Загальні глікозиди Cistanche Deserticola сприяють відновленню неврологічних функцій шляхом індукції нейроваскулярної регенерації за допомогою шляху Nrf- 2/Keap-1 у щурів MCAO/R-Ⅰ

ВСТУП

Інсульти вважаються основною причиною смертності та інвалідності у світі. Майже 87% усіх випадків інсульту викликані ішемічним інсультом. В даний час це найефективніший засіб і єдиний схвалений FDA препарат, який використовується длялікування ішемічного інсультує рекомбінантним тканинним активатором плазміногену. Однак велика кількість пацієнтів, які перенесли інсульт, не реагують на цей препарат через його вузьке терапевтичне вікно та серйозний ризик геморагічних ускладнень. Основною проблемою тромболітичного лікування є ішемічне/реперфузійне (I/R) ушкодження, яке вважається основною причиною ушкодження головного мозку та порушення функції. Реперфузія після церебральної ішемії підвищує ризик крововиливу в мозок, водночас призводить до нервово-судинного ураження та утворення надмірної кількості активних форм кисню (АФК), що пошкоджує гематоенцефалічний бар’єр. Кілька досліджень підтвердили, що порушення ГЕБ є основною причиною патогенезу ішемічного інсульту.

НАТУРАЛЬНА CISTANCHE TUBULOSA ДЛЯ ЛІКУВАННЯ ІШЕМІЧНОГО ІНСУЛЬТУ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

ГЕБ складається в основному з ендотеліальних клітин, перицитів, астроцитів, нейронів і базальних мембран. Основними компонентами BBB є церебральні мікросудинні ендотеліальні клітини, які об’єднані щільними з’єднаннями, таким чином обмежуючи проникнення екзогенних молекул у мозок. Патологічні зміни щільних з’єднань, зокрема occludin, claudin-5 і zonula occludens-1 (ZO-1) суттєво впливають на функцію ГЕБ під час ішемічного інсульту, особливо на проникність бар’єру. Під час періодів I/R надмірна АФК є одним із основних факторів, що призводять до прямого пошкодження нейронів мозку. Надвиробництво АФК призводить до деградації певних з’єднань і порушення ГЕБ, що призводить до проникнення екзогенних молекул у мозок через ГЕБ, що призводить до погіршення пошкодження мозку. Тому захист ГЕБ антиоксидантами розглядається як потенційний спосіб запобігання реперфузійному пошкодженню.

Крім руйнування BBB, I/R може призвести до нервово-судинного ураження та смерті нейронів. Під час інсульту збільшення загибелі нейронних клітин може бути наслідком окисного стресу, і численні дослідження показали, що АФК посилює тяжкість інсульту та неврологічне пошкодження. Хоча клінічні випробування не дали задовільних результатів, нейропротекція все ще є багатообіцяючою стратегією лікування гострого ішемічного інсульту. Таким чином, пошук ефективних нейропротекторних препаратів для лікування інсульту є перевагою для пацієнтів з інсультом.

Традиційна китайська медицина (ТКМ) вживає заходів для боротьби з внутрішнім дисбалансом організму. Через складний патогенез ішемічних інсультів багатофакторна дія ТКМ та його активних компонентів відіграє вирішальну роль у лікуванні інсультів.Цистанхеdeserticola YC Ma, широко поширена в посушливих або напівпосушливих районах по всій Монголії та Північно-Західному Китаї, була широко використовуваною травою ТКМ для лікування різних захворювань, таких як забудькуватість і депресія, протягом більше ніж 1,{2}} років у Китаї. Сучасні фармакологічні дослідження показали, що неочищені екстракти C. deserticola демонструють численні фармакологічні дії, такі якпокращення функції навчання та пам’яті, нейропротекція, імунітет, антиоксидантний ефект, ефект проти старіння та втоми. Хімічний аналіз C. deserticola показав, що його основні компоненти включаютьфенілетаноїдні глікозиди, іридоїдні глікозиди, полісахариди та олігосахариди. Однак активні компоненти C. deserticola для захисту мозку не дуже зрозумілі.

Нейропротекторна властивість C. deserticola передбачає його терапевтичний потенціал при когнітивних захворюваннях, таких як інсульт і депресія, а також хвороба Альцгеймера. Проте дослідження впливу C. deserticola на інсульти, включаючи його активні компоненти та механізми дії, дуже обмежені. У поточній роботі ми досліджували захисну дію трьох екстрактів C. deserticola, загальних глікозидів (TG, фенілетаноїд глікозидів та інших глікозидів), полісахаридів (PS) і олігосахаридів (OS) на церебральні I/R травми. Наші висновки можуть сприяти точному клінічному застосуванню C. deserticola та стати кандидатом на агенттерапія ішемічного інсульту.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Хімічні речовини та реагенти

Стебла Cistanche deserticola були придбані в Алашані, Внутрішня Монголія, і ідентифіковані одним з авторів (P.-F. Tu). TG, PS та OS були підготовлені згідно з нашим раніше описаним методом. Кількісний аналіз ТГ проводили за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), як описано раніше, і його хроматограма показана на рисунку 1. Основними компонентами ТГ є ехінакозид, тубулозид А, актеозид, ізоактеозид і 2'-ацетилактеозид; їх вміст становить відповідно 163,05 мг/г, 4,125 мг/г, 41,66 мг/г, 22,655 мг/г та 12,045 мг/г. Вміст ФС та ОС становлять 69,42 % та 65,24 % відповідно, визначені ВЕРХ та фенол-сульфатно-кислотним аналізом відповідно.

НАТУРАЛЬНА CISTANCHE TUBULOSA ДЛЯ ЛІКУВАННЯ ІШЕМІЧНОГО ІНСУЛЬТУ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Стандартні зразки ехінакозиду (A0282), тубулозиду A (A0942), актеозиду (A0280), ізоактеозиду (A0281) і 2'-ацетилактеозиду (A0943) були придбані в Chengdu Must Biotechnology. Чистота всіх стандартів становить більше 98%. Набори для фарбування Nissl H&E були куплені в Boster. Едаравон (T0407-1) ​​був придбаний у Target Mol (Шанхай, Китай). Придбано кролячу анти-щурячу MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) та мишачу анти-щурячу CD31 (ab24590) від Abcam Inc. Кролячі протищурячі Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) і Occludin (BS72035) були придбані в Bioworld Technology. Cell Signaling Technology Inc. (Бостон, Массачусетс, США) була джерелом кролячого антищурячого синапсину-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-Smooth Muscle Actin (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) було придбано у Proteintech Group, Inc. Вторинні антитіла були поставлені компанією Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Пекін, Китай). Hoechst 33258 був отриманий від Beyotime.

Тварини

Щури Sprague-Dawley (самці, вагою 250–300 г) були отримані від Vital River Laboratory Animal Technology і поміщені в кімнату з кондиціонером, де тримали 12-годинний цикл світло/темрява. Усі експерименти на тваринах проводилися відповідно до рекомендацій ARRIVE щодо дослідження тварин і були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Наукового центру охорони здоров’я Пекінського університету.

Протоколи експериментів на тваринах

Щурів піддавали MCAO/R, як описано раніше (Wang et al., 2018). Коротко, ліва загальна сонна артерія (CCA), зовнішня сонна артерія (ECA) і внутрішня сонна артерія (ICA) були оголені, і 3-0 нейлоновий мононитковий шов був вставлений з ECA в ICA до досягнення середини мозкової артерії (ММА). Після 1,5 години оклюзії MCA реперфузію моделювали шляхом видалення нитки. Під час хірургічної процедури температура тіла всіх щурів підтримувалася на рівні 37,0 градусів. Ліки

Адміністрація

Щури були випадковим чином розділені на шість груп за допомогою програмного забезпечення SPSS версії 22.0, як описано: нормальна група (NOR); модельна група (MOD); група едаравон (позитивний препарат, 6 мл/кг, EDI); група ТГ (280 мг/кг, ТГ); Група ПС (280 мг/кг, ПС) і група ОС (280 мг/кг, ОС). ТГ, ПС та ОС вводили один раз на день після MCAO/R протягом 14 днів. Групи NOR і MOD отримували фізіологічний розчин. Кількість тварин наведена в таблиці 1.

Вимірювання ваги та оцінка модифікованого неврологічного дефіциту (mNSS)

Масу тіла контролювали на 14-й день за допомогою цифрових ваг ADVENTURE™ (OHAUS, Нью-Джерсі, США). mNSS оцінювали згідно з методом, описаним FJ Wang (Wang et al., 2018), з незначними змінами.

2, 3, 5-Трифенілтетразолій хлорид (TTC) Фарбування

Об'єм інфаркту вимірювали, як описано раніше. Коротше кажучи, мозок був розділений на сім однаково розташованих корональних блоків (2 мм). Ці зрізи фарбували 2% TTC при 37 градусах протягом 15 хвилин. Об’єм інфаркту (%)=(об’єм іпсилатеральної ішемічної півкулі − об’єм контралатеральної ішемічної півкулі)/об’єм контралатеральної ішемічної півкулі × 100.

Фарбування за Нісслем і H&E

Щурів глибоко знеболили, а потім весь мозок швидко вилучили з черепа, зафіксованого за допомогою 4% параформальдегіду, залитого парафіновим воском, і розділеного на шматочки товщиною 7 мкм. Зрізи фарбували Nissl та H&E. У цьому дослідженні шість випадкових полів 200 × 200 мкм були захоплені в кожному зразку тканини за допомогою світлового мікроскопа. Кількість тіл Ніссля підраховували за допомогою програмного забезпечення IPP версії 6.0.

Тест Evans Blue

Щурам вводили 2% EB після MCAO/R. Через дві години щурів анестезували, а потім швидко видаляли весь мозок і гомогенізували в ацетоні. Супернатанти аналізували при 620 нм за допомогою пристрою для зчитування поглинання 800 TS.

Вимірювання активності каталази (CAT), супероксиддисмутази (SOD), малонового діальдегіду (MDA) і глутатіонпероксидази (GSH-Px)

Усі зразки сироватки центрифугували при 4,000 × об/хв протягом 15 хвилин при 4 градусах, а потім аналізували для виявлення активності MDA, CAT, SOD і GSH-Px згідно з інструкціями виробника.

Вестерн-блоттинг

Тканини мозку (100 мг), зібрані від кожного щура, гомогенізували та лізували в буфері для лізису RIPA, а потім аналізували для визначення концентрації білка за допомогою набору BCA. Сумарні білки тканини завантажували на 10% гелі SDS-PAGE і переносили на нітроцелюлозну мембрану. Мембрану блокували за допомогою 5% знежиреного молока, потім інкубували протягом ночі з первинними антитілами при 4 градусах. Потім мембрану інкубували з вторинним антитілом. Вестерн-блот-аналіз аналізували за допомогою системи цифрового зображення Kodak.

Імунофлуоресцентний аналіз

Було проведено імунофлуоресцентне фарбування на CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 і Keap-1. Первинні антитіла проти Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 і Keap-1 були розведені до 1 :200 і 1:100 відповідно. Вторинні антитіла Alexa Flur 488 мишачий антикролячий IgG і родамін (TRITC) козячий антикролячий IgG були розведені до 1:200. Ядра фарбували за допомогою Hoechst 33258. Зображення отримували за допомогою автоматизованої системи кількісної візуалізації патології Vectra® Polaris™ (PerkinElmer, США). Експресію білка аналізували за допомогою програмного забезпечення IPP версії 6.0. Статистичний аналіз

Усі дані були описані як середнє ± SD. Для статистичного аналізу було виконано програмне забезпечення SPSS версії 22.0. Односторонній дисперсійний аналіз використовувався при порівнянні різних груп. P < 0.05 вважалося статистичною різницею.

НАТУРАЛЬНА CISTANCHE TUBULOSA ДЛЯ АНТИІШЕМІЧНОЇ ХВОРОБИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

РЕЗУЛЬТАТИ

ТГ збільшують масу тіла та зменшують пошкодження мозку у щурів MCAO/R

Після 14 днів лікування TGs, PSs, Oss та EDI оцінювали масу тіла, неврологічні дефіцити та об’єм інфаркту I/R щурів. Результати показали, що маса тіла в групі MOD була значно зменшена, тоді як зменшена вага в групах TGs, PSs та EDI була збільшена (Малюнок 2A). Показники неврологічного дефіциту були суттєво знижені за EDI та TG (рис. 2B). Зрізи мозку у щурів групи NOR були насичено-червоними і інфарктів не було, тоді як у щурів групи MOD спостерігався великий іпсилатеральний інфаркт мозку. Після лікування ТГ обсяги інфаркту значно зменшилися (рис. 2C, D). Лікування PSs та OSs не показало явного впливу на вищезазначені показники. Наведені вище дані показали, що тригліцериди можуть помітно полегшити церебральне ураження, спричинене I/R, але PS та OS не можуть.

ТГ покращують гістопатологічні пошкодження у щурів MCAO/R

Щоб визначити деякі ефекти лікування TG, PS та OS на гістопатологічні пошкодження, було проведено фарбування H&E, щоб виявити патологічні пошкодження. Гістоморфологічні структури мозку в групі NOR були розташовані закономірно. Морфологічні зміни в групах ТГ були меншими, ніж у групі MOD. Однак у групах лікування PS та OSs не було виявлено значного покращення морфологічних змін (рис. 3).

ТГ послаблюють пошкодження нейронів після I/R-індукованих щурів

Фарбування за Нісслем показало гістопатологічні зміни нейронів півтіні ішемічної ділянки. Як показано на малюнку 4, нормальні нейрони мали чітке ядерце та непошкоджену структуру. У групі MOD нейрони мали збільшені міжклітинні простори. Тіла nissl зникли, зморщені й глибоко забруднені. Однак ці зміни рідко спостерігалися в групах EDI, TGs і PS. Ці результати показали, що ТГ і ФС можуть значною міроюпослабити ішемію/індуковане реперфузією пошкодження нейронів.

ТГ пом'якшують порушення ГЕБ після I/R-оброблених щурів

Тест Evans blue є класичним методом дослідження зміни проникності ГЕБ. Результати експерименту показали, що збільшення синього Еванса спостерігалося в групі MOD, тоді як у щурів, які отримували ТГ та EDI, спостерігалося значне зниження синього Еванса. Крім того, не було істотної різниці між групами терапії ПС та ОС (рис. 5). Ці результати свідчать про те, що тригліцериди можуть значно послабити порушення ГЕБ.

ТГ сприяють ангіогенезу у щурів з I/R травмами

Останні дослідження показують, що ангіогенез відіграє вирішальну роль у неврологічному функціональному відновленні та прогностичних результатах після гострого ішемічного інсульту (Yuen та ін., 2015). Щоб оцінити вплив ТГ, ФС та ОС на ангіогенез, для кількісного визначення капілярних чисел використовували CD31 та a-SMA. Імунофлуоресцентне фарбування показало, що група MOD викликала значне зниження експресії CD31 (рис. 6A, B) і a-SMA (рис. 6C, D) у напівтіні ішемічних ділянок щурів I/R порівняно зі здоровими щурами. . Цей результат продемонстрував, що I/R може спричинити пошкодження судин у напівтіні кори ішемічних півкуль. Однак лікування ТГ та EDI помітно збільшило щільність капілярів, ангіогенез та артеріогенез, на що вказує підвищена експресія CD31 та a-SMA. Ці результати свідчать про те, що тригліцериди можуть сприяти ангіогенезу в ішемічній напівтіні I/R щурів, але PS і OS не можуть.

ТГ збільшують експресію білків щільного з’єднання у щурів з I/R травмами

Порушення ГЕБ може підвищити вміст води в мозку та набряк тканин, що призведе до травми мозку. Білки щільного з’єднання є важливими структурними компонентами ГЕБ. Щоб перевірити, чи може лікування ТГ, ПС і ОС після інсульту впливати на цілісність ГЕБ, експресію ZO-1, клаудин-5 і оклюдин було проведено за допомогою імунофлуоресцентного аналізу. Результати показали, що експресія claudin-5, occludin та ZO-1 була помітно знижена в групі MOD. Однак вони суттєво зросли через 14 днів його прийому. Групи PSs та OSs не показали значних змін у експресії цих білків (рис. 7). Ці дані вказують на те, що ТГ можуть регулювати експресію білка щільного з’єднання та, ймовірно, підтримувати цілісність ГЕБ після травми I/R.

ТГ збільшують покриття капілярів перицитами у щурів з I/R травмами

Перицитне покриття капілярів відіграє вирішальну роль у підтримці цілісності ГЕБ. Таким чином, ми перевірили, чи можна збільшити покриття перицитів за допомогою лікування ТГ, ФС та ОС. Результати аналізу інтенсивності імунофлуоресценції показали, що експресія як PDGFRb, так і CD31 була різко знижена в групі MOD. Введення ТГ щурам I/R значно відновлювало або навіть підвищувало інтенсивність експресії PDGFRb і CD31, але різниці не спостерігалося в групах лікування PSs і OSs (рис. 8). Таким чином, лікування ТГ може значно збільшити покриття перицитів. Ці висновки додатково підтвердили, що ТГ можуть підтримувати цілісність ГЕБ після I/R.

НАТУРАЛЬНА CISTANCHE TUBULOSA ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИ ІШЕМІЧНОГО ІНСУЛЬТУ PHGS75% ECH 30% ACT 12%