS) широко використовується для оцінки сільськогосподарської продукції, продуктів харчування, медичних зразків і фармацевтичних продуктів, оскільки вона є швидкою та неруйнівною. Таким чином, NIRS може точно відповідати вимогам для ефективних вимірювань TCM, і, що не дивно, NIRS застосовувався для якісної ідентифікації та кількісного визначення сполук у TCM.

У цьому дослідженні досліджено вміст шести ефективних компонентів, у т.чехінакозид, вербаскозид, маніт, сахароза, глюкоза та фруктозау 116 партіях зразків C. tubulosa, які були зібрані в префектурі Хотан у Сіньцзяні в 2013–2015 роках, вперше були визначені за допомогою ВЕРХ. Згодом моделі калібрування цих шести компонентів були створені методом регресії часткових найменших квадратів (PLSR). Потім ці моделі були перевірені за допомогою коефіцієнтів кореляції та помилок передбачення в наборах калібрування. Результати показали, що розроблений метод може бути використаний як надійний метод кількісного аналізу C. tubulosa.

2. Результати

2.1. Аналіз ВЕРХ

Змістехінакозид і вербаскозидбули визначені чітко визначеним методом ВЕРХ-УФ в літературі, а чотири вуглеводи (маніт, сахароза, глюкоза та фруктоза) були визначені чітко визначеним методом ВЕРХ-ELSD в літературі для всіх 116 зразків. Підготовка проб і методи визначення описані в розділах 3.1 і 3.3. На малюнку 1 наведено характеристичні хроматограми змішаних стандартів. Можна побачити, що всі шість ефективних компонентів були розділені базовою лінією і тому їх можна було кількісно визначити. Метод ВЕРХ був валідований перед тестуванням зразка. Основні результати методу ВЕРХ наведені в таблиці 1. Сприятливе лінійне співвідношення (r=0.9998) і вихід (98,5%) методу визначення ехінакозиду показано в результатах, такий самий результат, як і всі п’ять компоненти. Таким чином, можна точно визначити вміст шести ефективних компонентів. Усі визначені діапазони вмісту підсумовані в таблиці 1.

2.2. Аналіз NIRS

На малюнку 2 показано спектри NIR (4000–10,000 см−1) зразків C. tubulosa. Значні піки поглинання з'явилися від 4000 см−1 до 7500 см−1 у всіх зразках, тоді як слабкі коливання з'явилися від 7500 см−1 до 10 000 см−1. Базовий дрейф спектрів NIR стався через те, що на зразок легко впливали такі фактори, як розмір частинок і колір (рис. 2A). Математична попередня обробка спектрів була використана, щоб певною мірою зменшити вплив непотрібної інформації. Математична попередня обробка включала перше виведення (1-е виведення), друге виведення (2-е виведення), стандартну нормальну різноманітність (SNV) і мультиплікативну корекцію розсіювання (MSC). На малюнку 2B показано 2-е виведення спектрів NIR C. tubulosa, і спостерігаються значні варіації, які відбулися в трьох областях, 4000–4500 см–1, 5000–5500 см–1 і 7000–7500 см–1.

2.3. Створення моделей кількісного калібрування

Часткова регресія найменших квадратів (PLSR) є класичним методом моделювання, і він широко використовується в кількісних моделях через високу якість результатів. Переваги PLSR включають його хорошу здатність до прогнозування та відносну простоту. PLSR також широко застосовувався для створення моделей кількісного калібрування TCM [25]. На основі попередньо оброблених спектрів NIR була створена модель кількісного аналізу NIR для шести ефективних компонентів у C. tubulosa за допомогою методу PLSR з даними аналізу HPLC як справжні значення. 116 зразків були випадковим чином розділені на набори для калібрування та перевірки у співвідношенні 3:1. Найбільш відповідні умови для калібрування були обрані за низьким RMSEC і високим коефіцієнтом кореляції.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ СТАТЕВОЇ ФУНКЦІЇ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3.1. Вибір діапазону хвиль для калібрувальних моделей

Вибір відповідного діапазону хвиль був важливим кроком для побудови калібрувальної моделі. У цьому дослідженні порівнювалися спектри NIR-інтервалу 4000–7500 см−1 (рекомендовано програмним забезпеченням аналітика TQ) і 4000–10 000 см−1. Було помічено, що цей діапазон непридатний для калібрування в інтервалі між 4000 см−1 і 7500 см−1 з таблиці 2. Отже, у поточному дослідженні всі спектральні інтервали для шести хімічних складових були вибрані з інтервалу з 4000 до 10 000 см−1 шляхом порівняння продуктивності RMSEC і коефіцієнта кореляції.

2.3.2. Вибір оптимальної кількості факторів для калібрувальних моделей

PLSR пояснює максимальну кількість варіабельності даних шляхом зменшення розмірності даних спектрів шляхом обчислення факторів. Проблема «недостатності» виникла через недостатню кількість інформації, яка є наслідком обмеженої кількості факторів; однак вибір факторів, вищих за оптимальні значення, введені в модель, призведе до проблеми "переобладнаності". Або «недостатність», або «надлишок» зменшить прогностичну силу встановлених моделей [22]. На малюнку 3 показано співвідношення між RMSECV і факторами для всіх шести сполук. Тому ми вибрали ті фактори, які відповідають найнижчим значенням RMSECV. Оптимальний вибір факторів для моделей калібрування наведено в таблиці 3.

2.3.3. Вибір спектральної попередньої обробки для калібрувальних моделей

Іншим важливим впливовим фактором для калібрувальних моделей є спектральна попередня обробка, яка спрямована на зменшення впливу розсіювання та дрейфу базової лінії, покращення співвідношення сигнал/шум та усунення нерегулярних коливань. Для усунення впливу розсіювання випромінювання використовували методи мультиплікативної корекції розсіювання (MSC) і стандартної нормальної змінної (SNV). Щоб вирішити вплив дрейфу базової лінії, порівняли спектри 1-ї та 2-ї похідних і вибрали 2-е похідне. Для отримання бажаного ефекту ми згладили спектри за допомогою алгоритму фільтра Савицького–Голея (SG) перед виведенням, щоб запобігти збільшенню шуму. У таблиці 3 наведено інформацію про спектральну попередню обробку та її результати для калібрувальних моделей.

2.4. Оцінка встановлених моделей

Хороша модель калібрування NIRS повинна мати низькі значення RMSEC і RMSEP, а також високий коефіцієнт кореляції (r) і невеликі відмінності між RMSEC і RMSEP. Калібрувальні моделі шести вибраних сполук були створені згідно з процедурами, згаданими вище (Таблиця 3). Значення RMSEC і r для калібрувального набору ехінакозиду становили 27,6 і 0.9808 відповідно. Параметри ефективності інших моделей хімічних сполук наведено в таблиці 3, з якої можна зробити висновок, що встановлені моделі дають задовільні результати прогнозування та можуть бути використані для швидкого кількісного аналізу C. tubulosa. Діаграми розсіювання шести хімічних сполук показані на рисунку 4, щоб зробити моделі калібрування більш описовими та візуальними. Як показано на малюнку 4, між прогнозованими та виміряними значеннями виникли незначні відмінності, оскільки більшість точок було розподілено навколо регресивної кривої з рівнянням y=x. Таким чином, на малюнку 4 спостерігаються чудові прогнозні характеристики.

3. Матеріали та методи

3.1. Підготовка зразка

Сто шістнадцять зразків C. tubulosa були зібрані в префектурі Хотан в автономному районі Сіньцзян з 2013 по 2015 рік. Усі зразки культивувалися, але вони були зібрані на різних стадіях росту. Свіжа маса зразків коливалася від 20 г до 1000 г. Після сушіння на сонці висушені зразки подрібнювали та просівали через 60-сітчасте сито.

3.2. Збір даних NIR спектроскопії

БІЧ-спектри зразків збирали з інтервалом 8 см−1 у спектральній області 4000–10 000 см−1 за допомогою системи Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific, Медісон, Вісконсин, США), оснащеної ручний адаптер відбиття оптичного волокна. Кожен спектр був отриманий шляхом усереднення 64 сканувань. Усім зразкам давали врівноважитись до кімнатної температури (25 ◦C) перед скануванням NIR-спектрів, щоб переконатися, що зразки були проаналізовані при однаковій температурі. Вологість у лабораторії підтримувалася на рівні навколишнього середовища.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ ФУНКЦІЇ НИРОК PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3. Збір даних ВЕРХ

3.3.1. Підготовка екстракції

Один грам порошку C. tubulosa екстрагували 50 мл 50% метанолу в конічній колбі за допомогою ультразвукової обробки (500 Вт, 40 кГц) протягом 30 хв. Екстракт зберігали при 4 ◦С. Супернатант екстракту фільтрували для отримання зразка для аналізу ВЕРХ.

3.3.2. Одночасне визначення ехінакозиду та вербаскозиду за допомогою ВЕРХ-УФ

Аналіз рідинної хроматографії проводився на системі Shimadzu UHPLC (Shimadzu, Кіото, Японія), що складається з двох блоків доставки розчинника LC-20ADXR, насоса LC-20AD, SIL-20ACXR auto пробовідбірник, піч колонки CTO-20AC, детектор DAD SPD-M20A, дегазатор DGU-20A3R і контролер CBM-20A.

Колонку Grace Prevail Carbohydrate ES (150 × 2,1 мм, 2,7 мм), яка використовувалася для хроматографічного розділення, підтримували при 35 ◦C. Рухома фаза складалася з ацетонітрилу (A) і 0.1% водного розчину мурашиної кислоти (B) і доставлялася за наступною градієнтною програмою: 0–7 хв, лінійний градієнт 10–20% А; 7–15 хв, 20% А; і 15–20 хв, лінійний градієнт 20–10% А. Швидкість потоку рухомої фази становила 0,4 мл/хв. УФ-моніторинг проводили при 330 нм.

3.3.3. Одночасне визначення маніту, сахарози, глюкози та фруктози за допомогою ВЕРХ-ELSD

ВЕРХ проводили на системі РХ серії Agilent 1100 (Пало-Альто, Каліфорнія, США), що складається з дегазатора G1322A, четвертинного насоса G1311A, автосамплера G1311A, контролера температури колонки G1316A та детектора G1315B DAD.

Для хроматографічного розділення використовували колонку Sigma Prevail Carbohydrate ES (4,6 × 250 мм, 5 мкм) і підтримували температуру колонки 25 ◦C. Рухома фаза складалася з ацетонітрилу та води (77:23, об’єм/об’єм) та ізократичного сполучника, що подавався зі швидкістю потоку 0,7 мл/хв. Стічні води контролювали за допомогою випарного детектора світлорозсіювання (ELSD) із параметрами за замовчуванням.

3.4. Обробка даних

TQ Analyst (версія 8.0, Thermo Scientific, Медісон, штат Вісконсин, США) використовувався для поділу наборів калібрування та перевірки, математичної попередньої обробки спектрів, встановлення моделей калібрування та інших обчислень . Для виготовлення фігур використовувався Origin (версія 9.1).

4. Висновки

У цьому дослідженні ми запропонували швидкий і неруйнівний метод одночасного аналізуехінакозид, вербаскозид, маніт, сахароза, глюкоза та фруктозавC. tubulosaвід NIRS. Аналіз RMSEC, коефіцієнта кореляції, RMSEP і значень Rp продемонстрував, що встановлені кількісні моделі NIR можна використовувати для точного прогнозування вмісту шести вибраних ефективних компонентів уC. tubulosa. У порівнянні з ВЕРХ метод NIRS, про який повідомляється в цьому дослідженні, може значно заощадити робочу силу та час, зберігаючи при цьому задовільну здатність кількісного аналізу. Таким чином, описаний тут метод має потенціал для використання в контролі якостіC. tubulosaі таким чином керувати розробкою технології вирощування та обробкиC. tubulosa.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ СТАТЕВОЇ ФУНКЦІЇ PHGS75% ECH 30% ACT 12%