13-тижневе дослідження субхронічної токсичності 2-(l-ментокси)етанолу на щурах F344

вступ

2-(1-ментокси)етанол (номер CAS 38618-23-4) — це прозора безбарвна рідина з характерним запахом, яка широко використовується як ароматизатор. Спільний комітет експертів ФАО/ВООЗ з харчових добавок (JECFA) оцінив 2-(l-метокси)етанол як ароматизатор, класифікований як речовини, структурно споріднені ментолу1. На основі структурного класу ароматизаторів 2-(l-метокси)етанол було віднесено до класу I. У Сполучених Штатах і Європі рівень споживання 2-(l-метоксиЗа оцінками, споживання етанолу людьми становило 12 мкг/особу/день і 0,01 мкг/особу/день відповідно, обидва нижче порогу класу I у 1800 мкг/особу/день. На основі цих оцінок вважається, що 2-(1-ментокси)етанол може не викликати занепокоєння щодо безпеки під час звичайного використання як ароматизатора.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ СТАТЕВОЇ ФУНКЦІЇ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(1-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 мг/кг маси тіла [BW])1. Незважаючи на використання 2-(1-ментокси)етанолу як ароматизатора, доступні обмежені дані щодо токсичності повторних доз цієї сполуки. Наша лабораторія досліджувала токсичність кількох харчових добавок, включаючи типові ароматизатори з кожної категорії, на моделях гризунів2–7. Щоб уточнити токсикологічний профіль і встановити рівень відсутності побічних ефектів (NOAEL), ми провели 13-тижневе дослідження субхронічної токсичності 2-(1-ментокси)етанолу, яке було перорально вводити щурам F344 через зонд.

Матеріали та методи

Випробувана хімія

2-(1-ментокси)етанол (партія № 5I0002, чистота 99,9%) виробництва Takasago Int. Corp. (Токіо, Японія) було надано Відділом стандартів та оцінки Департаменту безпечності харчових продуктів Міністерства охорони здоров’я, праці та соціального забезпечення Японії за підтримки Японської асоціації смакових та ароматичних матеріалів (Токіо, Японія). Хоча досліджувану речовину було надано як суміш оптичних ізомерів (CAS № 38618-23-4), виробник підтвердив її як l-енантіомер (CAS № 75443-64-0). Через нерозчинність у воді та леткість 2-(1-ментокси)етанолу було обрано оральний зонд із застосуванням кукурудзяної олії (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Японія) як транспортного засобу. Розчини 2-(1-ментокси)етанолу готували щодня, безпосередньо перед введенням. Після зберігання протягом 2 годин при кімнатній температурі залишкові співвідношення 2-(1-ментокси)етанолу в розчині 4, 40 і 400 мг/мл були підтверджені як 96,8%, 99,8% і 96,5% , відповідно, за допомогою газової хроматографії (Японська інспекційна асоціація харчових продуктів і навколишнього середовища харчової промисловості, Токіо, Японія).

Піддослідні тварини

Загалом 40 самців і 40 самок щурів, вільних від специфічних патогенів (F344/DuCrlCrlj, 5 тижнів), було придбано в Charles River Laboratories Japan (Йокогама, Японія) і використано після акліматизації протягом одного тижня. Під час дослідження тварин утримували в полікарбонатних клітках з м’якою підстилкою, утримували в кімнаті з бар’єрною системою для контролю циклу світло/темрява (12 год), вентиляції (швидкість повітрообміну 18 разів/год), температури ( 24 ± 1 градус) і відносної вологості (55 ± 5%). Клітки та підстилку міняли двічі на тиждень. Кожна тварина мала вільний доступ до водопровідної води та основної дієти (CRF-1; Oriental Yeast, Токіо, Японія). На початку експерименту тварин випадковим чином розподілили на чотири групи по 10 самців і самок щурів у кожній на основі маси тіла, виміряної безпосередньо перед початком обробки досліджуваним хімікатом.

Вивчати дизайн

У попередньому {{0}}-денному дослідженні оцінювання 2-(1-ментокси)етанолу в дозах 0, 200, 400 і 800 мг/кг маси тіла/ день, абсолютна та відносна маси печінки були значно збільшені в усіх групах лікування обох статей (дані не показані). На основі цих результатів ми вибрали дози 2-(1-ментокси) етанолу 0, 15, 60 і 250 мг/кг маси тіла/день для введення як самцям, так і самкам щурів у даний час {{ 13}}тижневе дослідження токсичності.

Загальний стан і смертність оцінювали щодня. Масу тіла, а також кількість поставленої та залишкової дієти вимірювали один раз на тиждень протягом експериментального періоду. Усіх щурів голодували протягом ночі після завершення лікування, а зразки крові для гематології та біохімії сироватки відбирали з черевної аорти під глибоким інгаляційним наркозом з використанням ізофлурану. Дизайн дослідження відповідав Керівництву щодо призначення харчових добавок і перегляду стандартів використання харчових добавок Японії (1996) і схвалений Комітетом з догляду та використання тварин Національного інституту наук про здоров’я Японії.

Гематологія та біохімія сироватки

Наступні гематологічні параметри аналізували за допомогою автоматичних гематологічних аналізаторів ProCyte Dx (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, США): кількість лейкоцитів (WBC), кількість еритроцитів (RBC), концентрація гемоглобіну (HGB), гематокрит (HCT), середній корпускулярний об’єм (MCV), середній корпускулярний гемоглобін (MCH), середня корпускулярна концентрація гемоглобіну (MCHC), кількість тромбоцитів (PLT) і диференціальні лейкоцитарні клітини, включаючи нейтрофіли (Neut), лімфоцити (Lymph), моноцити (Mono), еозинофіли (Eosino), і базофіли (Baso). Біохімічний аналіз сироватки проводили Oriental Yeast для наступних параметрів: загальний білок (TP), альбумін (Alb), співвідношення альбумін/глобулін (A/G), загальний білірубін (Bil), глюкоза, загальний холестерин (T-Chol), тригліцериди (TG), азот сечовини (BUN), креатинін (Cre), кальцій (Ca), неорганічний фосфор (IP), натрій (Na), калій (K), хлор (Cl), аспартатамінотрансфераза (AST), аланінамінотрансфераза (ALT), лужна фосфатаза (ALP) і -глутамілтранспептидаза (-GTP).

Вага органів і гістопатологічна оцінка

Для всіх тварин було проведено повне розтин, а також зважено мозок, тимус, легені, серце, селезінку, печінку, надниркові залози, нирки, яєчка та яєчники. Ці органи, а також тканини спинного мозку, трійчастого нерва, гіпофіза, порожнини носа, слинних залоз, язика, стравоходу, трахеї, аорти, щитовидної залози, паращитовидної залози, підшлункової залози, шлунка, тонкої та товстої кишок, підщелепної та брижової лімфатичні вузли, піхву, матку, сечовий міхур, передміхурову залозу, насіннєві бульбашки, придаток яєчка, стегнову кістку та грудину з кістковим мозком, хребці, скелетні м’язи, сідничний нерв, шкіру та молочну залозу фіксували в 10% формаліні з нейтральним буфером; потім готували зрізи, залиті парафіном, і фарбували їх гематоксиліном і еозином для гістопатологічного дослідження. Яєчка та очі з хардерівськими залозами фіксували відповідно у фіксаторі Буена та розчині Девідсона. Кісткові тканини, включаючи носову порожнину, хребці, грудину та стегнову кістку, декальцинували за допомогою суміші 10% мурашиної кислоти та 10% забуференого формаліну протягом 2 тижнів. Гістопатологічну оцінку проводили для всіх тканин, отриманих від тварин у контрольній групі та групі, якій вводили найвищу дозу, якщо не спостерігалося будь-яких пов’язаних з лікуванням уражень.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПІДВИЩЕННЯ ІМУНІТЕТУ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Імуногістохімія на 2u-глобулін

У щурів-самців накопичення 2u-глобуліну в нирках досліджували за допомогою імуногістохімічного аналізу залитих парафіном зрізів. Для отримання антигену зрізи, отримані від 5 щурів у кожній групі, інкубували з протеїназою K (DAKO, Glostrup, Данія) протягом 1 хвилини при кімнатній температурі. Усі зрізи занурювали в 3% розчин H2O2/метанол на 10 хв при кімнатній температурі для інактивації активності ендогенної пероксидази. Після блокування неспецифічних реакцій 10% нормальної кролячої сироватки зрізи інкубували з первинним антитілом до 2-углобуліну (розведеним 1:400; антитіло проти щурячого 2u-глобуліну; R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота, США) протягом ночі при 4°C 8. Візуалізацію зв’язування антитіл проводили за допомогою набору VectaStain Elite ABC (Vector Laboratories, Берлінгейм, Каліфорнія, США) і 3,3′-діамінобензидину. Усі зрізи контрастно фарбували гематоксиліном.

Статистичний аналіз

Варіації значень даних для маси тіла протягом експериментального періоду, а також для гематології, біохімії сироватки та маси органів оцінювали на однорідність за допомогою тесту Бартлетта. Односторонній дисперсійний аналіз і тест Крускала-Уолліса, відповідно, використовувалися для однорідних і неоднорідних даних. Для визначення статистично значущих відмінностей використовувався тест множинного порівняння Даннетта для порівняння контрольної та лікувальної груп. Порівняння гістопатологічних випадків і ступенів були проаналізовані з використанням точного ймовірнісного тесту Фішера та U-тесту Манна-Уїтні відповідно. P значення<0.05 were considered statistically significant.

Результати

Прижиттєві параметри, гематологія та біохімія сироватки

Жодних істотних клінічних ознак не було відмічено протягом експериментального періоду, і всі тварини вижили до запланованого розтину. Крім того, не спостерігалося істотних відмінностей у масі тіла та щоденному споживанні їжі у самців і самок щурів (рис. 1A і B).

Дані гематології та біохімії сироватки наведені в таблицях 1 і 2 відповідно. Гематологічні аналізи виявили значне зниження HGB, HCT, MCV і MCH і підвищення PLT у щурів-самців, яким вводили 250 мг/кг маси тіла на день 2-(1-ментокси)етанолу (табл. 1). У біохімії сироватки значне підвищення TP, T-Chol і Ca та зниження Bil і ALP було відзначено у самців групи 250 мг/кг (таблиця 2). Значне збільшення Cre та зниження A/G спостерігали у самців груп 60 та 250 мг/кг. У самок було зареєстровано значне збільшення Ca та зниження ALP у групах 60 та 250 мг/кг, тоді як підвищений T-Chol та знижений A/G, Bil, TG, AST та ALT були виявлені у 250 mg. /кг групи. Незважаючи на те, що у самців, яким вводили 60 мг/кг, спостерігалося значне підвищення ТГ і зниження кліренсу, відсутність зв’язку між дозами свідчить про те, що ці відмінності не були пов’язані з впливом досліджуваної речовини.

Ваги органів

Дані щодо маси органів наведені в таблиці 3. Абсолютна та відносна маси печінки були значно збільшені в обох статей групи 250 мг/кг (таблиця 3). Значне збільшення відносної маси печінки спостерігалося у самців групи 60 мг/кг. У самців абсолютна та відносна маса нирок була значно збільшена в групах 60 та 250 мг/кг. У групі самців 250 мг/кг спостерігалося значне збільшення абсолютної та відносної маси надниркових залоз і відносної маси селезінки та яєчок.

Гістопатологія та імуногістохімія

Дані гістопатологічних та імуногістохімічних результатів підсумовані в таблицях 4 і 5 відповідно. Гістопатологічні дані показали, що частота накопичення еозинофільних гранул (рис. 2A–D), базофільних канальців і гіалінового зліпка, а також фокального інтерстиціального запалення в нирках значно збільшувалася в групах лікування виключно чоловіків порівняно з контролем. групи (табл. 4). Згідно з імуногістохімічним аналізом, щури-самці, які отримували досліджувану речовину, показали підвищення імунореактивності 2u-глобуліну в епітеліальних клітинах проксимальних канальців, демонструючи чітку залежність від дози (рис. 2E–H) (табл. 5).

Під час розтину один самець щура в групі 250 мг/кг продемонстрував серйозне збільшення правої нирки внаслідок гістологічно характерної нефробластоми. Незважаючи на те, що нефробластома рідко зустрічається у більшості ліній щурів9, цей випадок вважався випадковим, оскільки жодна інша тварина не мала подібних уражень. Крім того, у дослідженнях пероральної канцерогенності частота спонтанної нефробластоми у самців щурів F344/DuCrlCrlj, як повідомляється, коливалася в межах 0–2,0%10. Незважаючи на те, що деякі ураження були епізодично виявлені в інших органах, значних залежних від лікування змін у частоті цих уражень не було виявлено.

Обговорення

На сьогоднішній день 24 ароматизатори, включно з 2-(1-ментокси)етанолом, були оцінені JECFA як речовини, структурно пов’язані з ментолом, і всі вони зазначені як «безпека безпека» за поточних оціночних рівнів споживання1, 11. 2-(1-Ментокси)етанол класифікується в підгрупі аліциклічних спиртів або простих ефірів і вважається головним чином кон’югованим з глюкуроновою кислотою, після чого виводиться із сечею1. Хоча значення LD50 цих речовин при пероральному прийомі у гризунів є відносно високими, дані досліджень токсичності повторних доз залишаються обмеженими. 13-Тижневе дослідження токсичності багаторазових доз показало, що ментилпіролідонкарбоксилат (номер CAS 68127-22-0), сполука, структурно споріднена ментолу, може бути пов’язана зі збільшенням відносної маси печінки та нирок у чоловіків і жінок Щури Вістар. Накопичення 2u-глобуліну в проксимальних канальцях самців щурів також спостерігалося при дозі 1111 мг/кг маси тіла/день, а NOAEL було визначено як 109 мг/кг маси тіла/день1.

У поточному 13-тижневому дослідженні субхронічної токсичності 2-(1-ментокси)етанолу не спостерігалося токсикологічних змін загального стану, маси тіла та споживання їжі. Після гематологічної оцінки ми спостерігали зниження HGB (96,6% до контрольних середніх значень), HCT (96,3%), MCV (98,4%) і MCH (98,2%) і збільшення PLT (111%) у чоловіків. 250 мг/кг групи, які вважалися токсикологічними впливами обробки 2-(1-ментокси)етанолом. Як абсолютна (115% у обох статей), так і відносна (119% у чоловіків і 111% у жінок) вага печінки була значно збільшена в обох статей у групах 250 мг/кг. Хоча гістопатологічних змін у печінці не було, підвищені рівні сироваткового T-Chol (110% у чоловіків і 121% у жінок) і TP (105% у чоловіків) і зниження ТГ (60,1% у жінок) у 250 групи мг/кг вказують на токсичні зміни, пов’язані з метаболізмом ліпідів і синтезом білка в печінці. Також було виявлено зниження HGB і MCH і підвищення PLT, T-Chol і TP у чоловіків, а також зниження TG і збільшення абсолютної та відносної маси печінки в обох статей, зі статистичною значущістю в 28--денному попередньому дослідженні (дані не показані) ), підтверджуючи, що ці змінені гематологічні та біохімічні параметри сироватки, а також вага печінки не були випадковими, а пов’язані з досліджуваною речовиною. Навпаки, значне збільшення відносної ваги печінки, виявлене в групі чоловіків 60 мг/кг у цьому дослідженні, не супроводжувалося збільшенням абсолютної ваги або змінами відповідних біохімічних параметрів, що свідчить про те, що це збільшення було адаптивною зміною.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ СТАТЕВОЇ ФУНКЦІЇ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Вважалося, що значне підвищення абсолютної (120%) і відносної (118%) маси надниркових залоз у самців у групі 250 мг/кг було пов’язане з досліджуваною хімікатом. Крім того, збільшення абсолютної та відносної ваги надниркових залоз в обох статей показало чітку залежність від дози в 28--денному попередньому дослідженні (дані не показані), що вказує на зв’язок із обробкою досліджуваними хімікатами. Незважаючи на те, що гіпертрофія надниркових залоз може бути результатом стресу, у нинішніх і попередніх дослідженнях не було виявлено жодних результатів, що свідчать про стрес, таких як зниження збільшення маси тіла або атрофія тимуса та інших лімфоїдних органів. Оскільки гістопатологічні зміни в надниркових залозах можуть бути відсутні навіть при порушенні вироблення глюкокортикоїдів у випадках інгібування ферментів, пов’язаних із стероїдогенезом12, не можна виключити можливість того, що збільшення ваги надниркових залоз є токсичним виявленням. Навпаки, збільшення відносної ваги селезінки та яєчок у самців групи 250 мг/кг, яке не спостерігалося в попередньому дослідженні, вважалося токсикологічно незначним через відсутність гістопатологічних уражень або значного збільшення абсолютної ваги. Подібним чином, біохімія сироватки виявила зниження A/G і підвищення Ca в обох статей, що вважалося таким, що не мало токсикологічного значення, враховуючи, що не було виявлено відхилень у відповідних параметрах. Крім того, зниження рівнів Bil і ALP в обох статей, а також зниження AST і ALT у жінок суперечили очікуваним токсичним ефектам і вважалися незначними.

Хронічна нефропатія, що характеризується базофільними канальцями, гіаліновим зліпком і вогнищевим інтерстиціальним запаленням, спостерігалася зі статистичною значущістю у чоловіків усіх груп лікування. Крім того, підвищений Cre в сироватці крові та абсолютна і відносна вага нирок були виявлені в групах чоловіків 60 і 250 мг/кг; ці зміни не спостерігалися в групах лікування жінок. У цих випадках ступінь накопичення еозинофільних гранул у проксимальних канальцевих епітеліальних клітинах збільшувався очевидно дозозалежним чином. Ці гранули були підтверджені імуногістохімічним дослідженням як 2u-глобулін, що вказує на наявність 2u-глобулінової нефропатії. 2u-глобуліни, пов’язані з певними хімічними речовинами, такими як d-лімонен, накопичуються в лізосомах і спостерігаються в проксимальних канальцях у вигляді еозинофільних або гіалінових гранул9. Це накопичення може пошкодити епітеліальні клітини, що призведе до хронічної прогресуючої нефропатії та подальшого утворення пухлини9. Таким чином, хоча NOAEL для 2-(1-ментокси)етанолу, пов’язаного з 2u-глобуліновою нефропатією в нирках самців щурів, не було визначено, цей тип нефропатії, як повідомляється, є специфічним для самців щурів і, отже, не стосується людини оцінка ризику13. Підвищений ризик ниркової недостатності через механізми, пов’язані з накопиченням 2u-глобуліну, дуже малоймовірний, оскільки цей білок відсутній у людей14. Тому вважалося розумним виключити зміни, пов’язані з хронічною нефропатією, що спостерігаються у чоловіків, із визначення NOAEL.

На завершення, поточне 13-тижневе дослідження субхронічної токсичності продемонструвало, що лікування етанолом 2-(1-ментокси) етанолом у дозі 250 мг/кг маси тіла на день спричинило токсичні зміни в гематології, біохімії сироватки та масі органів у самців і самок щурів F344. На основі спостережуваних результатів NOAEL 2-(1-ментокси)етанолуоцінювали як 60 мг/кг маси тіла/добу для обох статей.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ СТАТЕВОЇ ФУНКЦІЇ PHGS75% ECH 30% ACT 12%