ali.ma@wecistanche.com

Створення паралельної експериментальної моделі остеопорозу в поєднанні з хворобою Альцгеймера у щурів і подвійної дії ехінакозиду та актеозиду з Cistanche tubulosa

Йі Чена та ін

АНОТАЦІЯ

Етнофармакологічна актуальність: Цистанка трубчастаце дорогоцінна традиційна китайська медицина, яка широко використовується для лікування остеопорозу тахвороба Альцгеймера. Ехінакозид і актеозид є основними діючими компонентамиЦистанка трубчастаякі мають фармакологічну діяльність із дослідницьким значенням. Було повідомлено, що ехінакозид і актеозид можуть покращити здатність до навчання та пам’яті, сприяти проліферації та диференціації остеобластів.

Мета дослідження: ехінакозид і актеозид зЦистанка трубчастапоказали значну активність проти остеопорозу та анти-хвороба Альцгеймера, хоча ці ефекти не вивчалися одночасно на моделі щурів. Метою цього дослідження було встановити та перевірити модель остеопорозу в поєднанні зхвороба Альцгеймерана щурах і досліджувати подвійні ефекти ехінакозиду та актеозиду на цій паралельній моделі.

Матеріали та методи:Одночасно було встановлено три модельні групи оваріектомії (OVX), фіктивної хірургії з D-галактозою та AlCl3 (D), оваріектомії з D-галактозою та AlCl3 (OVX плюс D). Щурам у групах лікування препаратом видаляли яєчники. При внутрішньоочеревинному введенні D-галактози та внутрішньошлунковому введенні AlCl3 щурам груп лікування препаратом перорально вводили ехінакозид (90 мг/кг/добу), актеозид (90 мг). /кг/день) і препарати позитивного контролю естрадіолу валерат (0,6 мг/кг/день), донепезил HCl (0,8 мг/кг/день) відповідно. Після лікування препаратом протягом 8 тижнів спочатку було проведено тест на водний лабіринт Морріса (MWM) протягом 6 днів. Потім щурів умертвили для збору крові, матки, стегнової кістки, великогомілкової кістки та тканин мозку. Сироватку використовували для біохімічних досліджень. Матки використовували для гістоморфометрії. Праву стегнову кістку використовували для мікро-КТ та гістоморфометрії відповідно. Для біомеханічного тесту використовували праву гомілкову кістку. Гіпокамп, зібраний в крижаній камері, використовувався для біохімічних тестів. Мозок, зібраний шляхом перфузії, використовували для гістоморфометрії.

Результати:У порівнянні з групою Sham, група OVX плюс D могла значно знизити здатність до навчання та пам’яті, викликаючи окислювальне пошкодження, порушуючи нейрони в гіпокампі та впливаючи на гідроліз і синтез ацетилхоліну. Тим часом активність BALP і TRAP у групі OVX плюс D значно зросла (P < {{0}}.001)="" порівняно="" з="" групою="" шам.="" крім="" того,="" порівняно="" з="" групою="" sham,="" середня="" мінеральна="" щільність="" кісткової="" тканини="" явно="" знизилася="" (p=""><0,05), трабекулярна="" кісткова="" маса="" та="" мікроархітектура="" також="" були="" значно="" зруйновані="" в="" групі="" ovx="" плюс="" d.="" крім="" того,="" максимальне="" навантаження="" та="" максимальний="" стрес="" значно="" зменшилися="" (p=""><0,01), а="" поглинання="" енергії="" також="" значно="" зменшилося="" порівняно="" з="" групою="" шам.="" після="" введення="" ехінакозиду="" та="" актеозиду="" типові="" патологічні="" ознаки="" остеопорозу="">хвороба Альцгеймерабули покращені.

Висновки: Модель остеопорозу в поєднанні зхвороба Альцгеймерана щурах було здійсненним і успішно встановленим. Ехінакозид і актеозид також продемонстрували певний значний вплив на цю паралельну модель, і вони могли бути потенційними кандидатами відЦистанка трубчастаз подвійними ефектами для подальшого вивчення.

Ключові слова:Остеопороз,хвороба Альцгеймера, Подвійні ефекти,Ехінакозид, Актеозид, Цистанка трубчаста

Цистанка трубчастадляхвороба Альцгеймера

Натисніть, щоб Cistanche UK

1. Введення

Остеопороз — це дегенеративне захворювання кісток, що характеризується прогресуючою втратою кісткової маси та руйнуванням мікроархітектури, що може підвищити ризик крихкості переломів (Rachner et al., 2011).хвороба Альцгеймера(AD) є поширеним нейродегенеративним захворюванням у людей похилого віку, яке характеризується безперервним погіршенням психіки, когнітивними порушеннями та втратою здатності до незалежного життя в клінічних умовах (Reitz et al., 2011). Утворення старечих бляшок, викликане відкладенням -амілоїду, нейрофібрилярні клубки, викликані гіперфосфорилюванням тау, і нейрональна дегенерація в мозку є типовими патологічними ознаками AD (Serrano-Pozo et al., 2011). Зовні ОП і АД є абсолютно незалежними захворюваннями з різною патологією та клінічними ознаками. Однак у клінічній практиці часто спостерігають, що ОП і АД зустрічаються одночасно (Zhang et al., 2001; Lui et al., 2003; Luckhaus et al., 2009). Поширеність обох захворювань зростає з віком, особливо у жінок у постменопаузі (Li et al., 2017; Stern, 2012). Все більше доказів свідчить про те, що люди з діагнозом AD мають підвищений ризик розвитку ОП (Zhou et al., 2014).

Необхідно вивчити і з'ясувати зв'язки між остеопорозом іхвороба Альцгеймераin vitro та in vivo. Перш ніж проводити дослідження in vivo, важливо вибрати відповідні тваринні моделі остеопорозу абохвороба Альцгеймера. Модель остеопорозу може бути встановлена ​​кількома методами, такими як внутрішньошлункове введення ретиноєвої кислоти, операція з видалення яєчників та внутрішньом’язова ін’єкція глюкокортикоїдів (Wei et al., 2007; Komori, 2015). Зокрема, модель постменопаузального остеопорозу, викликаного оваріектомією у щурів, була класичною і широко використовувалася в більшості досліджень (Miao та ін., 2012; Liu та ін., 2017). Спорадична хвороба Альцгеймера є основним типом хвороби Альцгеймера. Моделі тварин спорадичнихХвороба Альцгеймера можеіндукувати різними методами, такими як ін’єкція D-галактози або -амілоїду, внутрішньошлункове введення AlCl3 тощо (Bagheri та ін., 2011; Гао та ін., 2015; Джастін Thenmozhi та ін., 2017). Крім того, модель кон'юнкціїхвороба Альцгеймераіндукований тривалою внутрішньоочеревинною ін’єкцією D-галактози в поєднанні з оваріоектомією, також було багато вивчено (Liu et al., 2010; Zhao et al., 2012). З метою виявлення актуальності остеопорозу тахвороба Альцгеймера, необхідно встановити модель остеопорозу в поєднанні зхвороба Альцгеймеравивчити загальні механізми дії ліків на остеопороз іхвороба Альцгеймера.

Цистанка трубчаста(Schenk) Wight — рослина-паразит, поширена в основному в пустелях північно-західного Китаю. Висушені соковиті стеблаЦистанка трубчаста(CT) використовуються як відомий тонізуючий засіб під назвою Cistanches Herba з китайською назвою Roucongrong у Китайській фармакопеї (2015). Його вшановували як «женьшень пустель» і широко використовували для лікування болю в талії та колінах, жіночого безпліддя та запорів у традиційній китайській медицині (Jiang and Tu, 2009). Основні діючі речовини ЦТ(Cistanche tubulosa)є фенілетаноїдними глікозидами (PhG), ехінакозид (ECH) і актеозид (ACT) є репрезентативними сполуками в PhG (Morikawaet al., 2014). Зокрема, ECH і ACT зазвичай вибираються як маркери для контролю якості при КТ(Cistanche tubulosa)через їх високий вміст і різноманітні фармакологічні дії, такі як ефекти нейропротекції, захисту кісток, антиоксидантів, запобігання старінню та покращення здатності до навчання та пам’яті (Wang та ін., 2012; Лі та ін., 2016). Однак вплив ECH і ACT на остеопороз поєднується зХвороба Альцгеймераще не досліджувалися разом на моделі щурів. Таким чином, метою цього дослідження було створення щурячої моделі остеопорозу в поєднанні зхвороба Альцгеймераі вивчити вплив ехінакозиду та актеозиду на цю паралельну модель, щоб надати експериментальні докази для подальшого вивчення молекулярного механізму ехінакозиду або актеозиду в наступних дослідженнях.

Цистанка трубчастадляхвороба Альцгеймера

2 Матеріали та методи

2.1. Тварини

Вісімдесят 8-тижневих самок щурів Wistar (номер сертифікату: SCXK, 2018–0006), вагою 180–200 г, були отримані від Sino-BritishSIPPR/BK Lab. Animal Ltd (Шанхай, Китай) і вирощений в Експериментальному центрі фармацевтичних тварин у Фармацевтичному університеті Китаю.

2.2. Хімічні речовини та реагент

Хлоралгідрат, пеніцилін G натрію, D-галактоза, алюмінію хлоридгексагідрат, естрадіолу валерат, донепезил HCl були придбані в Aladdin Industrial Corporation (Шанхай, Китай). Ехінакозид (ВЕРХ 94%) був отриманий від Wuhan Yuanchengcreate Technology Co., Ltd. (Ухань, Китай). Актеозид (ВЕРХ 98 відсотків) був придбаний у Baoji HerbestBio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Китай). Придбано набори для визначення кісткової специфічної лужної фосфатази (BALP), тартрат-резистентної кислої фосфатази (TRAP), супероксиддисмутази (SOD), малональдегіду (MDA), ацетилхолінестерази (AChE) та холінацетилтрансферази (ChAT) для імуноферментного аналізу (ELISA). від Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Універсальний фіксатор тканин був отриманий від WuhanServicebio Technology Co., Ltd. (Ухань, Китай).

2.3. Тваринні моделі та лікування

Усі експерименти на тваринах були дозволені та контролювалися Комітетом з етики тварин Китайського фармацевтичного університету. Щурів утримували з 12-годинним циклом світло/темрява в кімнаті з контрольованою температурою (22 ± 2 градуси) і годували стандартним гранульованим кормом і водопровідною водою.

Після однотижневої адаптації модель остеопорозу була досягнута шляхом проведення операції з видалення яєчників (French et al., 2008). Після завершення операції пеніцилін G натрію був посипаний на шов рани один раз, щоб запобігти інфекції. Потім щурів годували звичайним способом протягом трьох тижнів. Відповідно до посилання (Hua et al., 2007; Alawdi et al., 2017), модельхвороба Альцгеймераможна індукувати тривалою внутрішньоочеревинною ін’єкцією D-галактози в поєднанні з оваріектомією або тривалим внутрішньошлунковим введенням AlCl3. Вивчити доцільність моделі остеопорозу в поєднанні зХвороба Альцгеймера, три модельні групи оваріектомії (група OVX), фіктивна хірургія з внутрішньоочеревинною ін’єкцією 150 мг/кг/добу D-галактози та внутрішньошлунковим введенням 30 мг/кг/добу AlCl3 (група D), оваріектомія з внутрішньоочеревинною ін’єкцією 150 мг/кг У цьому дослідженні було встановлено D-галактозу на добу та внутрішньошлункове введення 30 мг/кг/добу AlCl3 (група OVX плюс D).

Таким чином, щурів випадковим чином розділили на вісім груп (n {{0}} для кожної групи) через 3 тижні та перорально лікували ліками протягом 8 тижнів: фіктивна група; група OVX; D група; OVX плюс група D; група лікування естрадіолвалератом (група EV, OVX плюс D плюс 0.6 мг/кг/день естрадіолвалерату); група лікування донепезилом HCl (група DPZ, OVX плюс D плюс 0,8 мг/кг/день донепезилу HCl); група лікування ехінакозидом (група ECH, OVX плюс D плюс 90 мг/кг/день ехінакозид); група лікування актеозидом (група ACT, OVX плюс D плюс 90 мг/кг/день актеозид). Відповідно до Принципу перетворення еквівалентної дози для людини та щура та дози з відповідної довідки (Li та ін., 2013; Gao та ін., 2014), у цьому дослідженні були прийняті дози груп лікування препаратом.

Масу тіла кожного щура вимірювали щотижня. Після повного лікування препаратами протягом 8 тижнів спочатку було проведено тест на водний лабіринт Морріса (MWM) протягом 6 днів. Після цього 6 щурів з кожної групи були забиті для збору матеріалів. Щурів анестезували за допомогою внутрішньочеревної ін’єкції 3.0 мл/кг 10% хлоралгідрату, і кров відбирали з черевної аорти. Кров поміщали при кімнатній температурі для згортання і центрифугували при 3500 об/хв протягом 10 хв. Сироватку збирали в центрифужну пробірку на 1,5 мл (NEST Biotechnology) і зберігали при температурі -80 градусів до використання для біохімічних тестів. Потім збирали тканини матки, стегнової кістки, великогомілкової кістки та мозку. Для гістоморфометрії використовували матку. Праву стегнову кістку використовували для мікро-КТ та гістоморфометрії відповідно. Праву гомілкову кістку використовували для біомеханічного тесту. Гіпокамп, зібраний на крижаній камері, використовувався для біохімічних тестів. Після цього іншим трьом щурам з кожної групи влили із серця фізіологічний розчин і універсальний тканинний фіксатор, щоб зібрати мозок для гістоморфометрії.

Цистанка трубчастадляхвороба Альцгеймера

2.4. Тест на водний лабіринт Морріса (MWM).

Щури були піддані просторовому орієнтуванню та тестуванню пам’яті в тесті MWM після 8 тижнів втручання. Тест MWM проводився за методами, про які повідомлялося раніше (Morris, 1984; Gao et al., 2016). Коротко, 5 послідовних днів із чотирма пробами на день щурів навчали використовувати різноманітні візуальні сигнали, розташовані на стінці басейну, щоб знаходити приховану занурену платформу (діаметр 11 см, висота 29 см) у круглому басейні (діаметр 130 см, висота 50 см). ), наповнений нетоксичною водою, пофарбованою вуглецевим чорнилом. Пул був уявно поділений на чотири квадранти, і чотири стартові позиції були розташовані на перетині квадрантів. Платформа була розташована в центрі одного з квадрантів, і положення було постійним під час випробувань. У кожному досліді щурів випадковим чином розміщували у вибраних місцях обличчям до стінки басейну. Кожне випробування припиняли, коли щур досягав платформи або через 60 с, і час, що минув, реєстрували як латентність втечі. Щури, які не досягли платформи, направлялися на неї. Після кожного випробування на прихованій платформі щур залишався на платформі протягом 10 секунд. Середній час затримки чотирьох випробувань на день було розраховано як результати навчання. На 6-й день усіх щурів піддавали пробному випробуванню, під час якого вони плавали протягом 60 секунд у басейні без платформи. Час проходження в місці розташування платформи та час подорожі в цільовому квадранті були записані як остаточні результати. За щурами спостерігали за допомогою камери, встановленої на стелі безпосередньо над басейном, і всі випробування записували та аналізували за допомогою програми MORRIS MAZE, наданої компанією Beijing zhongshidichuang science and technology development Co., Ltd. (Пекін, Китай).

2.5. Біохімічне дослідження методом ІФА

Згідно з інструкціями виробника наборів для ELISA, специфічну для кісток активність лужної фосфатази (BALP), активність резистентної до тартрату кислої фосфатази (TRAP), активність супероксиддисмутази (SOD) і вміст малонового діальдегіду (MDA) у сироватці тестували за допомогою BioTekSynergy 2 multi- рідер мікропланшетів в режимі (BioTek, США). Тканини гіпокампу з кожної групи промивали PBS (0,01 М, pH7,4), щоб видалити кров або домішки, що залишилися на поверхні тканини. Тканини гіпокампу з одного боку зважували, а потім розрізали на невеликі частини. якомога. Тканини гіпокампу гомогенізували у співвідношенні 1:9 (маса тканини: об'єм PBS). Гомогенат центрифугували при 4 градусах, 3000 об/хв протягом 15 хв. Супернатант збирали і розбавляли для вимірювання концентрації білка методом BCA. Активність ацетилхолінестерази (AChE), активність холінацетилтрансферази (ChAT), активність супероксиддисмутази (SOD) і вміст малонового діальдегіду (MDA) у тканині гіпокампу потім перевіряли методами ELISA.

Цистанка трубчастадляхвороба Альцгеймера

2.6. Гістоморфометрія гіпокампу

Тканини мозку (n=3/групу) фіксували в універсальному тканинному фіксаторі. Потім зразки тканин головного мозку промивали, зневоднювали градієнтом етанолу, заливали парафіном і нарізали на корональні зрізи 5 мкм. Зрізи фарбували гематоксиліном та еозином (HE). Після цього корональні зрізи тканин головного мозку фотографували за допомогою інвертованого флуоресцентного мікроскопа (Nikon, Японія). Особливо спостерігалися морфологічні зміни СА1, СА2, СА3 та ДГ у гіпокампі.

2.7. Гістоморфометрія та морфометрія матки

Відібрані матки (n {{0}}/групу) фіксували в універсальному тканинному фіксаторі. Потім зразки тканини матки промивали, зневоднювали градієнтом етанолу, заливали парафіном і нарізали на поперечні зрізи 5 мкм. Зрізи фарбували гематоксилін-андеозином (HE). Поперечні зрізи маток спостерігали та фотографували. Випадково вибирали п’ять полів зору, потім за допомогою програмного забезпечення Image-Pro Plus 6.0 вимірювали діаметр поперечного розрізу матки та товщину епітелію слизової оболонки матки. Також підраховували кількість маткових залоз у власній пластинці.

2.8. Мікро-КТ(Cistanche tubulosa)

Вибрану праву стегнову кістку (n=3/групу) сканували в положенні з відстанню об’єкта до джерела 121 мм і відстанню камери до джерела 171 мм за допомогою мікрорентгенівського апарата SkyScan 1176 комп’ютерний томограф (Micro-CT) (Bruker, Німеччина). Пластинка дистального росту була обрана як поверхня порівняння. На відстані 1 мм нижче контрольної поверхні область товщиною 1,8 мм була обрана як цікавий об’єм (VOI, 100 шарів). Отримані зображення у градаціях сірого мали розмір пікселя 17,76 мкм від реконструкції кістки (65 кВ, 385 мкА). Для вибору трабекул з кортикальної кістки використовувався напівавтоматичний метод контурування. Методи прямого 3D вимірювання використовувалися для оцінки відсотка об’єму кістки (BV/TV), щільності поверхні кістки (BS/TV), трабекулярного поділу (Tb. Sp), трабекулярного числа (Tb. N), товщини трабекули (Tb. Th), моделі структури індекс (SMI), коефіцієнт трабекулярного малюнка (Tb.Pdf) і середня мінеральна щільність кісткової тканини (середня МЩКТ) для того самого VOI за допомогою КТ(Cistanche tubulosa)Програма-аналізатор (Bruker, Німеччина). Тривимірна візуалізація VOI з використанням адаптивного алгоритму візуалізації була виконана за допомогою програмного забезпечення CTvol (Bruker, Німеччина).

Цистанка трубчастадляхвороба Альцгеймера

2.9. Гістоморфометрія кістки

Відібрану праву стегнову кістку (n=3/група) фіксували універсальним фіксатором тканин, а потім декальцинували в 10-відсотковому розчині EDTA-2Na протягом 3 тижнів. Декальциновані зразки промивали, зневоднювали градієнтним етанолом, заливали парафіном і нарізали поздовжніми шматочками 5 мкм. Зрізи фарбували гематоксиліном та еозином (ВІ). Сфотографували поздовжні зрізи стегнової кістки. Спостерігали структури кісткової тканини кожної групи, особливо трабекулярні кісткові структури.

2.10. Біомеханічний тест

Праву гомілкову кістку (n=4/групу), вибрану випадковим чином, оцінювали для тесту на триточкове згинання за допомогою універсальної випробувальної машини (SHIMADZU, Японія). Діаметри цих зразків вимірювали штангенциркулем у діапазоні 2,16–2,38 мм (d). Потім зразок помістили на дві опорні перекладини з відстанню 25 мм (L) між двома рейками, а фізіологічна кривизна зразка була спрямована вгору. Навантажувальний стрижень вантажу розташовувався в центрі зразка і падав з постійною швидкістю 1,5 мм/хв, поки зразок не розірветься. Дані про силу (F) і переміщення автоматично записувалися в комп’ютер, який був підключений до випробувальної машини, і одночасно будувалась крива навантаження-деформації. Значення максимального навантаження (Н) і поглинання енергії (мДж) були зафіксовані за допомогою програмного забезпечення для тестування матеріалів TRAPEZIUM X одночасно. Значення максимального напруження (МПа) були розраховані за такою формулою: Напруга (σ)=згинальний момент (M)/Коефіцієнт перетину (Z) =(8 × L × F)/(π × d3).

2.11. Статистичний аналіз

Результати модельних груп порівнювали з групою Sham, а результати груп, які отримували ліки, порівнювали з групою OVX плюс D. Дані були проаналізовані за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з подальшим тестом багаторазового порівняння Бонферроні за допомогою програмного забезпечення Graph Pad Prism 5.0. Дані були виражені як середнє ± стандартне відхилення, а значення P менше 0.05 вважалися статистично значущими.

3. Результати

3.1. Вага тіла

Щотижнева маса тіла щурів у кожній групі протягом всього 8-тижневого лікування показана на рис. 1. Порівняно з групою Sham, маса тіла щурів у групі OVX плюс D зросла, особливо суттєва різниця в перших чотирьох тижнів (P < 0.05).="" після="" лікування="" ev="" та="" ech="" маса="" тіла="" щурів="" явно="" зменшилася="" порівняно="" з="" групою="" ovx="" плюс="" d="" (p="">< 0.05,="" p=""><>

3.2. Оцінка когнітивних здібностей

3.2.1. Оцінка здатності до навчання на етапі засвоєння

Репрезентативні сліди плавання щурів кожної групи у фазі захоплення на 5-й день показані на рис. 2. Затримка втечі кожної групи протягом 5-денної фази наведена в таблиці 1. У перший день втеча затримка між групою OVX плюс D і групою DPZ, група ACT показала суттєву різницю (P < 0.05)="" відповідно.="" з="" другого="" дня="" затримка="" втечі="" в="" групах="" шам="" значно="" скоротилася,="" а="" середня="" затримка="" була="" набагато="" нижчою,="" ніж="" у="" групі="" ovx="" плюс="" d.="" у="" групі="" dpz="" затримка="" значно="" зменшилася="" (p="">< 0.05)="" порівняно="" з="" групою="" ovx="" плюс="" d="" на="" 3-й="" день.="" порівняно="" з="" групою="" sham="" затримка="" d="" і="" ovx="" плюс="" групи="" d="" явно="" подовжуються="" (p="">< 0.01,="" p="">< 0.001)="" на="" 4-й="" день.="" крім="" того,="" порівняно="" з="" групою="" ovx="" плюс="" d,="" латентність="" ev,="" dpz="" і="" ech,="" act="" груп="" значно="" скоротилася="" (p=""><0,05, p=""><0,01, p=""><0,001). на="" 5-й="" день="" затримка="" в="" групі="" ovx="" плюс="" d="" була="" значно="" вищою,="" ніж="" у="" групі="" шам="" (p="">< 0,05),="" а="" латентність="" у="" групах="" ev="" і="" ech="" явно="" скоротилася="" (p="">< 0,05)="" порівняно="" з="" групою="" ovx="" плюс="">

3.2.2. Оцінка пам'яті в пробному дослідженні

Репрезентативні сліди плавання щурів у кожній групі в дослідженні зонда показані на рис. 3. Як показано на рис. 4, порівняно з групою Шам, час перетину та час плавання в цільовому квадранті OVX, D та OVX плюс групи D значно зменшилися (P < 0.05,="" p="">< 0.01).="" порівняно="" з="" групою="" ovx="" плюс="" d="" час="" перетину="" груп="" ev,="" dpz="" і="" ech,="" act="" явно="" збільшився="" (p="">< {{10}}.05,="" p="">< 0,01)="" і="" час="" у="" цільовому="" квадранті="" груп="" ev="" та="" dpz="" також="" значно="" зросли="" (p="">< 0,05,="" p=""><>

3.3. Біохімічний аналіз сироватки крові

Як показано на рис. 5A та B, порівняно з групою Sham, активність BALP та TRAP у групах OVX та OVX plus D значно зросла (P < 0.001="" ),="" що="" було="" типовою="" характеристикою="" високооборотного="" остеопорозу,="" викликаного="" оваріектомією.="" активність="" balp="" і="" trap="" у="" групах="" ev,="" dpz,="" ech="" і="" act="" явно="" знизилася="" порівняно="" з="" групою="" ovx="" плюс="" d="" (p="">< 0.05,="" p="">< 0,01,="" p=""><>

Оваріектомія, внутрішньоочеревинна ін’єкція D-галактози та внутрішньошлункове введення AlCl3 можуть спричинити окисне пошкодження (Muthusami та ін., 2{{10}}05; A. Prakash та ін., 2 013). Як показано на рис. 5C. Оваріектомія, внутрішньоочеревинна ін’єкція D-галактози та внутрішньошлункове введення AlCl3 можуть спричинити окисне пошкодження (Muthusami та ін., 20{{20}}5; A. Prakash та ін., 2013). Як показано на рис. 5C і D, активність SOD у групах OVX, D і OVX плюс D була значно нижчою, ніж у групі Sham (P < 0,05,="" p="">< 0,001),="" а="" вміст="" mda="" в="" ovx,="" d="" і="" групи="" ovx="" плюс="" d="" значно="" зросли="" (p=""><0,05, p=""><0,001) порівняно="" з="" групою="" sham.="" порівняно="" з="" групою="" ovx="" плюс="" d="" після="" лікування="" ev,="" dpz,="" ech="" та="" act="" активність="" sod="" значно="" зросла="" (p="">< 0,01,="" p="">< 0,001),="" а="" вміст="" mda="" певною="" мірою="" знизився,="" особливо="" в="" групі="" ev.="" (p=""><>

3.4. Біохімічний аналіз гіпокампу

Як показано на рис. 6A, активність AChE групи OVX плюс D була очевидно вищою, ніж у групи Sham (P < 0.05),="" що="" вказувало="" на="" те,="" що="" здатність="" до="" навчання="" та="" пам’яті="" у="" група="" ovx="" плюс="" d="" може="" знижуватись="" із="" прискоренням="" гідролізу="" ацетилхоліну="" в="" мозку.="" порівняно="" з="" групою="" ovx="" плюс="" d,="" активність="" ache="" у="" групах="" медикаментозного="" лікування="" певною="" мірою="" знизилася,="" особливо="" в="" групі="" ev="" (p="">< 0.01).="" як="" показано="" на="" рис.="" 6b,="" порівняно="" з="" групою="" sham,="" chat-активність="" груп="" ovx,="" d="" і="" ovx="" плюс="" d="" явно="" знизилася="" (p="">< {{10}}.01,="" p="">< 0,001),="" що="" вказує="" на="" те,="" що="" їхні="" здібності="" до="" навчання="" та="" пам’яті="" можуть="" залежати="" через="" повільніший="" синтез="" ацетилхоліну="" в="" мозку.="" порівняно="" з="" групою="" ovx="" плюс="" d,="" активність="" chat="" у="" групах="" ev,="" dpz="" та="" ech,="" act="" значно="" зросла="" (p=""><0,05, р=""><0,01, р=""><>

Окисне пошкодження також може відбуватися в гіпокампі (Dileket ін., 2010; Янг та ін., 2013). Як показано на рис. 6C і D, порівняно з групою Sham, активність SOD груп OVX, D і OVX плюс D значно знизилася (P < 0.01,="" p="">< 0.="" 001),="" а="" вміст="" мда="" явно="" збільшився="" (р="">< 0,01,="" р="">< 0,001).="" після="" лікування="" ev,="" dpz,="" ech="" та="" act="" активність="" sod="" значно="" зросла="" (p="">< 0,001),="" а="" вміст="" mda="" значно="" знизився="" (p="">< 0,001)="" порівняно="" з="" групою="" ovx="" плюс="">

3.5. Аналіз гістоморфології гіпокампу

Як показано на фіг. 7A, нейрони в гіпокампі групи Sham були рівномірно пофарбовані. При цьому морфологічні особливості нейронів були чіткими з явним ядерцем. Їх розміщення також було акуратним і компактним, з великою кількістю та непошкодженою структурою. У групах OVX, D і OVX плюс D кількість нейронів у гіпокампі значно зменшилася порівняно з групою Шем. Нейрони були розташовані безладно, а порожнечі були збільшені. Особливо в групах D і OVX плюс D було виявлено менше нейронів у гіпокампі, і їх розподіл був розсіяним. Каріопікноз і нечіткі морфологічні особливості нейронів і некротичних нейронів також мали місце в групах D і OVX плюс D. Як показано на рис. 7B, після медикаментозного втручання кількість нейронів у гіпокампі груп EV, DPZ, ECH та ACT була значно вищою, ніж у групі OVX плюс D. У той же час вирівнювання між нейронами було відносно впорядкованим, і кількість нейронів з каріопікнозом і некрозом також зменшилася.

3.6. Мокра маса матки та аналіз гістоморфології та морфометрії матки

Як показано на рис. 8, волога вага матки в групах OVX і OVX плюс D була значно нижчою, ніж у групі Шам (P < 0.05,="" p="">< 0).="" 01).="" порівняно="" з="" групою="" ovx="" плюс="" d,="" волога="" вага="" матки="" в="" групі="" ev="" явно="" зросла="" (p=""><0,01) під="" впливом="" естрадіолвалерату.="" крім="" того,="" волога="" вага="" маток="" груп="" dpz="" і="" ech="" також="" певною="" мірою="">

Як показано на рис. 9A, матка групи Sham була товстостінним м'язовим органом, а епітелій слизової оболонки матки був одношаровим стовпчастим епітелієм. Власна пластинка була розподілена матковими залозами і кровоносними судинами. М'язовий шар складався з пучкових частин гладких м'язів, а м'язове волокно було щільно розташоване. У групах OVX і OVX плюс D матка значно скоротилася з люмінальстенозом. Ендометрій і м'язовий шар були значно тоншими, ніж у групи Шам. Крім того, зменшилася кількість маткових залоз, а м’язові волокна стали тонкими. Як показано на рис. 9B, порівняно з групою OVX плюс D, гістоморфологія матки була певною мірою покращена після лікування EV, DPZ, ECH та ACT. Зокрема, у групі EV матка була значно наповненою, ендометрій і м’язовий шар були явно товстими. Крім того, збільшилася кількість маткових залоз і розширилися м'язові волокна.

Результати морфометричного аналізу матки кожної групи наведено на рис. 10A–C. Порівняно з групою Шам, діаметр матки, товщина епітелію слизової оболонки матки та кількість маткових залоз у групах OVX і OVX плюс D значно зменшилися (P < 0.01,="" p="">< 0,001).="" після="" лікування="" ev="" діаметр="" матки,="" товщина="" епітелію="" слизової="" оболонки="" матки="" та="" кількість="" маткових="" залоз="" явно="" зросли="" порівняно="" з="" групою="" ovx="" плюс="" d="" (p=""><0,001). крім="" того,="" ech="" та="" act="" також="" показали="" тенденцію="" до="" збільшення="" діаметра="" матки,="" товщини="" епітелію="" слизової="" оболонки="" матки="" та="" кількості="" маткових="">

3.7. Мікро-КТ аналіз

Двовимірні зображення перерізу дистального відділу губчастої кістки стегна були отримані за допомогою програмного забезпечення Bruker DataViewer, яке показано на рис. 11A. Після виконання програмним забезпеченням CTvol тривимірні зображення трабекулярної кістки в області VOI дистально-стегнової губчастої кістки кожної групи було показано на рис. 11B. Крім того, середні BMD, BV/TV, SMI, Tb. N, Tb. Sp, Tb.Th, BS/TV і Tb. Pf, який було проаналізовано програмним забезпеченням CTAn, також показано в таблиці 2 і таблиці 3.

Як показано на цифрах вище, у порівнянні з групою Шам трабекулярна кількість і трабекулярна площа в групі OVX плюс D явно зменшилися. Тим часом кількісне визначення різних трабекулярних параметрів також показало, що середні МЩКТ, BV/TV, Tb. N, Tb.Th, BS/TV значно знизилися в групі OVX плюс D (P < {{0}}.05,="" p="">< 0,01)="" і="" smi,="" tb.="" sp,="" tb.="" pf="" групи="" ovx="" плюс="" d="" явно="" збільшився="" (p=""><0,01). порівняно="" з="" групою="" ovx="" плюс="" d,="" трабекулярна="" мікроархітектура="" була="" певною="" мірою="" покращена="" після="" лікування="" ev="" та="">

3.8. Аналіз гістоморфології кісток

Трабекулярні структури губчастої кістки в дистальному відділі стегнової кістки кожної групи показано на рис. 12. Фіктивна група мала багато трабекул, які були товстими та з’єднані між собою в мережу. Порівняно з Shamgroup, трабекули груп OVX і OVX плюс D були значно зменшені та стоншені. Зокрема, трабекули групи OVX plus D були сильно зруйновані, і більшість з них не могли бути підключені до мережі. Крім того, трабекули групи D також були явно стоншені. Після лікування EV та ECH трабекули значно збільшилися, вони були потовщеними та сітчастими порівняно з групою OVX плюс D. Морфологічні ознаки групи EV були близькі до групи Sham. Тим часом, трабекулярні структури груп DPZ та ACT також були певною мірою покращені.

3.9. Біомеханічний аналіз

Результати випробування на триточкове згинання наведено в таблиці 4. Порівняно з групою Шема максимальне навантаження та максимальне напруження значно зменшилися (P < 0.05,="" p="">< 0,01)="" у="" ovx="" і="" ovx="" плюс="" групи="" d,="" і="" поглинання="" енергії="" також="" значно="" зменшилося.="" після="" лікування="" ev="" та="" ech="" максимальне="" навантаження,="" максимальний="" стрес="" і="" поглинання="" енергії="" певною="" мірою="" зросли="" порівняно="" з="" групою="" ovx="" плюс="">

4. Обговорення

Епідеміологічне дослідження остеопорозу показало, що кількість пацієнтів жіночої статі була більшою, ніж пацієнтів чоловічої статі, і він часто зустрічався у літніх людей і жінок у постменопаузі (Chen та ін., 2016). Остеопороз серйозно вплинув на здоров’я літніх людей і став одним із серйозних захворювань. соціальні проблеми в усьому світі (Deal,2009; Roy et al., 2011; Bessette et al., 2011). Епідеміологічні дослідженняхвороба Альцгеймерапоказали, що захворюваність і поширеністьхвороба Альцгеймераекспоненціально збільшувався зі збільшенням віку, особливо у літніх людей старше 65 років (Sosa Ortiz et al., 2012). Крім того, поширеність AD була значно вищою серед жінок порівняно з чоловіками (Mielke та ін., 2014). Останні оцінки свідчать про те, що майже дві третини осіб мають діагноз ADхвороба Альцгеймерабули жінки (Hebert et al., 2013). Примітно, що глобальне поширення AD лягло значним тягарем на суспільство (Reitzand Mayeux, 2014).

Згідно з дослідженнями, основною причиною постменопаузального остеопорозу був дефіцит естрогену (Klein-Nulendet al., 2015). Це може значно прискорити швидкість обміну кісткової тканини та змусити швидкість резорбції кістки перевищувати швидкість формування кістки, що призведе до втрати кісткової маси, зниження мінеральної щільності кістки та зниження міцності кістки (Tella and Gallagher, 2014). Крім того, було також показано, що жінки в постменопаузі мають підвищений ризик когнітивних розладів або деменції (Rocca et al., 2007). Деякі дослідження показали, що естроген відіграє вирішальну роль у лікуванні AD, яке включає підтримку функції гіпокампа під час старіння (Han et al., 2013), підвищення активності холінацетилтрансферази в гіпокампі (Gibbs and Aggarwal, 1998), зменшення агрегації бета-амілоїду. (Nilsen et al., 2006).

Для дослідження остеопорозу та остеопорозу було вкрай важливо вибрати відповідні моделі щурівхвороба Альцгеймера. Модель остеопорозу, спричиненого оваріоектомією, широко поширена в дослідженнях остеопорозу (Zhao та ін., 2011; Лю та ін., 2018). Хоча патогенез AD є різноманітним, дослідження показали, що окислювальний стрес і вплив алюмінію були важливими причинами AD (Xiao et al., 2011; Bhattacharjee et al., 2014). D-галактоза є свого роду відновлюючим цукром invivo. Коли він був набагато вищим за нормальний рівень в організмі, він міг бути окислений галактозооксидазою до альдегідів, які не могли метаболізуватися далі і могли значною мірою накопичуватися в мозку, що, як наслідок, викликало окислювальний стрес і апоптоз нейроцитів (Cui et al., 2006). Алюміній може легко долати гематоенцефалічний бар’єр і має очевидну нейротоксичність для мозку (D. Prakash et al., 2013). Він може викликати позаклітинне відкладення нейронів і індукувати вироблення активних форм кисню (АФК), які викликають окислювальний стрес і порушення нейронів (Walton, 2013). Численні дослідження показали, що лікування D-галактози в поєднанні з AlCl3 у тварин, особливо гризунів, може значно погіршити їх здатність до навчання та пам’яті (Chiroma et al., 2018). Це може індукувати експресію та накопичення A 1-42 у корі головного мозку та гіпокампі (Yang et al., 2014). Крім того, дослідження також показали, що оваріоектомія в поєднанні з тривалою внутрішньоочеревинною ін’єкцією D-галактози може призвести до патофізіологічних змін, пов’язаних із хворобою Альцгеймера, таких як втрата синапсів, порушення астроцитів, накопичення внутрішньоклітинного А та нейрофібрилярні клубки, які можуть служити подвійним модель травми для AD (Su et al., 2010).

У нашому дослідженні три модельні групи групи OVX, групи D і групи OVX плюс D були відповідно встановлені для підтвердження того, що метод операції оваріектомії в поєднанні з внутрішньоочеревинною ін’єкцією D-галактози та внутрішньошлунковим введенням AlCl3 може краще впливати на патологічні ознаки остеопорозу. іхвороба Альцгеймерав той самий час.

Було використано кілька методів для оцінки моделі остеопорозу в поєднанні зхвороба Альцгеймера. Навчання та пам'ять є одними з видів діяльності мозку високого рівня.хвороба Альцгеймераможе спричинити різні ступені когнітивних порушень (Albert et al., 2011). Тест навчання та пам’яті гризунів є поширеним методом вивчення когнітивної поведінки та механізмів у галузі нейронаук (Kwon et al., 2011). У нашому дослідженні для оцінки здатності до навчання та пам’яті щурів використовувався тест Морріса з водним лабіринтом (MWM), який широко використовувався в нейробіологічних і нейрофармакологічних дослідженнях гризунів (Gacar et al., 2011). Результати тесту MWM показали, що латентність втечі в групі OVX плюс D значно збільшилася, а час перетину та час плавання в цільовому квадранті групи OVX плюс D явно зменшилися порівняно з групою Шам, що вказує на когнітивні здібності щурів. у групі OVX плюс D була серйозно порушена. Гіпокамп, область мозку, яка має важливе значення для навчання та пам’яті, особливо вразлива до пошкоджень на ранніх стадіях AD. (Mu and Gage, 2011). Біохімічний аналіз гіпокампу показав, що активність AChE була явно вищою, а активність ChAT була значно нижчою в групі OVX плюс D, ніж у групі Sham, що вказувало на здатність до навчання та пам’яті у група OVX плюс D може бути порушена через зниження ацетилхоліну в мозку. Крім того, окисне пошкодження також могло вплинути на нормальні функції гіпокампу через зниження активності СОД і підвищення вмісту МДА в групі OVX плюс D. Гістоморфологічний аналіз гіпокампу показав, що кількість нейронів значно зменшилася, а нейрони були розташовані невпорядковано в групі OVX плюс D порівняно з фіктивною групою, що вказувало на те, що нейрони в гіпокампі були серйозно порушені.

Формування остеопорозу оцінювали за допомогою біохімії сироватки, мікро-КТ, гістоморфології кістки та біомеханічного тесту в нашому дослідженні. Активність BALP і TRAP у сироватці крові є репрезентативним індексом кісткоутворення та резорбції кістки (Rufus et al., 2013). Порівняно з групою Sham, активності BALP і TRAP у групах OVX і OVX плюс D значно зросли, що було типовою ознакою високооборотного остеопорозу, викликаного оваріектомією. Тим часом, окислювальне пошкодження також відбулося у щурів групи OVX плюс D через зниження активності СОД і підвищення вмісту МДА, що ще більше прискорило процес остеопорозу. Мікро-КТ — це вид техніки з особливостями неінвазивної візуалізації в поєднанні з гістологічним виявленням високої роздільної здатності, яка особливо підходить для візуалізації кісток і дослідження параметрів кісток (Ito, 2011). Результати аналізу мікро-КТ показали, що зниження МЩКТ, велика втрата кісткової маси та зруйнована мікроархітектура трабекул були показані в групі OVX плюс D порівняно з групою Шам. Гістоморфологія кісток також продемонструвала, що трабекули були значно зруйновані в групі OVX плюс D. Остеопороз може збільшити ризик переломів, і біомеханічний тест кісток можна використовувати для визначення міцності кісток (Mears et al., 2010). Тест на триточкове згинання великогомілкової кістки показав, що міцність кісток груп OVX плюс D значно зменшилася порівняно з групою Шам. Крім того, аналіз гістоморфології та морфометрії матки виявив, що матка значно зменшилася, ендометрій був явно тоншим, а кількість маткових залоз зменшилася в групі OVX плюс D порівняно з групою фіктивного лікування через відсутність естрогену.

Цистанка трубчастаце добре відомий тонізуючий засіб у традиційній китайській медицині, який має імунорегуляційний, антиоксидантний ефект, запобігає старінню, нейропротекторію та сприяє росту остеобластів (Li et al., 2016). Основними діючими речовинами є ехінакозид і актеозидЦистанка трубчаста, і їх різноманітні фармакологічні ефекти заслуговують на поглиблене вивчення (Fu et al., 2018).

У нашому поточному експерименті ефекти ехінакозиду або актеозиду на щурячій моделі остеопорозу в поєднанні зХвороба Альцгеймера буладалі вивчено. Він продемонстрував очевидний вплив на остеопороз і хворобу Альцгеймера, особливо ехінакозид. Результати показали, що ехінакозид може значно підвищити здатність до навчання та пам’яті, а також покращити когнітивну дисфункцію, сприяючи синтезу ацетилхоліну та захищаючи нейрони в гіпокампі. Тим часом ехінакозид і актеозид можуть значно зменшити резорбцію кісткової тканини шляхом зниження активності BALP і TRAP. Крім того, вони можуть також підвищує середню мінеральну щільність кісткової тканини та міцність кісткової тканини, запобігаючи втраті кісткової маси та покращуючи мікроархітектуру трабекул. Крім того, ехінакозид і актеозид також продемонстрували тенденцію до поліпшення стану матки. Повідомлялося, що ехінакозид і актеозид мають естрогеноподібну дію (Wang et al., 2014). Наше попереднє дослідження також продемонструвало, що як новий вид фітоестрогену ехінакозид може ефективно запобігати остеопорозу та пригнічувати резорбцію кісток після оваріектомії у щурів (Li et al., 2013). Згідно з цими результатами, ехінакозид або актеозид можуть діяти за допомогою сигнального шляху естрогену або іншого шляху, пов’язаного з естрогеном. У наступному дослідженні буде встановлено кілька доз ехінакозиду або актеозиду, щоб виявити взаємозв’язок доза-ефект, і відповідні сигнальні шляхи будуть додатково вивчені для з’ясування загальних механізмів ехінакозиду або актеозиду в поєднанні з оностеопорозом.хвороба Альцгеймера.

Цистанка трубчастадляхвороба Альцгеймера

5. Висновок

Щуряча модель остеопорозу в поєднанні зХвороба Альцгеймера булаздійсненним і успішно встановленим у нашому дослідженні. Тим часом ехінакозид і актеозид відЦистанка трубчастапоказали значні ефекти покращення здатності до навчання та пам’яті, регулювання кісткового метаболізму, зменшення окисного пошкодження та захисту нейронів на цій паралельній моделі. Ехінакозид і актеозид можуть бути потенційними кандидатами з подвійним ефектом і надати експериментальні докази для подальшого вивчення молекулярних механізмів у наступних дослідженнях.

Внески авторів

Ї Чен написав рукопис. Ї Чен, Ін-Ці Лі та Цзя-Ї Фан проводили експерименти. І Чен проаналізував дані. Фей Лі та ПінЛі розробили дослідження та переглянули рукопис.

Декларація про конкуруючий інтерес

Автори заявляють, що вони не мають конкуруючих інтересів у цьому рукописі та не мають значної фінансової підтримки для цієї роботи, яка могла б вплинути на її результат.

З: «Встановлення паралельної експериментальної моделі остеопорозу в поєднанні з хворобою Альцгеймера у щурів і подвійних ефектів ехінакозиду та актеозиду з Cistanche tubulosa» Yi Chena та ін.

---Journal of Ethnopharmacology 257 (2020) 112834