У пацієнтів із судинною хірургією з підвищеним співвідношенням нейтрофілів до лімфоцитів знижена експресія РНК нейтрофілів

Підвищене співвідношення нейтрофілів до лімфоцитів (NLR) у пацієнтів, які перенесли планову операцію на судинах (EVS), підвищує смертність незалежно від періопераційних хірургічних результатів. Щоб зрозуміти, чому високий рівень NLR пов’язаний із вищою смертністю, ми досліджували експресію транскриптомів нейтрофілів і лімфоцитів у пацієнтів, які проходили EVS. Зразки крові були зібрані у пацієнтів, які проходили EVS, і здорових донорів для розрахунку NLR. Зразки РНК були виділені з нейтрофілів і лімфоцитів пацієнтів і розділені на NLR_Low (<3) and NLR_High (≥3) groups (n = 6 each). Paired samples with the highest RNA integrity number (mean = 9.8 ± 0.4) were sequenced and analyzed for differential expression. Normalized data were inputted for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). There was no clinical difference between the patient groups about clinical diagnosis, age, sex, history of hypertension, lipid abnormalities, diabetes mellitus, smoking, or statin use. The mean NLR was 4.37 ± 0.27 SEM in the NLR_High and 1.88 ± 0.16 for the NLR_Low groups. Significantly differentially expressed gene sets identified in the RNA sequence data were enriched highly (P = 1E-24) in the humoral immunity and complement systems. Neutrophils from NLR_High patients downregulated complement genes (C1QA, C1QB, C1QC, C1S, C2, CR2, C3AR1, C3, C8G, and C9 and complement regulatory genes CD59, SERPING1, C4BPA, CFH, and CFI). Downregulation of gene expressions of humoral immunity and complement within the neutrophils are associated with elevated NLR. It remains to be determined whether and how these changes contribute to increased late mortality previously observed in patients undergoing EVS.

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

вступ

Серцево-судинні захворювання (ССЗ) є основною причиною смерті в усьому світі. Це здебільшого пов’язано з атерогенезом і атеросклерозом, які, окрім індивідуальної генетики та дієти, опосередковуються запальними й імунними механізмами.1-3 Останнім часом у центрі уваги приділяється диференціальна кількість лейкоцитів (нейтрофілів і лімфоцитів). для прогнозування серцево-судинних (СС) результатів. Співвідношення абсолютної кількості нейтрофілів до лімфоцитів (NLR) було визнано предиктором загальної смертності в багатьох невеликих дослідженнях гострих коронарних втручань,4-6 гіпертензії,7,8 та серцевої недостатності.9

Таблиця 1. Клінічна характеристика пацієнтів планової судинної хірургії, обстежених методом РНК-секв

Попередні дослідження також показали, що NLR є предиктором віддалених результатів у пацієнтів із захворюваннями периферичних судин.10-13 Наші ретроспективні дослідження пацієнтів із судинною хірургією підтверджують цей висновок. В одному дослідженні 108 пацієнтів з плановою ендоваскулярною операцією аневризми черевної аорти не було різниці в 30--денній післяопераційній смертності між NLR<4 and an NLR of >4 (P = .507). However, the 1-year, 3-year, and 5-year mortality between the groups were 4.2% vs 28.1%, 15.1% vs 64.9%, and 24% vs 90%, respectively.14 In a second study of 290 asymptomatic patients undergoing prophylactic carotid endarterectomy, the risk for stroke was noted to be significantly higher (P < .0001) in patients with an NLR of >3 (n=116 пацієнтів, 42,6% ризик інсульту), ніж у тих, у кого NLR становить<3 (n = 174 patients, 9.3% stroke risk).15 In a third study with 488 patients who underwent percutaneous interventions of femoropopliteal arteries, the 30-day mortality rates increased significantly (P = .005) with increasing NLR (1.4%, 4.3%, and 7.0% for low [<3], mid [3-4], and high [>4] Групи NLR відповідно).16 Пацієнти з нижчим передопераційним NLR досягли значно більшої виживаності без ампутації під час 4-річного спостереження (низький NLR 65,5%, середній NLR 37,5% і високий NLR 17,6 % [P < 0,0001]).16

У цьому дослідженні ми провели секвенування РНК (RNA-seq) нейтрофілів і лімфоцитів у пацієнтів, які підлягали плановій судинній хірургії (EVS), щоб визначити потенційні механізми підвищення NLR. Дослідження перевіряли, чи існує молекулярна основа для підвищеного NLR. Наші дослідження показують, що пацієнти з підвищеним рівнем NLR, які мали репарацію EVS, відрізняються дуже значним зниженням рівня імуноглобуліну та генів комплементу в нейтрофілах.

Cistanche корисний для зміцнення імунної системи

методи

Пацієнти

Blood samples were collected from candidate patients for EVS procedures and healthy volunteers for NLR calculation and RNA sequence studies of neutrophils and lymphocytes. In screening patients for participation, any individual with an active local or systemic infection or obvious inflammatory disease was excluded from participation. Peripheral blood collection was approved by the institutional review board of University Hospitals Cleveland Medical Center (#01-06-02). Informed consent was obtained from each patient and healthy volunteer. All patients for EVS seen in the outpatient department were eligible. Patients in the study were characterized for the type of vascular surgery, age, sex, hypertension (blood pressure >130/80 mm Hg), diabetes mellitus (fasting blood glucose >100 мг/дл), статус куріння, лікування статинами, хронічне обструктивне захворювання легень, рак, хронічне захворювання нирок, ішемічна хвороба серця (ІХС), захворювання периферичних артерій, цереброваскулярне захворювання та хронічна серцева недостатність. Усім пацієнтам проводили загальний аналіз крові з диференціальним підрахунком лейкоцитів. Пацієнти були розділені на групи з низьким NLR (NLR_Low [<3]) and high NLR (NLR_High [≥3]) groups (n = 6 each) and healthy volunteers aged 18 to 71 years (n = 6). Eleven of 12 patients' blood was drawn before surgery. One patient had blood drawn 4 months after surgery. 

Відділення крові

Цільну кров (20 мл на пацієнта) збирали в 10 мл вакуумні пробірки, антикоагулянтовані EDTA, і кров відокремлювали протягом години після збору. Кожну популяцію нейтрофілів і лімфоцитів виділяли з 8 мл крові за допомогою наборів для прямого виділення клітин людини EasySep (STEMCELL Technologies, Ванкувер, Канада) і магніту Big Easy EasySep (STEMCELL Technologies, Ванкувер, Канада) згідно з протоколами виробника. Раніше магніт охолоджували на льоду, а клітини крові та реагенти обережно змішували, перевертаючи пробірку, а не піпетуючи. Співвідношення реагентів також регулювали таким чином для оптимізації відновлення: 400 мл суміші антитіл, 400 мл магнітних кульок і 4 мл фосфатно-сольового буферу додавали до крові перед першим розділенням, а потім 200 мл антитіл суміші та 400 мл кульок перед другим поділом і 200 мл кульок перед третім і остаточним поділом. Невелику аліквоту 200 мл було взято з кінцевих об’ємів відновлення для підрахунку клітин і підготовки слайдів. Залишок відновленого об’єму центрифугували при 1000 обертах за хвилину протягом 7 хвилин для осадження клітин.

Рисунок 1. Повний транскриптом РНК нейтрофілів і лімфоцитів, зібраний у пацієнтів із NLR, високим (NLR_High), низьким (NLR_Low) або контрольним (NLR_Control) . Літерний код «N» або «L» у назві зразка означає, що джерелом РНК були нейтрофіли або лімфоцити. У кожній категорії було по 6 пацієнтів. Синій=знижений рівень експресії; червоний=високий рівень експресії.

Підрахунок клітин і підготовка предметного скла

Клітини, ресуспендовані у фосфатно-сольовому буфері, далі аликвотували, змішували з трипановим синім і вручну підраховували за допомогою гемоцитометра. Як правило, на зразок виділяли від 9 × 106 до 15 × 106 нейтрофілів і від 3 × 106 до 10 × 106 лімфоцитів. Предметні скла ізольованих клітин готували за допомогою цитоцентрифуги, обертали при 600 обертах на хвилину протягом 3 хвилин, а потім фарбували фарбою Райта-Гімзи. Чистоту кожної клітинної популяції визначали ручним підрахунком, у якому виділяли щонайменше 1000 клітин на предметне скло. Середні показники чистоти виділень нейтрофілів і лімфоцитів при підрахунку клітин становили 98,3% і 96,2% відповідно. Проточну цитометрію проводили на 1 парі зразків нейтрофілів і лімфоцитів і показали чистоту 90,6% і 92,2% відповідно. Інші клітини в препараті нейтрофілів були розбиті на лімфоцити (4%), моноцити (2%), еозинофіли (2,3%) і базофіли (0,3%). У препараті лімфоцитів іншими клітинами були нейтрофіли (1,2%), моноцити (1,4%), еозинофіли (1,2%) і базофіли (1,8%). Масові дані РНК-секвенування з усіх окремих зразків також використовувалися для визначення ступеня контамінації моноцитів у препаратах клітин шляхом визначення того, чи нейтрофіли чи лімфоцити з NLR_High або NLR_Low зразків значно підвищували CD14 , CD68, CD83 або CD163. Незалежно від цього дані RNA-seq були введені для оцінки частки імунних і ракових клітин (EPIC), програми, призначеної для оцінки частки імунних і ракових клітин у масових даних про експресію генів.17 Використаний еталонний профіль надав EPIC для циркулюючі в крові імунні клітини та містить профіль В-клітин, CD4 і CD8 Т-клітин, моноцитів, нейтрофілів і природних клітин-кілерів. Повідомлений вихід надається як частка клітин на зразок.

Малюнок 2. Значно диференційована експресія генів нейтрофілів і лімфоцитів. (A) Кількість значно диференційовано експресованих генів у нейтрофілах (синій) і лімфоцитах (помаранчевий). (B) Графік аналізу головних компонентів значно диференційовано експресованих генів у нейтрофілах (зелений і фіолетовий) і лімфоцитах (червоний і синій) у NLR_High (кружки) і NLR_Low (квадрати). (C) Теплова карта значно диференційовано експресованих генів від РНК нейтрофілів NLR_High проти NLR_Low. (D) Теплова карта генів із значною різницею експресії РНК лімфоцитів NLR_High проти NLR_Low.

RNA-seq та статистичний аналіз

Детальні методи екстракції та секвенування РНК представлені в додаткових методах. Якість зчитування секвенування було оцінено, а адаптер було обрізано за допомогою TrimGalore! (Інститут Бабрахама), сценарій оболонки для FastQC і CutAdapt. Зчитування, що пройшли контроль якості, були вирівняні з еталонним геномом людини GRCh38 за допомогою програмного забезпечення STAR aligner. Вирівняні зчитування були оброблені за допомогою Cufflinks версії 2.2.1 для аналізу диференціальної експресії з використанням анотації гена GENCODE для GRCh38, а дані про експресію генів були представлені у фрагментах на кілобазу транскрипту на мільйон картованих зчитувань.18 Значно диференційовано експресовані гени були ідентифіковані за допомогою помилкового Значення P відсікання швидкості відкриття<.05, after the Benjamini-Hochberg correction for multiple testing. Normalized fold-change and P values for all expressed genes were then used as input for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis (GSEA) using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). Additional figures including heat maps and scatterplots were generated in R and ClustVis.

Результати

Характеристики пацієнта

Шість пар зразків пацієнтів було обрано із 7 NLR_High та 9 NLR_Low на основі найвищої якості РНК у парі, оціненої за числом цілісності РНК (RIN) (Таблиця 1). ). Також було досліджено шість контрольних зразків від 8 здорових донорів. У пацієнтів, включених у дослідження, середнє ± стандартне відхилення NLR для NLR_High становило 4,37 ± 0.66 проти NLR_Low, 1,87 ± 0. 39 (P < .0001). Середнє ± стандартне відхилення віку пацієнтів становило 61,0 ± 17,0 років для NLR_Високий і 64,5 ± 7,5 років для NLR_Низький (P= 0,68). Усі пацієнти, крім 1, мали аневризму аорти, 9 – торакальні/торакоабдомінальні та 2 – абдомінальні. Обидва пацієнти з аневризмою черевної аорти були в групі NLR_Low. Одинадцять із 12 пацієнтів мали гіпертонію в анамнезі. Чотири з 6 пацієнтів у групах NLR_High або NLR_Low мали в анамнезі аномалії ліпідів. Четверо пацієнтів у групах NLR_High і 3 пацієнти в групах NLR_Low були колишніми курцями. Один пацієнт у групі NLR_Low був активним курцем. П’ять пацієнтів у групах NLR_High і 4 у групах NLR_Low приймали статини. Лише 3 пацієнти в обох групах були діабетиками. Один пацієнт у кожній групі мав анамнез ІХС, а 2 пацієнти в групі NLR_Low мали захворювання периферичних артерій.

Рисунок 3. Дані RNA-seq у цьому дослідженні використовувалися як незалежний засіб для визначення іншого забруднення клітин у препаратах нейтрофілів і лімфоцитів. Показані лише дані нейтрофілів. Аналіз EPIC було проведено для оцінки частки імунних і ракових клітин у масових даних експресії генів. Цей аналіз дав відсоток нейтрофілів, моноцитів, B-клітин, CD4 T-клітин, CD8 T-клітин, природних клітин-кілерів (NK) та інших клітин у препараті нейтрофілів.

Повний транскриптом

Ми спостерігали глобальні відмінності у всьому транскриптомі при порівнянні профілів експресії генів між нейтрофілами та лімфоцитами (рис. 1). Цей висновок не був несподіваним, оскільки експресія генів, специфічних для клітинного типу, раніше характеризувалася як різна.19 У розділі нейтрофілів у пацієнтів із NLR_Високий, NLR_Низький та NLR{{ 4}}У контрольних групах було багато генів з підвищеною регуляцією, які явно не були активовані в секції лімфоцитів і навпаки. На рівні всього транскриптома клітинно-специфічні відмінності між нейтрофілами та лімфоцитами були чіткими та домінуючими незалежно від NLR або пацієнта чи контролю. Однак при найближчому розгляді почали проявлятися відмінності. Діаграма аналізу основних компонентів показала, що контроль NLR_для нейтрофілів або лімфоцитів збігається з NLR_High і NLR_Low в обох клітинах (додатковий малюнок 1). Далі дослідження мали на меті виявити додаткові відмінності між групами NLR_High і NLR_Low у генах із значною різницею експресії. Було виявлено, що 900 (74,5%) значно диференційовано експресованих генів спостерігалися в нейтрофілах у групах NLR_High проти NLR_Low (рис. 2A). Для порівняння, лімфоцити мали лише 190 (15,7%) генів, що суттєво диференційовано експресувалися. Графік аналізу основних компонентів генів NLR_High проти NLR_Low генів у нейтрофілах і лімфоцитах показав, що група генів NLR_High проти NLR_Low у нейтрофіли розділені на 2 окремі ділянки, тоді як гени NLR_High і NLR_Low лімфоцитів перекриваються (рис. 2B). Знову ж таки, як і з усіма даними транскриптомів, NLR_Control перекривався з NRL_High і NLR_Low значно диференційовано експресованими генами як у нейтрофілах, так і в лімфоцитах (додатковий малюнок 2). Більшість значно диференційовано експресованих генів у NLR_High нейтрофілів були знижені з NLR_Low (рис. 2C). Подібна, але набагато менша кількість генів була знижена в NLR_High лімфоцитів, ніж у нейтрофілів (рис. 2D). Ці дані свідчать про те, що рівні NLR були в основному пов’язані зі зміненою експресією генів у нейтрофілах. Крім того, її потрібно було порівняти з пацієнтами з групи захворювання NLR_Низький, а не NLR-контроль, оскільки перша група чітко відокремлювалася від NLR_Високий, але не NLR_Контроль ( Рисунок 2B; додатковий Рисунок 2).

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Перед дослідженням диференціальної експресії генів і збагачення генного набору, додаткові дослідження характеризували ступінь контамінації моноцитів у препараті нейтрофілів. Використовуючи дані RNA-seq, ми спостерігали, що експресія моноцитарних маркерів CD14, CD68, CD83 і CD163 у NLR_High проти NLR_Low нейтрофілів або препаратів лімфоцитів істотно не відрізнялася. EPIC-аналіз даних РНК-seq нейтрофілів показав, що неімунні клітини («інші клітини») і CD4 Т-клітини були основними забруднювачами в препаратах нейтрофілів (рис. 3). За винятком NLR{{10}}Т-клітин із низьким вмістом CD4 і В-клітин, жодна з інших контамінуючих клітин не мала істотних відмінностей у NLR_Низький рівень нейтрофілів і NLR_Високий рівень нейтрофілів . У препараті нейтрофілів контамінація моноцитів за аналізом EPIC становила лише 0.17% ± 0.05% для NLR_Низький порівняно з 0,1% ± 0,033% для NLR_Високі препарати (P=.12). Це значення вказує на те, що контамінація моноцитів була на порядок нижчою при визначенні за допомогою аналізу даних RNA-seq порівняно з проточною цитометрією.

Рисунок 4. Точкова бульбашкова діаграма категорій набору генів GO зі значною експресією для біологічних процесів між NLR_High і NLR_Low. Співвідношення k:K на осі абсцис - це кількість генів, які значно диференційовано експресуються (k) порівняно із загальною кількістю генів у категорії (K). По осі ординат – значимість збагачення, виражена як логарифм (значення P). (A) Набори генів GO, отримані з послідовності РНК нейтрофілів, порівнюючи NLR_High з NLR_Low. (B) Набори генів GO, отримані з послідовності РНК лімфоцитів. Набори генів у нижньому лівому куті обох графіків є найменш значущими. Набори генів у верхньому правому куті обох графіків є найбільш значущими.

Малюнок 4 (продовження)

Щоб дослідити природу диференційовано експресованих генів, ми провели GSEA з категоріями генної онтології (GO) для біологічних процесів, використовуючи значно диференційовано експресовані набори генів між NLR_High і NLR_Low. Результати показано на діаграмах розсіювання бульбашок (рис. 4). Виділення наборів генів у верхньому правому куті кожної з ділянок показує (1) високий відсоток генів у наборах генів, які значно змінені, і (2) високий ступінь значущості для збагачення набору генів. У нашому зразку діаграми розсіяних бульбашок показали збагачення категорій комплементу та гуморальної відповіді GO незалежно як для нейтрофілів, так і для лімфоцитів. У нейтрофілах набори генів для класичного шляху активації комплементу, регуляції каскаду активації білка та гуморальної імунної відповіді, опосередкованої циркулюючим імуноглобуліном, були найбільш значущими з найвищим відсотком членів набору генів, які значно змінилися (Малюнок 4A). Незалежно від цього було виявлено, що ідентичні набори генів у лімфоцитах також мають високий відношення значно змінених генів і ступінь значущості, як у дослідженнях нейтрофілів (рис. 4B).

Таблиця 2. Набори імунологічних генів у нейтрофілах і лімфоцитах

У таблиці 2 наведено найбільш істотно змінені набори імунологічних генів у нейтрофілах (таблиця 2, панель A) і лімфоцитах (таблиця 2, панель B). У цьому дослідженні порівнювали експресію генів у нейтрофілах або лімфоцитах у зразках NLR_High і NLR_Low. Контрольні зразки здорового NLR_не порівнювали, оскільки їхні рівні експресії збігалися зі зразками пацієнтів із NLR_High і NLR_Low як у всьому транскриптомі, так і в наборах генів із значною різницею експресії. Крім того, контрольні зразки здорових NLR_ не збігалися за віком, захворюванням і станом хірургічного втручання (додаткові малюнки 1 і 2). Як у нейтрофілах (таблиця 2), так і в лімфоцитах (таблиця 2) дані вказують на те, що експресія наборів генів, пов’язаних з імунною системою, значно відрізнялася, коли NLR_High порівнювали з NLR_Low . На послідовності РНК кожен тип клітин має ті самі знахідки, що й інший тип клітин. В обох панелях рівні значущості основних наборів генів максимізувалися при P < 1E-24. Ці дані були дуже значущими незалежно від того, чи досліджували нейтрофіли чи лімфоцити. Щоб зосередитися на дуже значущій області вмісту цього дослідження RNA-seq, було досліджено значно диференційовано експресовану експресію гена імуноглобуліну. По-перше, графік аналізу головних компонентів генів нейтрофілів показав, що для NLR_High проти NLR_Low гени імуноглобулінів, які значно диференційовано експресуються, були розділені на 2 групи (додатковий малюнок 3A). Як альтернатива, гени лімфоцитів NLR_High проти NLR_Low перекриваються (додатковий малюнок 3A). Потім комбіновану теплову карту експресії імунозалежних генів між NLR_High і NLR_Low порівнювали в нейтрофілах і лімфоцитах (рис. 5). Загалом, коли досліджується вся теплова карта, спостерігається очевидне зниження регуляції всього сімейства генів імуноглобулінів у групі нейтрофілів NLR_High порівняно з групою NLR_Low. Більшість генів (69/156, 44%) були пов'язані з імуноглобуліном. Лише 12 із 156 (7,7%) генів були пов’язані з комплементом: C1QA, C1QB, Serping1, C2, C2R, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CFH, CFD і CD59. У групі лімфоцитів також спостерігалося зниження регуляції переважно генів імуноглобулінів у категорії NLR_High.

Набори генів комплементу в нейтрофілах і лімфоцитах детально описані в таблиці 3. Як у нейтрофілах (таблиця 3), так і в лімфоцитах (таблиця 3) експресія генів у 3 наборах генів, пов’язаних із системою комплементу, значно відрізнялася (P < 1E{{ 5}}), коли зразки NLR_High порівнювали з зразками NLR_Low. Це спостереження було однаковим незалежно від того, чи проводилося порівняння РНК нейтрофілів чи лімфоцитів. 3 набори генів включають активацію комплементу, класичний шлях активації комплементу та регуляцію активації комплементу. Діаграма аналізу головних компонентів генів нейтрофілів знову показала, що для NLR_High проти NLR_Low гени комплементу, що суттєво диференційовано експресуються, були розділені на 2 групи (додатковий малюнок 3B). Як альтернатива, гени лімфоцитів NLR_High проти NLR_Low перекриваються (додатковий малюнок 3B).

Рисунок 5. Теплова карта значно диференційовано експресованих генів у наборі генів імуноглобулінів у нейтрофілах (ліворуч) і лімфоцитах (праворуч). Гени, зазначені праворуч від кожної теплової карти, є членами імуноглобуліну

Теплова карта експресії нейтрофілів і лімфоцитів пов’язаного з комплементом набору генів, що порівнює NLR_High з NLR_Low, показана на рисунку 6. У нейтрофілах величезна кількість генів була пригнічена в NLR_Висока кількість населення. У цьому наборі генів, подібно до наборів генів імуноглобулінів, більшість генів (69/ 86, 80%) були пов’язані з імуноглобуліном. Лише 12 із 86 (14%) були компонентами комплементу та регуляторними генами (C1QA, C1QB, SERPING1, C2, CR2, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CD59, CFH та CFD). У групі лімфоцитів загалом було менше експресії генів комплементу, а гени імуноглобулінів були дещо більш зниженими в групі NLR_High. Оскільки існує більше розуміння генів системи комплементу порівняно з генами систем імуноглобулінів, увага була зосереджена на системі комплементу як потенційному кандидаті на гени-мішені, пов’язані з високим і низьким NLR. Було підготовлено зведену теплову карту, що порівнює NLR_High з NLR_Low, демонструючи експресію системи комплементу та пов’язаних генів у зразках нейтрофілів і лімфоцитів (рис. 7). Здебільшого лімфоцит не є системою клітин-резервуарів для системи комплементу. Більшість генів комплементу не регулюються в лімфоцитах. Лише C1S, CR2, C5, C8G, C5 і CFB були присутні з різницею в експресії між NLR_High і NLR_Low лімфоцитами (рис. 7). CD81 в лімфоцитах є В-клітинним тетраспаніном. Експресії C1S і C8G значно вищі в NLR лімфоцитів_Високі, ніж у NLR лімфоцитів_Низькі, схожі на KLKB1, ген прекалікреїну плазми.

Навпаки, у нейтрофілах NLR_High продемонстрував зниження регуляції генів компонентів комплементу C1QA, C1QB, C1QC, SERPING1, C1R, C4BPA, C3 та C3AR1, а також їх регуляторних (інгібіторних) генів комплементу CD59, CFB і CFI . У пацієнтів з NLR_High_N спостерігалося посилення регуляції лише генів C2 і CFD. CD59 і C9 відносно активовані у NLR_Now_N нейтрофілів порівняно з NLR_High_N. FGFR4 є рецептором фактора росту. CFH був присутній, але, здається, на нього не впливали NLR нейтрофілів_Високий або NLR_Низький. Більшою мірою він виражений в лімфоцитах.

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

Натисніть тут, щоб переглянути продукти Cistanche Enhance Imunity

【Запитуйте більше】 Електронна пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Обговорення

NLR на диференціальній кількості лейкоцитів став широко використовуваним простим маркером для розпізнавання потенційних шкідливих наслідків у широкому діапазоні захворювань, включаючи ССЗ, солідні пухлини та запальні захворювання, такі як системний червоний вовчак і системний склероз. У наших власних ретроспективних дослідженнях пацієнтів з атеросклеротичним серцево-судинним захворюванням ми помітили, що пацієнти з високим рівнем NLR мають вищий рівень пізньої смертності після планової пластики аневризми аорти, вищий рівень пізнього інсульту/смертності після профілактичної каротидної ендартеректомії та зниження виживаності без ампутації після планова стегново-підколінна реваскуляризація, якщо їх рівень NLR підвищений.14-16 Нинішні дослідження були розпочаті, щоб знайти механістичну основу високого рівня NLR. лімфома, множинні солідні пухлини та запальні захворювання, такі як системний червоний вовчак і системна склеродермія. У наших власних ретроспективних дослідженнях пацієнтів з атеросклеротичним серцево-судинним захворюванням ми помітили, що пацієнти з високим рівнем NLR мають вищий рівень пізньої смертності після планової пластики аневризми аорти, вищий рівень пізнього інсульту/смертності після профілактичної каротидної ендартеректомії та зниження виживаності без ампутації після планова стегново-підколінна реваскуляризація, якщо їх рівень NLR підвищений.14-16 Нинішні дослідження були розпочаті, щоб знайти механістичну основу високого рівня NLR.

Таблиця 3. Набори генів комплементу в нейтрофілах і лімфоцитах

Щоб розробити неупереджений підхід щодо механізму (механізмів) диференціального впливу NLR на серцево-судинні результати, ми виконали RNA-seq нейтрофілів і лімфоцитів тих самих пацієнтів. Для цього дослідження всі пацієнти із захворюванням аорти були проспективно зібрані та згруповані в категорії NLR за їхніми результатами. Останні 6 зразків у кожному з 2 типів клітин були відібрані за найвищим рівнем їхнього RIN у підготовленій РНК спарених зразків нейтрофілів і лімфоцитів без урахування статі, віку або попередніх захворювань. Як можна побачити в таблиці 1, пацієнти в групах NLR_High і NLR_Low були досить подібними і відрізнялися лише за своїм NLR.

Якість РНК, використаної в цьому дослідженні, демонструє RIN і повна сегрегація моделі експресії генів між нейтрофілами та лімфоцитами в усіх зібраних групах пацієнтів (високий NLR, низький NLR та контрольна група) (рис. 1). Діаграма аналізу основних компонентів показує, що контрольні дані NLR_не були доречними в цьому дослідженні, оскільки NLR пацієнтів збігався з NLR_High і NLR_Low у популяціях нейтрофілів і лімфоцитів пацієнтів . Аналіз GSEA дав чудове уявлення про те, які набори генів були збагачені наборами генів GO біологічних процесів, і діаграма розсіяного бульбашки чітко продемонструвала це, побудувавши логарифм значущості проти відношення кількості змінених генів до загальної кількості генів в наборах генів. Під час перегляду набори генів, які виділяються з усього списку, належали до гуморального (імуноглобулінового) імунітету та системи комплементу (таблиці 2 і 3) на основі співвідношення та статистичної значущості в підході неупередженого відкриття.

Важко працювати з великою кількістю задіяних генів імуноглобулінів гуморального імунітету, оскільки важливі відмінності між цими генами недостатньо відомі. Крім того, набагато більше відомо про систему комплементу, і зосередженість на класичній системі комплементу, яка активується імуноглобуліном, є впізнаваною мішенню для запалення та захворювань, пов’язаних з імуноглобулінами. Наші дані свідчать про те, що гени класичних компонентів комплементу C1QA, C1QB, C1R, CR1, C1S, SERPING1, C2, C4BPA, C3 C3AR1, C8G, C9 та кілька регуляторних генів (CD59, CFB CFI та CFH) знижуються в нейтрофілах пацієнтів. з високим NLR (рис. 7). Ці висновки вражають з трьох причин. По-перше, задіяні гени переважно належать до класичного шляху комплементу. По-друге, у пацієнтів з високим NLR ці гени комплементу здебільшого знижуються порівняно з генами з низьким NLR. Нарешті, більше F12 експресується в нейтрофілах із зразків NLR_High, ніж у зразках NLR_Low. Ферментативні форми білкового продукту F12 (фактор XII [FXII]) активують класичний шлях комплементу та нейтрофілів.20 Навпаки, PLG, ген плазміногену та активатор FXII, знижується в лімфоцитах і нейтрофілах пацієнтів із NLR{ {21}}Високий, припускаючи, що сама активація FXII може бути регулятором активації комплементу.

Крім того, було показано, що класична система комплементу бере участь у прискоренні ССЗ. Компонент комплементу 1q (C1q) є початковим фактором шляху комплементу, який відіграє важливу роль як у вродженій, так і в набутій імунній системі.21 Показано, що C1q виконує подвійну роль, позитивний і негативний вплив на атеросклероз.22 У класичному шляхом комплементу, C1q відіграє захисну роль на ранній стадії атеросклерозу, регулюючи молекулярний сигнал макрофагів через комплементнезалежний шлях, модулюючи поглинання атерогенного ліпопротеїну, опосередковуючи апоптотичні клітини та елімінацію клітинних уламків.23,24 Недавнє дослідження Джіа et al23 вказує на те, що знижений рівень C1q у сироватці пов’язаний з ІХС. Інше дослідження, проведене Guo et al24, показує, що підвищена активність C1q пов’язана з ІХС. Нарешті, останні дослідження показують, що пацієнти з діабетом зі зниженим C1q мають скорочену виживаність.25 Ці дані вказують на те, що дослідження системи комплементу може бути важливим для розуміння опосередкованого запаленням патогенезу серцево-судинних захворювань.

Рисунок 6. Теплова карта значно диференційовано експресованих генів у наборі генів комплементу в нейтрофілах (ліворуч) і лімфоцитах (праворуч). Гени, перелічені праворуч від кожної теплової карти, є членами набору генів комплементу. РНК отримано з нейтрофілів або лімфоцитів, зібраних у пацієнтів із високим (NLR_High) або низьким (NLR_Low) NLR. Шість окремих зразків NLR_High порівнюються з 6 окремими зразками NLR_Low як нейтрофілів, так і лімфоцитів.

Малюнок 7. Композитна теплова карта комплементу та споріднених генів з нейтрофілів або лімфоцитів NLR_Високий або NLR_Низький. У кожній категорії комбінована теплова карта була підготовлена ​​з 6 окремих зразків РНК-seq з кожного типу клітин.

Recently, a retrospective investigation of the data from the CANTOS, JUPITER, SPIRE-1, SPIRE-2, and CIRT trials on 60 087 patients was conducted to determine whether NLR predicts major adverse CV events and is modified by anti-inflammatory therapy.26 NLR modestly correlated (ie, r 2 ≤ 0.26) with interleukin 6, C-reactive protein, and fibrinogen levels but minimally with lipids.25 In all 5 trials, NLR predicted incident CV events and death in patients with NLR >3.08.26 Хоча зниження ліпідів не вплинуло на NLR, протизапальна терапія канакінумабом, інгібітором інтерлейкіну 1, знизила NLR (P < 0,0001).26 Ці дані свідчать про те, що NLR може бути маркером ССЗ незалежно від ліпідів і вплив статинів. Цей спеціальний аналіз кількох проспективних рандомізованих досліджень свідчить про те, що NLR може бути незалежним фактором ризику смертності від серцево-судинних захворювань.

У цьому дослідженні є деякі обмеження. Наші препарати нейтрофілів мали 4% лімфоцитів і 2% моноцитів за допомогою проточної цитометрії. Оскільки відомо, що нейтрофіли не синтезують імуноглобулін, зміни гена нейтрофільного імуноглобіну можуть бути викликані забрудненням В-клітин. При аналізі EPIC спостерігалося значне збільшення контамінації B-клітин у зразках NLR-Low. Це спостереження свідчить про те, що підвищення рівня генів імуноглобулінів у зразках NLR_Low нейтрофілів може виникнути через контамінацію B-клітин. Таким чином, зниження генів імуноглобулінів у зразках NLR_High може бути наслідком збільшення кількості В-клітин у зразках NLR_Low і не обов’язково знижених рівнів гена імуноглобуліну в зразках NLR_High. Так само не відомо, що нейтрофіли є клітинами, що продукують комплемент. Два відсотки забруднення моноцитами можуть бути джерелом генів комплементу. Однак, використовуючи дані послідовності РНК, ми помітили, що немає суттєвої різниці в забрудненні моноцитами препаратів нейтрофілів між NLR_Low і NLR_High. Крім того, виконання EPIC аналізу даних RNA-seq показує, що контамінація моноцитів була<0.1% (<1:1000) of the neutrophil preparations, indicating that the RNA-seq was unlikely influenced by contaminating monocytes (Figure 3). The contaminating B cells in the NLR_Low samples do not influence the complement data observed. Finally, even now, it is not known that the changes we observed in complement and immunoglobulin genes are specific to vascular surgery patients with high NLR or older patients in general. NLR and genetic studies need to be performed on healthy age- and sex-matched patients without CVD.

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

Підсумовуючи, кардинальним відкриттям у цьому дослідженні є те, що в станах з високим рівнем NLR багато генів компонентів комплементу та деякі з їхніх регуляторів знижуються в нейтрофілах. Незрозуміло загальне значення та стан активації ідентифікованих генів комплементу зі зниженою регуляцією. Оскільки набори генів комплементу вражаюче зменшені, ми припускаємо, що в осіб із NLR_високою та скороченою післяопераційною виживаністю втрачаються основні захисні механізми серцево-судинної системи, які забезпечуються системами комплементу. Цю оцінку необхідно проспективно вивчити в ході клінічних досліджень на предмет механізму(ів), що лежить в основі цього результату.

Список літератури

1. Росс Р. Атеросклероз–запальне захворювання. N Engl J Med. 1999;340(2):115-126.

2. Гец Г.С. Серія тематичних оглядів: імунна система та атерогенез. Імунна функція в атерогенезі. J Lipid Res. 2005;46(1):1-10.

3. Hansson GK, Hermansson A. Імунна система при атеросклерозі. Nat Immunol. 2011;12(3):204-212.

4. Даффі Б.К., Гурм Х.С., Раджагопал В., Гупта Р., Елліс С.Г., Бхатт Д.Л. Корисність підвищеного співвідношення нейтрофілів до лімфоцитів для прогнозування довгострокової смертності після черезшкірного коронарного втручання. Am J Cardiol. 2006;97(7):993-996.

5. Tamhane UU, Aneja S, Montgomery D, Rogers EK, Eagle KA, Gurm HS. Зв'язок між співвідношенням нейтрофілів і лімфоцитів при прийомі та результатами у пацієнтів з гострим коронарним синдромом. Am J Cardiol. 2008;102(6):653-657.

6. Gibson PH, Croal BL, Cuthbertson BH та ін. Передопераційне співвідношення нейтрофілів і лімфоцитів і результат аортокоронарного шунтування. Am Heart J. 2007;154(5):995-1002.

7. Fici F, Celik T, Balta S та ін. Порівняльні ефекти небівололу та метопрололу на ширину розподілу еритроцитів і співвідношення нейтрофілів/лімфоцитів у пацієнтів із вперше діагностованою есенціальною гіпертензією. J Cardiovasc Pharmacol. 2013;62(4):388-393.

8. Караман М., Балта С., Ай С.А. та ін. Порівняльні ефекти валсартану та амлодипіну на рівні vWf і співвідношення N/L у пацієнтів із вперше діагностованою гіпертензією. Clin Exp Hypertens. 2013;35(7):516-522.

9. Uthamalingam S, Patvardhan EA, Subramanian S та ін. Корисність співвідношення нейтрофілів і лімфоцитів у прогнозуванні віддалених результатів при гострій декомпенсованій серцевій недостатності. Am J Cardiol. 2011;107(3):433-438.

10. Бхат ТМ, Афарі М.Е., Гарсіа Л.А. Співвідношення нейтрофільних лімфоцитів при захворюваннях периферичних судин: огляд. Expert Rev Cardiovasc Ther. 2016;14(7):871-875.

11. Bhutta H, Agha R, Wong J, Tang TY, Wilson YG, Walsh SR. Співвідношення нейтрофілів і лімфоцитів прогнозує середньострокове виживання після планової великої судинної операції: перехресне дослідження. Vasc Endovasc Surg. 2011;45(3):227-231.

12. Епплтон Н.Д., Бейлі Д.М., Морріс-Стіфф Г., Льюїс М.Х. Співвідношення нейтрофілів і лімфоцитів прогнозує періопераційну смертність після відкритого планового лікування аневризм черевної аорти. Vasc Endovasc Surg. 2014;48(4):311-316.

13. Бат Дж., Сміт Дж. Б., Крузе Р. Л., Фогель Т. Р. Співвідношення нейтрофілів і лімфоцитів прогнозує тяжкість захворювання та результат після операцій на нижніх кінцівках. J Vasc Surg. 2020; 72 (2): 622-631.

14. Кінг А. Х., Шмаєр А. Х., Харт К. К. та ін. Підвищене співвідношення нейтрофілів і лімфоцитів є прогнозом смертності після планового ендоваскулярного лікування аневризми. J Vasc Surg. 2020; 72 (1): 129-137.

15. King AH, Kim AH, Kwan S та ін. Підвищене співвідношення нейтрофілів до лімфоцитів асоціюється з гіршими результатами після каротидної ендартеректомії у безсимптомних пацієнтів. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2021;30(12):106120.

16. King AH, Kwan S, Schmaier AH та ін. Підвищене співвідношення нейтрофілів до лімфоцитів асоціюється зі зниженням виживаності без ампутації після стегново-підколінної черезшкірної реваскуляризації. Int Angiol. 2021;40(5):442-449.

17. Racle J, de Jonge K, Baumgaertner P, Speiser DE, Gfeller D. Одночасне перерахування типів раку та імунних клітин з масових даних експресії генів пухлини. Elife. 2017;6:e26476.

18. Trapnell C, Roberts A, Goff L та ін. Диференціальний аналіз експресії генів і транскриптів експериментів RNA-seq з TopHat і Cufflinks. Nat Protoc. 2012; 7 (3): 562-578.

19. Палмер С, Діен М, Алізаде А.А., Браун П.О. Специфічні для клітинного типу профілі експресії генів лейкоцитів у периферичній крові людини. BMC Genomics. 2006; 7: 115.

20. Stavrou EX, Fang C, Bane KL та ін. Фактор XII і uPAR посилюють функції нейтрофілів, впливаючи на загоєння ран. J Clin Invest. 2018; 128 (3): 944-959.

21. Dunkelberger JR, Song WC. Комплемент і його роль у вроджених і адаптивних імунних реакціях. Cell Res. 2010;20(1):34-50.

22. Speidl WS, Kastl SP, Huber K, Wojta J. Комплемент при атеросклерозі: друг чи ворог? J Thromb Haemost. 2011;9(3):428-440.

23. Jia Y, Wen W, Yang Y та ін. Клінічна роль комбінованого C1q сироватки та hsCRP у прогнозуванні ішемічної хвороби серця. Clin Biochem. 2021;93:50-58.

24. Guo S, Mao X, Li X, Ouyang H, Gao Y, Ming L. Активність сироваткового комплементу C1q пов’язана з обструктивним захворюванням коронарних артерій. Front Cardiovasc Med. 2021; 8: 618173.

25. Cavusoglu E, Kassotis JT, Anwar A та ін. Корисність комплементу C1q для прогнозування 10--річної смертності у чоловіків із цукровим діабетом, яких направляють на коронарографію. Am J Cardiol. 2018;122(1):33-38.

26. Адамштайн Н.Х., МакФадьєн Дж.Г., Роуз Л.М. та ін. Співвідношення нейтрофілів і лімфоцитів і атеросклеротичні події: аналіз п'яти сучасних рандомізованих досліджень. Eur Heart J. 2021;42(9):896-903.