Дослідження мікробних ферментів, що утворюються під час комбінованої бактеріальної бродіння та їх біологічної активності ⅲ

Розділ 3 Дослідження антиоксидантної активності ферментів

 

Доведено, що багато людських захворювань пов'язаніАктивні кисневі та вільні радикали, наприкладзапалення, артеріосклероз,старіння, діабет, рактощоНадмірні вільні радикалиВ організмі може спричинити денатурацію білка, пошкодження клітин та смерть і навіть патологічні зміни в організмі. Тому багато досліджень вдома та за кордоном шукають продукти, багаті натуральними антиоксидантними інгредієнтами для запобігання та регулювання захворювань, спричинених вільними радикалами за допомогою дієти. Сьогодні зі збільшенням рівня життя люди поступово переміщують свою увагу на власні тіла, тому все більше і більше продуктів охорони здоров'я виникають у нескінченному потоці. Однак бути по -справжньому корисним непросто. Ферменти - це своєрідна їжа, яка може бути виготовлена ​​сам у житті людей. Вартість не дуже висока і є багато переваг.
Мікробні ферменти мають різноманітні функції для здоров'я, такі як антибактеріальні та протизапальні, сприяють метаболізму, поліпшення імунітету, відбілювання та проти старіння, детоксикації та протиракову. В даний час існує порівняно небагато досліджень щодо антиоксидантних властивостей мікробних ферментів вдома та за кордоном, тому ми плануємо провести поглиблені дослідження на них. У цьому документі є яблучний фермент як об'єкт дослідження, і використовує загальний вміст фенолу, зменшуючи потужність, DPPH · Вільні радикали, · OH Вільні радикали, Супероксид вільних радикалів та здатність до вивільнення вільних радикалів як індекси визначення для проведення всебічного та систематичного дослідження яблучного ферменту після бродіння протягом 3 місяців. Були вивчені склад та вміст антиоксидантних діючих інгредієнтів, і його антиоксидантна активність була зрозуміла.

Нові трави Cistanche з набагато більш проти окислювальної сили, ніж бактерії бродіння

Служба підтримуючої служби Wecistanche-найбільший експортер Cistanche в Китаї:
Електронна пошта: wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp/Тел: +86 15292862950

 

 

 

 

3.1 Матеріали та методи

3.1.1 Матеріали

(1) Експериментальні матеріали
Вимийте свіжі яблука стерильною водою в стерильних умовах, природним чином висушіть їх у стерильному операційному столі, очистіть їх та наріжте для подальшого використання. Додайте білий цукор і яблука в стерилізовану скляну банку при масовому співвідношенні 1: 1. Активуйте бактерії, необхідні для експерименту, і прищеплюйте їх у фермент відповідно до оптимальної схеми (цей крок операції опущена в контрольній групі), закладіть її та покладіть у прохолодне і сухе місце. Після 3 Візьміть супернатант як експериментальний зразок, і центрифугуйте зразок при 10000 об / хв протягом 15 хвилин у високошвидкісній центрифузі, перш ніж визначити відповідні дані. Варто зазначити, що в процесі створення ферментів, щоб уникнути непотрібного забруднення, всі наші операції проводяться в стерильних умовах.

(2) Основні інструменти
Спектрофотометр: v -1100, Шанхайська фабрика наукових інструментів;
Постійна температурна водяна баня: HH -2, Wuhan Litian Technology Instrument Co., Ltd. Інші інструменти такі ж, як 2.1.3.

3.1.2 Методи

(1) Визначення загального вмісту фенолу [53]
① Підготовка стандартної кривої:
Актурно зважуйте {{0}}. Візьміть 8 чисті 1 {{1 0}} мл об'ємні колби, додайте 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2 та 1,4 мл стандартного розчину галової кислоти відповідно до позначки з дистильованою водою, що додає 1 мл на трієві на 1 мл. Хв., Охолоджуйте і розведіть до 20 мл, а також поставте при кімнатній температурі протягом 30 хв. Використовуйте спектрофотометр для вимірювання поглинання А на довжині хвилі 650 нм, і намалюйте стандартну криву з поглинанням a як горизонтальна осі та концентрація зразка як вертикальну осі. ② виявлення
Додати дистильовану воду до 100 мкл, 200 мкл, 300 мкл, 400 мкл та 500 мкл зразків для зразків до 46 мл, потім додайте 1 мл реагенту на фолінол, рівномірно, реагує на 3 хв. Спектрофотометр. Загальний вміст фенолу виражається як еквіваленти галлової кислоти, а загальний вміст фенолу обчислюється відповідно до стандартного рівняння кривої.

(2) Редукційний аналіз [54]
Додайте 1 0 0 мкл, 2 0 0 мкл, 300 мкл, 400 мкл та 500 мкл зразка до 2,5 мл фосфатного буфера з концентрацією 0,2Mol/L та рН значенням 6,6, а потім додаванням 2,5 м. 50 градусів протягом 30 хвилин. Потім додайте 2,5 мл трихлороцтової кислоти (мас./Об.) З масовою концентрацією 10%, а центрифуга при 3000 об/хв протягом 10 хвилин у високошвидкісній центрифузі. Відразу після виходу візьміть 2,5 мл супернатанту в об'ємну колбу, додайте 2,5 мл дистильованої води та 0,5 мл хлориду заліза (мас./Об.) З масовою концентрацією 0,1%. Використовуйте дистильовану воду як порожній контроль і вимірюйте поглинання А на довжині хвилі 700 нм за допомогою спектрофотометра. Силу зменшення потужності можна судити за значенням поглинання. Чим вище значення поглинання, тим сильніше зменшуюча потужність.

 

(3) Визначення ефекту від очищення вільних радикалів супероксиду [55]

Візьміть 4,5 мл 0. 0 5 моль/л рН 8.2 буфер Tris-HCl і попередньо розігрійте його на 25-градусій водяній бані на 2 0 хв. Додайте 1 мл розчину зразка ферменту з концентраціями 10%, 20%, 30%, 40%та 50%та 0,4 мл розчину 25 ммоль/л пірогаллолу. Добре перемішайте і реагуйте на 25 -градусну водяну баню протягом 5 хв. Додайте 1,0 мл 8 моль/л HCl для припинення реакції. Використовуйте буфер Tris-HCl як еталон і використовуйте спектрофотометр для вимірювання поглинання А на довжині хвилі 299 нм для обчислення швидкості очищення. Для порожньої контрольної групи використовували 1 мл розчинника замість зразка. Швидкість від очищення O {{2- обчислювалася відповідно до Формули 3.1: o 2- Швидкість очищення (%)=(A 1- A2)/A1 × 100 (3.1), де: A1 - це поглинання порожньої трубки; A2 - поглинання зразка.

(4) Визначення впливу на очищення на гідроксильні радикали [56]

100μL, 200μL, 300μL, 400μL, 500μL sample solution was added with water to 2mL, then added to 1.4mL of hydrogen peroxide with a molar mass concentration of 6mmol/L, then added with 0.6mL of sodium salicylate with a molar mass concentration of 20mmol/L and 2mL of ferrous sulfate with a molar mass concentration of 1,5 ммоль/л і нагрівається на постійній температурній водяній бані на 37 градусів протягом 1 год. Відрегулюйте до нуля з дистильованою водою та виміряйте поглинання А на довжині хвилі 562 нм за допомогою спектрофотометра. Виконайте 3 повторення для кожного лікування. Обчисліть швидкість очищення гідроксильних радикалів відповідно до Формули 3.2: Швидкість очищення гідроксильних радикалів (%)=[(A 1- A2)/A1] × 100 (3.2) де: A1 - середня поглинання порожнього; A2 - середня абсорбція розчину зразка. (5) Визначення ефекту від очищення вільних радикалів DPPH [57]

Нові трави Cistanche з набагато більш проти окислювальної сили, ніж бактерії бродіння

 

Точно піпетка 2 мл розчину зразка ферменту з концентраціями 1 0%, 20%, 30%, 40%та 50%у 10 мл об'ємної колби, потім додайте 2 мл водного розчину етанолу DPPH до об'ємної колби. Концентрація молярної маси - 2 × 10-4 моль/л. Після перемішування дайте йому стояти при кімнатній температурі протягом 30 хв. Використовуючи 80% розчину етанолу як еталон, вимірюйте поглинання зразка на довжині хвилі 517 нм, що реєструється як А1. Змішайте 2 мл розчину DPPH та 2 мл розчину етанолу з масовою концентрацією 80% і вимірюють їх поглинання на одній довжині хвилі, яка реєструється як A0. Змішайте 2 мл розчину ферменту та 2 мл розчину етанолу з масовою концентрацією 80% і вимірюють їх поглинання на одній довжині хвилі, яка реєструється як A2. Обчисліть швидкість очищення вільних радикалів DPPH відповідно до формули 3.3:
Швидкість відмови від вільних радикалів (%) {{0}} [1- (a 1- a2)/a 0] × 100 (3.3), де: A1 - це поглинання 2 мл DPPH 80% етанол -рішення та 2 ml enzyme enzyme; A2 - поглинання змішаного розчину 2 мл ферменту та 2 мл 80% етанолу за допомогою масової концентрації; A0 - поглинання змішаного розчину 2 мл розчину DPPH і 2 мл 80% етанолу за допомогою масової концентрації.

(6) Здатність від очищення вільних радикалів [58]
Додайте певну кількість сульфату калію до 7 ммоль/л розчину ABT, поки кінцева концентрація змішаного розчину не становить 2,45 ммоль/л. Помістіть змішаний розчин у прохолодне і сухе місце при кімнатній температурі на 12 - 16 годин. 1 мкл, 3 мкл, 5 мкл, 7 мкл та 9 мкл розчину зразка доповнювали до 10 мкл 5 ммоль/л фосфатного буфера pH7,4, а потім рівномірно змішували з 10 мл вищевказаного сульфату калію та змішаний розчин ABT, і далили реагувати при температурі реакції 30 градусів і реакцією 5 хв. Нуль з дистильованою водою та виміряйте поглинання А на довжині хвилі 734 нм за допомогою спектрофотометра. Обчисліть швидкість очищення вільних радикалів ABTS відповідно до формули 3.4:
Швидкість від очищення вільних радикалів (%)=[(A 1- A2)/A1] × 100 (3.4) де: A1 - поглинання порожньої контрольної групи; A2 - поглинання експериментальної групи

 

3.2 Результати та аналіз

3.2.1 Загальний вміст фенолу

(1) Стандартна крива
Стандартна крива загального вмісту фенолу була намальована з концентрацією галової кислоти як горизонтальної осі та значення поглинання a як вертикальна вісь, як показано на малюнку 3.1.

 

Рис.3.1 Стандартна крива загального вмісту фенолу

З фіг.3.1 ми можемо побачити, що стандартне рівняння кривої є y =11. 375x +0. 2593 (x - концентрація зразка, y - поглинання), r 2=0. 9981.

(2) Визначення зразків

Результати загального визначення вмісту фенолу для ферментів яблук у контрольній групі та експериментальній групі в різних концентраціях показані на фіг.3.2.

 

 

 

Рис.3.2 Крива загального фенольного вмісту

Як показано на фіг.3.2, ферменти яблук як у контрольній групі, так і в експериментальній групі мають високий загальний фенольний вміст, і обидва збільшуються зі збільшенням кількості доданого розчину зразка. У цьому ж градієнті концентрації загальний фенольний вміст ферменту яблука в контрольній групі збільшувався з 0. Загальний фенольний вміст експериментальної групи набагато вищий, ніж у контрольної групи, і тенденція вгору більш очевидна. Відповідно до загального фенольного вмісту, загальна антиоксидантна активність експериментальної групи більша, ніж у контрольної групи.

 

3.2.2 Зменшення потужності

Результати зменшення визначення потужності ферментів яблук у контрольній групі та експериментальній групі в різних концентраціях показані на малюнку 3.3.

 

Як показано на малюнку 3.3, зміна тенденції зниження потужності яблучних ферментів аналогічна зміні тенденції загального вмісту фенолу. Знижена потужність експериментальної групи вища, ніж у контрольній групі, і будь то експериментальна група чи контрольна група, в межах діапазону концентрацій, представленого в експерименті, зменшення потужності показує зростаючу тенденцію зі збільшенням кількості доданого розчину зразка. Експериментальні дані також підтвердили, що з точки зору зниження потужності антиоксидантна активність експериментальної групи більша, ніж у контрольної групи.

 

 

3.2.3 Здатність до очищення вільних радикалів супероксиду аніона

Результати спроможності яблучного ферменту в вільних радикалах супероксид -аніонних ферментів у контрольній групі та експериментальній групі в різних концентраціях показані на малюнку 3.4.

Як показано на малюнку 3.4, існує велика різниця у здатності до викидання вільних радикалів супероксиду аніонів між експериментальною групою та контрольною групою. У межах діапазону концентрацій, представлених в експерименті, здатність експериментальної групи супероксид -аніона експериментальної групи змінюється найбільш суттєво, коли концентрація зразка становить 10%до 20%, а зміна не очевидна після концентрації більше 20%; Коли концентрація становить 50%, здатність до викидання вільних радикалів супероксиду становить до 85,4%. Здатність від очищення вільних радикалів суперроксиду, показана контрольною групою, може бути чітко видно з таблиці трендів. Зі збільшенням концентрації ферменту ця здатність до очищення вільних радикалів також збільшується, повільно змінюється і поступово має тенденцію до стабільного стану. Здатність відлякування досягає максимум 42,6%. Експериментальна група майже вдвічі перевищує контрольну групу.

 

 

3.2.4 Здатність до очищення вільних радикалів

Зміни здатності до очищення вільних радикалів ферментів яблук у контрольній групі та експериментальній групі в різних концентраціях показані на рис. 3.5.

 

 

Рис.3.5 Крива очищення гідроксильних вільних радикалів

 

З рис. 3.5 видно, що в діапазоні концентрацій, представленого в експерименті, здатність до очищення гідроксильних ферментів у експериментальній групі та контрольна група зростала зі збільшенням додаткової кількості. Здатність від очищення вільних радикалів експериментальної групи була нижчою, ніж у контрольної групи, і вона працювала дуже погано в низьких концентраціях. При високих концентраціях здатність до очищення гідроксильних вільних радикалів значно зросла. Причиною може бути те, що під час процесу бродіння типи та вміст мікроорганізмів у ферментах яблук в експериментальній групі та контрольній групі були різними, а вміст вторинних метаболітів та компонентів кожного продукту, виробленого ферментацією, були різними, тому показана антиоксидантна здатність була різною.

 

3.2.5 DPPH · Здатність до очищення вільних радикалів

Порівняно з іншими методами виявлення, здатність до очищення вільних радикалів широко використовується для оцінки антиоксидантної активності за короткий проміжок часу [59]. Здатність від очищення вільних радикалів у різних концентраціях була побудована відповідно до результатів контрольної групи та експериментальних ферментів Apple, як показано на малюнку 3.6.

Як показано на малюнку 3.6, коли концентрація контрольної групи яблучного ферменту була нижчою за 30%, здатність до викидання вільних радикалів DPPH · Експериментальна група яблучного ферменту також показала більш високу здатність до викидання DPPH · вільних радикалів у низьких концентраціях. Експериментальні результати показують, що додавання Aspergillus oryzae, дріжджів, термофільного стрептокока та болгарського лактобакіла корисні для здатності до викиду вільних радиків ферменту. Коли концентрація ферменту становить 50%, ця здатність до 91,4%, що набагато вище, ніж 69,8%контрольної групи в одній концентрації.

 

3.2.6 ABTS Радикальна здатність

Результати ємності відбиття радикалів ABTS у контрольній групі та експериментальній групі в різних концентраціях показані на рис. 3.7.

Рис.3.7 Крива ємності ABT
З рис. 3.7 видно, що швидкість очищення ферментів яблук в експериментальній групі вища, коли кількість додавання ферментів перевищує 5 мкл. Дослідження Erel et al. показали, що здатність до очищення радикалів ABTS багато в чому залежить від більш високої концентрації фенольних речовин [60]. Результати загального визначення вмісту фенолу показали, що загальний вміст фенолу експериментальної групи був вищим, ніж у контрольної групи. Експериментальний призводить до рис. 3.7 просто перевірила, що здатність до очищення радикалів ABTS більша, ніж у контрольної групи.

 

3.3 Підсумок цієї глави

У цій главі вивчається взаємозв'язок між антиоксидантною активністю яблучних ферментів, що утворюються за допомогою бродіння з чотирма вибраними штамами яблук, концентрацією зразків ферментів та порівнянням активних компонентів антиоксидантів та здатністю до викидання вільних радикалів між експериментальною групою та контрольною групою. Експериментальні результати показують, що загальний вміст фенолу в ферменті яблука в контрольній групі нижчий, ніж в експериментальній групі, а її зменшення потужності, вільні радикали аніонів супероксиду, вільні радикали DPPH та здатність до викидання вільних радикалів, що є кращими, ніж у контрольній групі; Фермент у контрольній групі має особливо хорошу здатність до очищення гідроксильних вільних радикалів.
Загалом, експериментальна група виявляла більш високу антиоксидантну активність, яка ще більше підтвердила доцільність штучного додавання штамів для виготовлення мікробних ферментів. Таким чином, мікробні ферментні продукти мають більше речовин, сприятливих для здоров'я людини на основі первісного природного бродіння, і можуть краще розвиватися в напрямку, який очікують люди.