Місце вразливості на спайку SARS-CoV-2 індукує широко захисні антитіла проти антигенно відмінних підваріантів Omicron

Швидка еволюція варіантів Омікрон, викликаного важким гострим респіраторним синдромом коронавірусу 2 (SARS-CoV-2), підкреслила необхідність ідентифікації антитіл із широкими нейтралізуючими можливостями для інформування про майбутні моноклональні терапії та стратегії вакцинації. Тут ми ідентифікували S728-1157, широко нейтралізуюче антитіло (bnAb), націлене на сайт зв’язування рецепторів (RBS), яке було отримано від особи, раніше інфікованої WT SARS-CoV-2 до поширення варіанти занепокоєння (ЛОС). S728-1157 продемонстрував широку перехресну нейтралізацію всіх домінуючих варіантів, включаючи D614G, Beta, Delta, Kappa, Mu та Omicron (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/ BL.1/XBB). Крім того, S728-1157 захищав хом’яків від заражень in vivo вірусами WT, Delta та BA.1. Структурний аналіз показав, що це антитіло націлено на епітоп класу 1/RBS-A в домені зв’язування рецептора через численні гідрофобні та полярні взаємодії з регіоном 3, що визначає комплементарність важкого ланцюга (CDR-H3), на додаток до загальних мотивів у CDR-H1/ CDR-H2 антитіл класу 1/RBS-A. Важливо, що цей епітоп був легше доступним у відкритому стані та стані попереднього злиття або в конструкціях шипів, стабілізованих гексапроліном (6P), порівняно з конструкціями дипроліну (2P). Загалом, S728-1157 демонструє широкий терапевтичний потенціал і може стати основою для цільової розробки вакцин проти майбутніх варіантів SARS-CoV-2.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

вступ

З початку пандемії в грудні 2019 року вірус важкого гострого респіраторного синдрому, коронавірус 2 (SARS-CoV-2) призвів до понад 660 мільйонів випадків коронавірусної хвороби 2019 (COVID-19) і понад 6,5 мільйонів смертей у всьому світі. Незважаючи на те, що швидкий розвиток і розповсюдження вакцин і терапевтичних препаратів значною мірою стримували вплив COVID-19, поява циркулюючих варіантів, що викликають занепокоєння (ЛОС), продовжує становити серйозну загрозу через потенціал подальшого ухилення від імунітету. і підвищена патогенність. Варіант D614G був найпершим варіантом, який з’явився, і згодом став загальнодомінуючим. Порівняно з WT, варіант D614G продемонстрував підвищену трансмісивність, а не підвищену патогенність, і тому малоймовірно, щоб знизити ефективність вакцин у клінічних випробуваннях (1). У період між появою D614G і до жовтня 2021 року в усьому світі виникли ще 4 значні ЛОС, зокрема Альфа, Бета, Гамма та Дельта. Серед цих варіантів Delta став серйозною глобальною загрозою через його трансмісивність, підвищену тяжкість захворювання та часткове ухилення від імунітету, про що свідчить знижена здатність поліклональної сироватки та моноклональних антитіл нейтралізувати цей штам (2–6). Незабаром після цього, у листопаді 2021 року, варіант Omicron був ідентифікований і оголошений новим VOC. Цей варіант мав найбільшу кількість мутацій на сьогоднішній день і, здається, поширювався швидше, ніж попередні штами (7, 8). Наразі існує широкий діапазон субліній Omicron, що призводить до нових випадків COVID-19, причому BQ.1, BQ.1.1 і XBB.1.5 стають домінуючими над BA.5 і становлять більшість нових випадків у світі на той час. написання. Варіанти Omicron можуть різною мірою уникнути розпізнавання імунітетом, пов’язаним із вакциною проти COVID-19, тим самим значно знижуючи нейтралізуючу дію сироваткових антитіл у реконвалесцентів, повністю вакцинованих мРНК осіб та осіб, які отримали новий двовалентний препарат WT/BA.5. мРНК-вакцина (9, 10). Подібним чином, варіанти Omicron змогли уникнути зв’язування кількох терапевтичних моноклональних антитіл із дозволом на екстрене використання (EUA), навіть якщо раніше було показано, що вони ефективні проти попередніх ЛОС (10–12). Через низьку нейтралізацію проти Omicron і триваючу загрозу майбутніх летких органічних сполук існує нагальна потреба визначити широкі та потужні нейтралізуючі антитіла, які могли б захистити від різноманітних ліній SARS-CoV-2, що розвиваються. У цьому дослідженні ми ідентифікували потужні рецепторно-зв’язуючі доменно-реактивні (RBD-реактивні) mAb із периферичної крові реконвалесцента SARS-CoV-2, які ефективно нейтралізували альфа, бета, каппа, дельта, Mu, і варіанти Omicron (BA.1, BA.2, BA.2.75, BA.4, BA.5, BL.1 і XBB). Це mAb, S728-1157, значно знизило вірусне навантаження BA.1 Omicron, Delta та WT у легенях і слизовій оболонці носа після зараження in vivo у хом’яків. S728-1157 зв’язує сайт зв’язування рецептора (RBS), який повністю відкритий, коли RBD на спайку знаходиться у верхній конформації. mAb використовує мотиви, знайдені в CDR-H1 і CDR-H2, які є спільними для IGHV3-53/3-66 антитіл класу 1/RBS-A (13, 14), а також через численні унікальні контакти з CDR -H3, щоб уникнути мутацій у спайках ЛОС. Це свідчить про те, що раціональний дизайн майбутніх посилень вакцини, які охоплюють варіанти Omicron, слід змінити, щоб представити стабілізований сплеск у конфігурації здебільшого вгору, щоб оптимально індукувати моноклональні антитела класу 1/RBS-A, які мають схожі характеристики CDR-H3.

Cistanche корисний для зміцнення імунної системи

Результати

Виділення RBD-реактивних mAb, які демонструють різноманітні моделі нейтралізації та активності. До розповсюдження ліній Omicron ми раніше охарактеризували 43 моноклональні антитела, націлені на різні епітопи спайкового білка, включаючи N-кінцевий домен (NTD), RBD і субодиницю 2 (S2). Жодне з цих антитіл не змогло нейтралізувати циркулюючі на той час варіанти SARS-CoV-2 (15). У цьому дослідженні додаткова панель RBD-реактивних mAb була експресована у 3 осіб із високою реакцією, які показали надійні антиспайкові відповіді IgG, як визначено раніше (16) (Додаткові таблиці 1 і 3; додатковий матеріал доступний онлайн разом із цією статтею; https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1). Незважаючи на те, що частка В-клітин, що зв’язують спайк RBD, була подібною у пацієнтів із високою відповіддю порівняно з особами із середньою та низькою відповіддю (рис. 1, A–C), частота соматичної гіпермутації важкого ланцюга була значно вищою в групі пацієнтів із високою відповіддю (рис. 1). , D і E), що свідчить про те, що ці особи можуть мати найвищий потенціал для генерування потужних перехресно-реактивних моноклональних антитіл (16). Ці антитіла були додатково досліджені проти мутантів RBD, щоб визначити їх класифікацію епітопів (17). Серед 14 RBD-реактивних mAb ми ідентифікували 4 mAb класу 2, 2 mAb класу 3 і 8 некласифікованих mAb, які показали незначне зниження зв’язування з будь-якими перевіреними ключовими мутантами RBD (рис. 1F). Слід зазначити, що антитіла класу 2, класу 3 та класу 4 приблизно відповідають епітопам RBS BD, S309 та CR3022, визначеним у попередніх дослідженнях (13, 18). mAb класу 2 і 3 RBD не розпізнали мультиваріантний мутант RBD, що містить заміни K417N/E484K/L452R/N501Y, штучно створений RBD для включення ключових мутацій для виходу вірусу (17, 18), а також не продемонстрували жодної перехресної реактивності з RBD SARS-CoV-1 і близькосхідного респіраторного синдрому (MERS)-CoV (рис. 1F). Функціонально моноклональні антитела RBD класу 2 і 3 потужно нейтралізували варіанти D614G і Delta, але нейтралізуюча активність була більш обмеженою щодо бета-, каппа- та му (рис. 1G). Жодне з досліджених антитіл класу 2 чи 3 не нейтралізувало жодного протестованого варіанту Омікрон.

Навпаки, більшість некласифікованих mAb зв’язувалися з мультиваріантним RBD і перехресно реагували на SARS-CoV-1 RBD (рис. 1F). Серед них ми ідентифікували 3 mAb, S451-1140, S626-161 і S728-1157, які показали високу нейтралізуючу ефективність проти D614G і перехресно нейтралізованих бета, дельта, каппа, Mu та Омікрон BA.1 із 99% інгібіторною концентрацією (IC99) у діапазоні 20–2500 нг/мл (рис. 1G). Враховуючи широку нейтралізуючу ефективність цих 3 моноклональних антитіл, окрім платформи для аналізу бляшок, ми також провели нейтралізаційну активність щодо автентичних BA.2.75, BL.1 (BA.2.75+R346T), BA.4, Віруси BA.5 і XBB з використанням тесту нейтралізації зменшення фокусу (FRNT) (рис. 1G). З них S728-1157 продемонстрував високу нейтралізуючу активність проти панелі варіантів Omicron, включаючи BA.1, BA.2, BA.4 і BA.5, з IC99 до 100 нг/мл, як виміряно за допомогою аналіз зубного нальоту. Подібний сценарій спостерігався за допомогою FRNT, де S728-1157 зберігав свою високу нейтралізуючу активність щодо BA.2.75, BL.1, BA.4, BA.5 та XBB з IC50 у діапазоні 8–300 нг /мл (Малюнок 1G). S451-1140 потужно нейтралізував BA.1, BA.2, BA.2.75 і BL.1, але не BA.4 і BA.5, як спостерігалося в обох платформах аналізу нейтралізації. З іншого боку, S626-161 не продемонстрував нейтралізуючої активності проти варіантів Omicron, крім варіанта BA.1 (рис. 1G). Незважаючи на те, що S626-161 мав нижчу нейтралізуючу ефективність щодо досліджуваних ЛОС, ніж інші 2 антитіла, це було єдине mAb, яке показало перехресну реактивність не лише до SARS CoV-1 RBD, але й могло нейтралізувати кажанів коронавіруси WIV-1 і RsSHC014 (рис. 1, F і G). Ці дані свідчать про те, що S626-161 розпізнає консервативний епітоп, який є спільним між цими лініями арбовірусів, але відсутній у штамах BA.2 і пізніших. Крім того, порівняно з S728-1157 і S451-1140, S626-161 має довший CDR-H3, що може забезпечити покращену здатність розпізнавати висококонсервативну ділянку залишків, спільних між арбовірусами, як описано у попередньому дослідженні (19) (додатковий малюнок 1). Порівнюючи варіабельні гени важкого (IGHV) і легкого ланцюга імуноглобуліну (IGLV або IGKV) цих 3 МАТ з доступною базою даних нейтралізуючих МАТ проти SARS-CoV-2 (13, 15, 20–27), ми виявили, що важкий ланцюг варіабельні гени, що використовуються S728-1157 (IGHV3-66), S451-1140 (IGHV3-23) і S626-161 (IGHV4-39) мають раніше повідомлялося, що він кодує кілька сильно нейтралізуючих SARS-CoV-2 антитіл, націлених на RBD (21, 22, 28, 29). Однак лише S728-1157 мав унікальні пари варіабельних генів важкого та легкого ланцюгів, про які не було повідомлено в базі даних (додаткова таблиця 3), що вказує на те, що це не загальнодоступний клонотип.

Рисунок 1. Характеристика RBD-реактивних mAb, виділених від COVID-19-одужуючих осіб

Ці 3 mAb (S451-1140, S626-161 і S728-1157) були додатково охарактеризовані, щоб визначити їхню ширину зв’язування з VOC SARSCoV-2 (рис. 2, A і B) . Показано, що спайк, стабілізований за допомогою попереднього злиття, містить 2-заміни проліну в субодиниці S2 (2P; дипролін), є кращим імуногеном порівняно зі спайком WT і є основою кількох сучасних SARS-CoV-2 вакцини, включаючи вакцини на основі мРНК (30, 31). Нещодавно було повідомлено, що спайковий білок, стабілізований 6 пролінами (6P; гексапролін), посилює експресію та є навіть більш стабільним, ніж вихідна конструкція дипроліну; в результаті її було запропоновано використовувати в наступному поколінні вакцин проти COVID-19 (32, 33). Щоб визначити, чи існують відмінності в антигенності між спайковими конструкціями дипроліну та гексапроліну, обидва імуногени були включені в нашу тестову панель. Згідно з вимірюваннями за допомогою ELISA, ми виявили, що 3 mAbs зв’язували спайк-антиген 6P-WT більшою мірою порівняно зі спайком WT-2P (рис. 2, A і B). Усі 3 mAb показали порівнянне зв’язування зі спайками вірусів Альфа, Бета, Гамма та Дельта порівняно з WT-2P (рис. 2, A і B). Однак зв’язувальна здатність цих 3 mAb була суттєво знижена проти панелі антигенів сімейства Omicron (рис. 2, B і C). Зв’язування S{31}} було чутливим до мутацій, виявлених у BA.1 і BA.2, що призвело до значного зниження зв’язування та 31-кратного зниження нейтралізації проти цих варіантів порівняно з WT-2 Антиген P і вірус D614G відповідно (рис. 2B). Перехресно нейтралізуючі моноклональні антигени сарбековірусу, S626-161, також показали від 1.2- до 3.5-разів знижене зв’язування зі спайковим антигеном BA.1, що може бути причиною {{45} }кратне зниження активності нейтралізації проти BA.1 (Малюнок 1G і Малюнок 2, B і C). Для найпотужнішого широко нейтралізуючого антитіла (bnAb), S728-1157, зв’язування з антигенами Omicron було знижено меншою мірою (від 1.1- до 4.4-разів) порівняно з WT-2P сплеск і не вплинув на нейтралізуючу активність (Малюнок 1G і Малюнок 2, B і C). Істотне зниження зв’язування Omicron-нейтралізуючих mAb зі спайком BA.1 може бути наслідком змін у його рухливості та пов’язано з щільним упакуванням структур Omicron 3-RBD-down і перевагою для 1- RBD, які допомагають уникати антитіл, як повідомлялося в попередньому дослідженні (34). Стабілізуючі мутації 2P і 6P також мають відмінні ефекти у варіантах Omicron, де всі 3 mAb показали більш ніж у 2.8-разове збільшення зв’язування зі спайком BA.1-6P порівняно з BA.1-2P версія, але лише незначно збільшила зв’язування зі спайковими версіями BA.2 і BA.4/5 6P порівняно з їх версіями 2P на 1,2 × до 1,4 ×, що свідчить про дещо кращу доступність Омікрон-нейтралізуючих МАТ для гексапольних версій, особливо для конструкції шипа BA.1. На додаток до ELISA для кількісного визначення швидкості зв’язування та констант рівноваги (kon, koff і KD) цих 3 mAb із панеллю спайк-антигенів використовували біошарову інтерферометрію (BLI) (додатковий малюнок 2). Швидкість розпізнавання кон зв’язування антигену фрагмента (Fab) зі спайками гексапроліну була від 1.5- до 3.3-разів швидшою порівняно зі спайками дипроліну (додатковий малюнок 2, B і C), показуючи, що антитіла зв'язуються з конструкцією 6P швидше, ніж з конструкцією 2P. Цього можна було б очікувати, якби епітопи були більш доступними на RBD у відкритому стані на шипі гексапроліну. За винятком S626- 161, Fabs дисоціювали від спайку гексапроліну повільніше (мали нижчий koff), ніж спайк дипроліну, так що загальна KD показала, що S728-1157 і S451-1140 зв’язувалися з шип гексапроліну з більшою спорідненістю (додатковий малюнок 2, B і C). Збільшення зв’язування зі спайком гексапроліну було ще помітнішим для інтактного IgG за моделлю взаємодії 1:2, як показано S728-1157 і S451- 1140 mAbs, що відповідає експозиції кількох епітопів із стабілізацією 6P, що дозволяє покращена авідність (додатковий малюнок 2, A і C). У сукупності ці результати свідчать про те, що цільові епітопи можуть бути порівняно більш доступними на 6P-стабілізованому спайку, коли RBD знаходиться у відкритому стані. Далі було проведено структурний аналіз, щоб підтвердити цю гіпотезу.

Рисунок 2. Ширина зв’язування Омікрон-нейтралізуючих МАТ

Структурний аналіз широко нейтралізуючих моноклональних антитіл. Як перше наближення зв’язаних епітопів, використовувався конкурентний аналіз ELISA, щоб визначити, чи перекриваються ці 3 широко нейтралізуючі mAb з нашою поточною панеллю mAb, колекцією mAb з відомою епітопною специфічністю з попередніх досліджень (15, 25, 35). , а також 2 інші моноклональні антитела, які наразі використовуються в клінічній практиці, LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) і REGN10933 (Regeneron) (37). Сайти зв’язування S451-1140 і S728-1157 частково перекривалися з CC12.3 (23, 25), нейтралізуючим антитілом класу 1, і більшістю антитіл класу 2, включаючи LY-CoV555 і REGN10933, але не з антитілами класу 3 і 4 (рис. 3A). S626-161 має значне перекриття в області зв’язування з CC12.3 класу 1, декількома антитілами класу 4, включаючи CR3022, та іншими некласифікованими антитілами, хоча частково збігається з кількома антитілами класу 2 та одним антитілам класу 3 (рис. 3A). Аналогічно, конкурентний аналіз BLI показав, що S451-1140 і S728-1157 сильно конкурували між собою за зв’язування зі спайком WT-6P, тоді як S626-161 ні (додатковий малюнок 3). Загалом ці дані свідчать про те, що S451-1140 і S728-1157 розпізнають подібні епітопи, які відрізняються від S626-161.

Рисунок 3. Механізм широкої нейтралізації S728-1157

Антитіло S728-1157 кодувалося IGHV3-66 і мало коротку область визначення комплементарності 3 (CDR-H3). Зокрема, mAb, які зв’язують RBS у режимі зв’язування 1 (тобто RBS-A або сайт класу 1), типові CC12.1, CC12.3, B38 та C105 (13, 18, 23, 29, 38, 39), схильні використовувати IGHV3-53 або 3-66 і чутливі до мутацій VOC (40). Однак ділянка CDR-H3 S728-1157 сильно відрізняється від інших антитіл цього класу, що потенційно пояснює його ширшу активність. Щоб зрозуміти структурну основу широкої нейтралізації S728-1157 у цьому епітопі, ми дослідили структуру кріоелектронної мікроскопії (кріо-ЕМ) (рис. 3B) IgG S728-1157 у комплексі зі спайком WT{ {31}}P-Mut7, версія spike WT-6P, що має міжпротомерний дисульфідний зв’язок на C705 і C883, із загальною роздільною здатністю приблизно 3,3 Å (додатковий малюнок 4E). Використовуючи методи розширення симетрії, цілеспрямованої класифікації та уточнення, ми досягли локальної роздільної здатності на інтерфейсі RBD-Fv приблизно до 4 Å (додатковий малюнок 4E та додаткова таблиця 8). Кристалічна структура S728-1157 Fab була визначена з роздільною здатністю 3,1 Å та використана для побудови атомної моделі на інтерфейсі RBD-Fv. Наші структури підтверджують, що S728-1157 зв’язував епітоп RBS-A (або клас 1) у конформації RBD-up (Малюнок 3B і Додатковий малюнок 4E), подібно до інших IGHV3-53/{{55} } антитіла (рис. 3C). Стеричне блокування сайту зв’язування ангіотензинперетворювального ферменту 2 (ACE2) за допомогою S728-1157 пояснює його високу нейтралізуючу ефективність проти SARS-CoV-2. Мотив 32NY33 і мотив 53SGGS56 (23) у S728-1157 CDR-H1 і -H2 взаємодіють з RBD майже так само, як CC12.3 (додатковий малюнок 4, B і C). Однак, порівняно з VH 98DF99 у CC12.3, VH 98DY99 у S728-1157 CDR-H3 утворює більші взаємодії, включаючи як гідрофобні, так і полярні взаємодії, з RBD, що може пояснити широку нейтралізацію ЛОС (рис. 3D і додаткові таблиці 6 і 7). Дигліцин VH 100GG101 у S728- 1157 CDR-H3 також може сприяти більш широкому зв’язуванню порівняно з VH Y100 у CC12.3, ймовірно, через гнучкість залишків гліцину, що призводить до іншої конформації кінчика CDR -H3 петля та відносний зсув залишків у 98DY99.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Натисніть тут, щоб переглянути продукти Cistanche Enhance Imunity

【Запитуйте більше】 Електронна пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Незважаючи на те, що VOC Omicron мають значні мутації в RBD, більшість із цих залишків не взаємодіють із S728-1157, оскільки зв’язування все ще спостерігається (додатковий малюнок 4A). Згідно з нашою спайковою моделлю WT-6P-Mut7 + Fab S728-1157, Y505 до VL Q31 і E484 до VH Y99 передбачають утворення водневих зв’язків (додатковий малюнок 4D і додаткова таблиця 6 ), які можуть бути порушені мутаціями Omicron Y505H і E484A. Однак мутація Y505H все ще допускатиме водневий зв’язок з VL Q31, а мутація E484A додасть інший гідрофобний бічний ланцюг біля гідрофобних залишків VL Y99, F456 та Y489. Ці контакти можуть пояснити, частково, механізм, який дозволяє S728-1157 зберігати нейтралізуючу активність, хоча й знижену, проти антигену BA.1 (Малюнок 1G і Малюнок 2B). Антиген BA.1, у свою чергу, можливо, пов’язаний з мутаціями Omicron, які змінюють конформаційний ландшафт спайкового білка (34). Однак кілька соматично мутованих залишків, тобто VH L27, L28, R31, F58 і VL V28 і Q31, у S728-1157 беруть участь у взаємодії з SARS-CoV-2 RBD (додатковий малюнок 1 і Додаткова таблиця 7), яка також може сприяти його широкій реактивності порівняно з CC12.3. Загалом наші структурні дослідження виявили основу широкої нейтралізації S728-1157, яка може вмістити більшість мутацій у ЛОС SARS-CoV-2.

Рисунок 4. Захисна ефективність bnAbs проти інфекції SARS-CoV-2 у хом’яків.

S728-1157 зменшує розмноження SARS-CoV-2 BA.1 Omicron, Delta та WT SARS-CoV-2 у сирійських хом’яків. Щоб оцінити захисну ефективність наших широко нейтралізуючих МАТ, ми використали модель зараження золотим сирійським хом’яком, яка широко використовується для SARS-CoV-2. Через 1 день після зараження вірусами SARS CoV-2 хом’яки отримували 5 мг/кг наших досліджуваних моноклональних антитіл або контрольного ізотипу, спрямованого на невідповідний антиген (глікопротеїн вірусу Ебола) шляхом внутрішньочеревної ін’єкції. Тканини легенів і носа збирали через 4 дні після інфікування (Фігура 4A). Терапевтичне введення S728-1157 призвело до зниження титрів варіантів WT, BA.1 Omicron і Delta як у носових раковинах, так і в легенях інфікованих хом’яків (рис. 4, B–D). Цікаво, що ефект S728-1157 у легенях був драматичним, зменшивши вірусне навантаження WT і BA.1 Omicron приблизно на 104 PFU, при цьому титри вірусу варіанту BA.1 Omicron були повністю скасовані (Рисунок 4C). На відміну від нейтралізації in vitro (Малюнок 1G), S451-1140 не зменшував реплікацію вірусу BA.1 Omicron у легенях і носових раковинах, що вказує на розрив між нейтралізацією in vitro та захистом in vivo для цього клону (Малюнок 4E). . Для порівняння, введення S626-161 призвело до незначно значущого зниження титрів легеневого вірусу після зараження WT і BA.1 (рис. 4, F і G). Ці дані підкреслюють, що для точного визначення широких захисних моноклональних антитіл потрібна оцінка ефективності захисту паралельно з активністю нейтралізації. Рухаючись вперед, буде цікаво вивчити, наскільки захисна здатність S728-1157 залежить від Fc. Загалом S728-1157 представляє багатообіцяюче mAb із широкою нейтралізуючою ефективністю проти варіантів SARS CoV-2, які здатні значно зменшувати реплікацію WT, Delta та BA.1 in vivo.

Інфекція SARS-CoV-2 рідко викликає потужні S728-1157-подібні перехресно нейтралізуючі МАТ. Враховуючи перехресну нейтралізацію та профілактичний потенціал S728-1157, ми намагалися оцінити, чи антитіла, схожі на S728–1157, зазвичай індукуються серед поліклональних відповідей у ​​пацієнтів із SARS-CoV-2. Щоб оцінити це, ми провели конкурентний ELISA з використанням реконвалесцентної сироватки для виявлення титрів антитіл до RBD, які могли б конкурувати за зв’язування з S728-1157 (рис. 5A). Суб'єкти були розділені на 3 групи на основі величини відповіді антитіл, як визначено раніше (15, 16). Хоча пацієнти з високою та помірною відповіддю мали вищі титри S728-1157–конкурентних сироваткових антитіл порівняно з особами з низькою відповіддю (рис. 5B), титри були досить низькими в усіх групах, що свідчить про те, що отримати високі рівні S{{ нечасто. 18}}–подібні антитіла в поліклональній сироватці після інфікування WT SARS-CoV-2. Окрім S728-1157, ми протестували конкуренцію реконвалесцентної сироватки з іншими mAb, включаючи S451- 1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933, CR3022 і CC12.3. Подібно до S728-1157, ми спостерігали відносно низькі титри антитіл, що конкурують з S451-1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933 і CC12.3 у поліклональній сироватці більшості реконвалесцентів осіб (рис. 5, C–F і H). Тим не менш, пацієнти з високим рівнем відповіді, як правило, мали значно вищі титри проти тих, що нейтралізують mAb, ніж пацієнти з низьким рівнем відповіді (рис. 5, B–F і H). Навпаки, антитіла, націлені на ділянку епітопу CR3022, були більш вираженими у реконвалесцентів, що свідчить про збагачення антитіл класу 4 RBD у поліклональній сироватці (рис. 5G). Примітно, що не було суттєвої різниці в титрах CR3022 у 3 групах респондерів, що свідчить про те, що антитіла до сайту CR3022- постійно індукувалися під час інфекції WT SARS-CoV-2 у більшості осіб. Цікаво, що порівняно з CC12.3 S728-1157 було виявлено в 4-разів нижчих рівнях у сироватці крові тих, хто добре відповів. Таким чином, незважаючи на те, що антитіла класу 1 часто індукуються природною інфекцією та вакцинацією (14, 20, 28, 29, 41–43), наші дані свідчать про те, що S728–1157-подібні антитіла, які представляють підмножину цього класу, порівняно рідкісні.

Крім того, ми перевірили різницю в реактивності до 2P проти 6P-стабілізованого спайку в сироватці нашої когорти реконвалесцентів (рис. 5, I–K). Ми виявили, що всі 3 групи респондентів встановили анти-спайк-реактивні антитіла проти 6P-стабілізованого спайкового WT більшою мірою, ніж 2P-стабілізованого спайкового WT, у 6–11 разів (Малюнок 5J), що вказує на те, що основні антигенні епітопи краще проявлялися або стабілізувалися на 6P-стабілізованому антигені. Використовуючи ті самі зразки, пацієнти з високою та помірною відповіддю також мали нижчі титри анти-спайкових антитіл проти БА.1-2P, ніж БА.1-6P, у 4–5 разів (Малюнок 5K). Варто зауважити, що у пацієнтів із низьким рівнем відповіді була менша кратна зміна реактивності зв’язування проти спайку BA.1 Omicron-2P і 6P (2-кратне зменшення) порівняно з WT-2P і сплеском 6P ({ {28}}кратне зменшення) (Малюнок 5, J і K), що свідчить про те, що сироваткові антитіла проти BA.1 Omicron-реактивних епітопів можуть бути більш обмеженими у суб’єктів із низькою відповіддю. Загалом ці дані свідчать про покращення поліклонального зв’язування, спричиненого природною інфекцією, зі спайком, стабілізованим 6P, як для вірусів WT, так і для вірусів Omicron.

S728–1157-подібні антитіла оптимально індукуються в контексті гібридного імунітету. Первинне зараження SARS-CoV-2 без вакцинації стало рідкісним явищем у нинішніх глобальних умовах, і кілька досліджень показали, що імунітет до SARS-CoV-2 відрізняється між особами з конкретною історією вакцинації/інфекції. У результаті ми далі намагалися дослідити, які звичайні контакти, окрім інфікування WT лише предковим SARS-CoV-2, могли б ефективно індукувати антитіла, подібні до S728–1157, у плазмі від моновалентних вакцин на основі мРНК з попередньою вакцинацією або без неї. інфекція. Ми отримали необхідний біозразок із дослідницької групи Protection Associated with Rapid Immunity to SARS-CoV-2 (ПАРИЖ), яка спостерігала за медичними працівниками з початку пандемії (44). Ми відібрали зразки плазми від повністю імунізованих (2 × вакцинованих) учасників дослідження з інфекцією та без неї, а також від ревакцинованих учасників (3 × вакцинованих) з інфекцією та без неї. Крім того, ми також включили зразки від учасників дослідження, які отримали двовалентну мРНК-вакцину (попередня WA1/2020 плюс Omicron BA.5) (Рисунок 6A та Додаткова таблиця 2). Прорив інфекцій серед учасників, які отримали ревакцинацію, стався в той час, коли лінії Omicron витіснили всі інші лінії SARS-CoV-2 у столичному районі Нью-Йорка. Ми виявили, що двічі вакциновані особи мали найнижчі титри конкурентних сироваткових антитіл S728-1157 серед 5 груп протестованих зразків (рис. 6B). Примітно, що ці рівні були подібні до тих, що спостерігалися для нашої реконвалесцентної невакцинованої когорти (усі респондери; рис. 5B). Для порівняння, особи з природною інфекцією в анамнезі, включно з одужуючими особами, які отримали 2 з 3 доз вакцини, і особи, які перенесли прорив інфекції та отримали двовалентну ревакцинацію, продемонстрували значно вищі рівні викликання S728-1157 порівняно з неінфікованими. але вакцинованих осіб (Малюнок 6B). Хоча група неінфікованих 3-доз показала лише незначне збільшення порівняно з групою 2-дози, парний розподіл за типом вакцини показав, що гомологічні треті дози BNT162b2 та мРНК-1273 значно підвищили S{{ 38}}як титри нейтралізуючих антитіл на 2,72 × і 2,85 × відповідно (рис. 6, C і D). Слід зазначити, що серед учасників із 3 загальними контактами зі спайком будь-яким способом титри S728-1157-подібних антитіл були в 3 рази вищими в реконвалесцентних, які отримали подвійну вакцинацію, порівняно з тими, хто раніше не отримував потрійну вакцинацію, що свідчить про те, що SARS-CoV{{ 51}} інфекція більш оптимально індукує цей клонотип. Серед груп гібридного імунітету ми відзначили, що більшість осіб із посиленим імунітетом із проривом, які отримали дозу двовалентної бустерної вакцини, мали лише незначно вищий титр антитіл S728-1157 порівняно з групами реконвалесцентних вакцинованих пре-омікрон, що свідчить про те, що S{{53 }} титр, ймовірно, наближався до плато після 3 впливів. Ми також досліджували титри поліклональних антитіл, які конкурували з CC12.3 і CR3022 на додаток до S728-1157. Усі особи продемонстрували відносно високі титри CC12.3- і CR3022-подібних антитіл, незалежно від кількості та типу контактів (додатковий малюнок 5), на відміну від того, що ми спостерігали для S728-1157- як антитіла. Загалом ці дані вказують на те, що інфекція SARS-CoV-2 і вакцинація мРНК сприяють індукції S728-1157-подібних антитіл, причому інфекція відіграє більш домінуючу роль у вакцинованих осіб.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Нарешті, порівнюючи відповіді проти 2P- та 6P-стабілізованого сплеску в когорті мРНК-вакцинації, ми виявили, що більшість груп викликали однакові рівні антитіл проти обох конструктів. Виняток становила неінфікована тричі вакцинована група, яка продемонструвала статистично вищу, хоча й лише незначно підвищену, реактивність на 2P порівняно зі спайком, стабілізованим 6P (Малюнок 6E). Ці дані свідчать про те, що на відміну від природного зараження (рис. 5, J і K), лише вакцинація викликає поліклональну відповідь, яка більше обмежена епітопами в конструкції Spike-2P, відповідно до Spike{{12 }}Розробка сучасних вакцин. Зрештою, ці висновки підтверджують ідею про те, що 6P-стабілізація майбутніх вакцин проти SARS-CoV-2 може мати значну користь у індукції клонотипів антитіл із широким захистом, таких як S728-1157.

Рисунок 5. Конкуренція сироваткових антитіл реконвалесцента з широко нейтралізуючими RBD-реактивними mAb і порівняння відповіді сироваткових антитіл проти 6P- та 2P-стабілізованих спайків

Рисунок 6. Конкуренція мРНК-вакцинованих сироваткових антитіл з S728-1157 нейтралізуючими RBD-реактивними mAb і порівняння відповіді сироваткових антитіл проти спайків, стабілізованих 6P проти 2P.

Обговорення

У цьому дослідженні ми ідентифікуємо потужні bnAb, виділені з В-клітин пам’яті особи, яка одужала від інфекції SARS-CoV-2 під час початкової хвилі пандемії COVID-19. Це bnAb, S728- 1157, зберігало значну реакційну здатність до зв’язування та мало нейтралізуючу активність проти всіх протестованих ЛОС SARS-CoV-2, включаючи Omicron BA.1, BA.2, BA.2.75, BL.1 ( BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 і XBB, і зміг суттєво знизити інфекційні титри вірусу після зараження Delta і BA.1 у хом’яків.

Ми виявили, що реконвалесцентна сироватка з нашої когорти містить низькі концентрації антитіл, які конкурують із S728-1157 (антитіло класу 1/RBS-A) і епітопними моноклональними антитілами класу 2. Це свідчить про те, що S728-1157 дещо унікальний від інших антитіл, які націлені на епітопи класу 1, і нечасто індукується в пулі B-клітин пам’яті, специфічному для RBD. Натомість наша когорта природних інфекцій, здається, індукувала антитіла, націлені на епітоп CR3022 (клас 4); антитіла такої специфічності часто мають перехресну реакцію, але менш сильно нейтралізують, ніж антитіла, націлені на RBS (14, 17). Ці дані доповнюють наші попередні висновки, які демонструють, що велика кількість антитіл класу 3/S309 у реконвалесцентних сироватках може сприяти нейтралізуючій активності проти альфа- та гамма-варіантів, тоді як відсутність антитіл класу 2 може пояснити зниження здатності нейтралізувати проти дельта (15). . Незважаючи на це, повідомляється, що діапазон активності більшості цих антитіл, націлених на RBS (RBS-A/клас 1, RBS-B, C/клас 2 і RBS-D, S309/клас 3) проти варіантів Omicron, дуже обмежений. (11, 40, 45).

Основним завданням у майбутньому буде визначення того, як покращити вироблення широких перехресно реактивних антитіл до консервативних епітопів RBS. У зв’язку з цим ми помітили, що особи з гібридним імунітетом мають значно вищі титри S728-1157-подібних антитіл, ніж вакциновані особи без попередньої інфекції. Важливо, що це явище було відмічено навіть тоді, коли кількість контактів контролювалася (тобто у реконвалесцентних подвійних вакцинованих проти неінфікованих потрійних вакцинованих), що свідчить про те, що певний елемент імунітету, пов’язаного з інфекцією (або склад вакцини, який може імітувати цей тип імунітету) важливий для виявлення цього клонотипу. Це узгоджується з експериментальними даними, які підтверджують, що особи з гібридним імунітетом мають ширші профілі реактивності антитіл порівняно з тими, у яких імунна відповідь спричинена лише вакцинацією або первинною інфекцією (9).

Наведені тут структури ілюструють, що S728-1157 зв’язує епітоп RBS-A/класу 1 у верхній конформації RBD. Схоже, що цей епітоп легше доступний на спайках, стабілізованих 6P, які, як повідомляється, представляють 2 RBD у північній частині штату, порівняно з спайками 2P, які представляють лише 1 (30, 33, 46, 47), і до яких наші антитіла специфічні для спайку верхньої конформації демонструють покращене зв’язування. S728-1157 був виділений після природного зараження; у таких контекстах шанси індукції S728-1157-подібних клонів, ймовірно, вищі, враховуючи, що RBD повинен мати можливість прийняти конформацію вгору, навіть тимчасово, щоб зв’язуватися з ACE2, таким чином відкриваючи цей епітоп. На відміну від більшості антитіл IGHV3-53/3-66 RBS-A/класу 1, S728-1157 може пристосуватися до ключових мутацій у спайках VOC, використовуючи широкі взаємодії між CDR-H3 і RBD (29, 48–50). S728-1157 також використовує інший легкий ланцюг (IGLV3-9) порівняно з іншими менш широкими антитілами, такими як CC12.3 (IGKV3-20), що може впливати на загальну взаємодію зв’язування; однак наш аналіз показує, що існує менше водневих зв’язків між легким ланцюгом S728-1157 і RBD порівняно з CC12.3 (додаткова таблиця 7). Хоча більшість контактних залишків CDR-H3, критичних для перехресної реактивності ЛОС у цій взаємодії, закодовані зародковою лінією і не введені соматичними мутаціями, кілька соматично мутованих залишків у каркасних областях або CDR-H1, CDR-H2 та CDR-L1 є бере участь у взаємодії з SARS-CoV-2 RBD. З одного боку, це свідчить про те, що В-клітини пам’яті, які кодують антитіла класу IGHV3-53/66, можуть набути подібного ступеня перехресної реактивності шляхом подальшого дозрівання афінності. З іншого боку, це також вказує на можливість створення націлених на зародкову лінію імуногенів, які націлені на S728-1157-подібні наївні В-клітини. Хоча розробити вакцини, які можуть специфічно викликати S728-1157-подібні антитіла з вибраними CDR-H3, здатними долати мутації VOC, може бути складно, обнадійливо те, що обмеження гена IGHV спостерігається в інших потужних SARS-CoV{ {58}} дослідження нейтралізуючих mAb (13, 15, 20–27). Крім того, це також може бути можливим шляхом повторної імунізації оптимізованими імуногенами RBD, як повідомлялося раніше для інших патогенів (51–55).

Хоча багато мутацій спостерігалося в антигенному сайті RBS-A/класу 1 (18), щодо епітопу S728-1157, 13 із 15 загальних контактних залишків RBD та 2 із 3 CDR-H{{9} }зв’язані контактні залишки RBD зберігаються в Омікроні та всіх інших ЛОС. Це свідчить про те, що область RBD, де знайдено епітоп S728-1157, може включати залишки, критичні для його динамічної функції та придатності до вірусу, і тому буде менш толерантною до мутацій і антигенного дрейфу, ніж навколишні залишки сайту RBS-A/класу 1. Якщо це так, слід зменшити тенденцію до втрати цього конкретного епітопу в міру розвитку варіантів вірусу, що робить характеристику S728-1157 і подібних антитіл і епітопів важливою для терапевтичної розробки вакцин, стійких до варіантів, або mAb. Підсумовуючи, наше дослідження визначає bnAbs, які можуть стати основою для розробки імуногену для вакцин проти коронавірусу наступного покоління, стійких до варіантів, або служити терапевтичними засобами mAb, стійкими до еволюції SARS CoV-2. Зокрема, з точки зору комбінованої ефективності та широти, S728-1157, здається, є найкращим у своєму класі антитілом, виділеним на сьогодні. З огляду на те, що це антитіло легше зв’язується за допомогою 6P-стабілізації, передбачається, що воно переважно індукується 6P-стабілізованими рекомбінантними спайковими білками або цілим вірусом, що свідчить про те, що модифікація гексапроліну може принести користь майбутнім конструкціям вакцини для оптимального захисту від майбутнього SARS-CoV. -2 варіанти та інші арбовіруси.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

методи

Виділення моноклональних антитіл. PBMC були виділені з лейкоредукційних фільтрів і заморожені, як описано раніше (24). В-клітини були збагачені PBMC за допомогою FACS. Клітини фарбували CD19, CD3 та антигенними зондами, кон’югованими з олігофлуорофором; клітини, що представляють інтерес, були ідентифіковані як антиген CD3–CD19++. Усі моноклональні антитела були отримані з олігомічених клітин, відсортованих за допомогою антигенної приманки, ідентифікованих за допомогою одноклітинної РНК-Seq, як описано раніше (15, 24). Дані про окремі B-клітини, отримані в цьому дослідженні, були депоновані в Gene Expression Omnibus: GSE171703 і GSM5231088–GSM5231123.

Антиген-специфічні B-клітини були відібрані для генерації mAb на основі інтенсивності антигенного зонду, проаналізованого за допомогою JMP Pro 15. Гени важкого та легкого ланцюгів антитіла були синтезовані за допомогою Integrated DNA Technologies (IDT) і клоновані в людський IgG1 і людський κ або λ легкий ланцюг. вектори експресії за допомогою збірки Гібсона, як описано раніше (56). Важкі та легкі ланцюги відповідних mAb були тимчасово котрансфіковані в клітини HEK293T (ATCC). Після трансфекції протягом 18 годин трансфіковані клітини доповнювали супернатантом безбілкового гібридомного середовища (PFHM-II, Gibco). Супернатант, що містить виділене mAb, збирали на 4-й день і очищали за допомогою білкових A-агарозних кульок (Thermo Fisher Scientific), як описано раніше (56). Послідовності важких і легких ланцюгів добре охарактеризованих антитіл були отримані з Protein Data Bank (PDB), LY-CoV555 (PDB ID: 7KMG), CR3022 (PDB ID: 6W7Y) і REGN1{{ 125}}933 (PDB ID: 6XDG) і були синтезовані, як описано вище. CC12.3 mAb (PDB ID: 6XC4) було надано Meng Yuan з Дослідницького інституту Скріппса (Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Експресія рекомбінантного спайкового білка. Рекомбінантний спайк D614G SARS-CoV-2 повної довжини (FL), BA.2-6P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1.1-6P, XBB-6P, WT RBD, поодинокі мутанти RBD (R346S, K417N, K417T, G446V, L452R, S477N, F486A, F486Y, N487Q, Y489F, Q493A, Q493N, N501Y, Y505A та Y505F), комбінований RBD-мутант (K417N/E484K/L452R/NN501Y), SARS-CoV-1 RBD та MERS-CoV RBD були створені власними силами. Коротко кажучи, рекомбінантні антигени експресували за допомогою клітин Expi293F (Thermo Fisher Scientific). Цікавий ген був клонований у вектор експресії ссавців (власно модифікований AbVec) і трансфікований за допомогою набору ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific) згідно з протоколом виробника. Супернатант збирали на 4-й день після трансфекції та інкубували з агарозою Ni-нітрилотриуксусної кислоти (Ni-NTA) (Qiagen). Очищення проводили за допомогою гравітаційної колонки та елюювали буфером, що містить імідазол, як описано раніше (57, 58). Елюат був забуферений і замінений на PBS за допомогою відцентрової установки Amicon (Millipore). Рекомбінантні спайки FL, стабілізовані мутаціями 2P варіантів B.1.1.7 Alpha, B.1.351 Beta, P.1 Gamma, B.1.617.2 Delta, BA.1, BA.2 і BA.4 Omicron, і були виготовлено в лабораторії Sather при Дитячому дослідницькому інституті Сіетла. RBD K417V, N439K і E484K і рекомбінантний FL spike WT-2P і 6P були виготовлені в лабораторії Краммера в Школі медицини Ікана на горі Синай. SARS-CoV-2-6P-Mut7 і spike BA.1-6P були розроблені та виготовлені, як описано в попередньому дослідженні (59). Білкові послідовності та ресурси для кожного антигену наведено в Додатковій таблиці 4. ELISA. Рекомбінантні спайкові білки SARS-CoV-2/RBD наносили на мікротитраційні планшети з високим вмістом білків (Costar) у концентрації 2 мкг/мл у PBS із концентрацією 50 мкл/лунку та витримували протягом ночі при 4 градусах. Планшети промивали PBS, що містить 0,05% Tween 20 (PBS-T), і блокували 150 мкл PBS, що містить 20% FBS, протягом 1 години при 37°. Моноклональні антитіла серійно розводили 3-кратно, починаючи з 10 мкг/мл у PBS, та інкубували в лунках протягом 1 години при 37 градусах. Потім планшети промивали та інкубували з HRP-кон’югованим козячим антитілом проти IgG людини (Jackson ImmunoResearch; 109- 035-098), 1:1, 000) протягом 1 години при 37 градусах. Після промивання в кожну лунку додавали 100 мкл субстрату Super AquaBlue ELISA (eBioscience). Поглинання вимірювали при 405 нм на мікропланшетному спектрофотометрі (Bio-Rad). Аналізи стандартизували з використанням контрольного антитіла S144-509 (15) з відомими характеристиками зв’язування в кожному планшеті, і планшети проявляли, доки абсорбція контролю не досягла OD 3,0. Усі моноклональні антитела тестували в двох примірниках, і кожен експеримент проводили двічі.

ІФА сироватки. Планшети для мікротитрування з високим вмістом білка вкривали рекомбінантними спайковими антигенами SARS-CoV-2 у концентрації 2 мкг/мл у PBS протягом ночі при 4 градусах. Планшети промивали PBS 0.05% Tween і блокували 200 мкл PBS 0.1% Tween + 3% сухого знежиреного молока протягом 1 години при кімнатній температурі (RT). Зразки плазми інактивували протягом 1 години при 56 градусах перед проведенням серологічного експерименту. Плазму послідовно розводили 2-кратно в PBS 0,1% Tween + 1% сухого знежиреного молока. Планшети інкубували з розведеннями сироватки протягом 2 годин при кімнатній температурі. Для виявлення зв’язування антитіл використовували кон’юговане з HRP козяче вторинне антитіло проти Ig людини, розведене у співвідношенні 1:3000 з PBS 0,1% Tween + 1% сухого знежиреного молока. Після 1 години інкубації планшети проявляли 100 мкл розчину SigmaFast OPD (Sigma-Aldrich) протягом 10 хвилин. Потім використовували 50 мкл 3М HCl, щоб зупинити реакцію розвитку. Поглинання вимірювали при 490 нм на мікропланшетному спектрофотометрі (Bio-Rad). Титри кінцевих точок екстраполювали з сигмоїдальної стандартної кривої 4PL (де x — логарифм концентрації) для кожного зразка. Межа виявлення (LOD) визначається як середнє + 3 SD сигналу OD, зареєстрованого з використанням плазми людей до SARS-CoV-2. Усі розрахунки проводили в програмному забезпеченні GraphPad Prism (версія 9.0).

Конкурс ІФА. Щоб визначити класифікацію цільового епітопу RBD-реактивних mAb, проводили конкурентний ELISA з використанням інших mAb з відомими характеристиками зв’язування епітопів як конкурентних mAb. Конкурентні моноклональні антитела біотинілювали за допомогою сульфо-NHS-біотину EZ-Link (Thermo Fisher Scientific) протягом 2 годин при кімнатній температурі. Надлишок біотину з біотинільованих моноклональних антитіл видаляли за допомогою обертових знесолювальних колонок Zeba з обмеженням молекулярної маси 7k (MWCO) (Thermo Fisher Scientific). Планшети покривали 2 мкг/мл антигену RBD протягом ночі при 4 градусах. Планшети блокували PBS–20% FBS протягом 2 годин при кімнатній температурі та додавали 2-кратне розведення mAb невизначеного класу або сироватки, починаючи з 20 мкг/мл mAbs і розведення 1:10 сироватки. Після інкубації антитіла протягом 2 годин при кімнатній температурі біотинільоване конкурентне mAb додавали в концентрації, яка вдвічі перевищує його константу дисоціації (KD), та інкубували ще 2 години при RT разом із mAb або сироваткою, які були додані раніше. Планшети промивали та інкубували зі 100 мкл HRP-кон’югованого стрептавідину (Southern Biotech) у розведенні 1:1 000 протягом 1 години при 37°. Планшети були розроблені з субстратом Super AquaBlue ELISA (eBioscience). Щоб нормалізувати аналізи, конкурентне біотинільоване mAb було додано в лунку без будь-яких конкуруючих mAb або сироватки як контроль. Дані реєстрували, коли абсорбція контрольної лунки досягала OD 1,0–1,5. Відсоток конкуренції між mAb потім розраховували шляхом ділення спостережуваної ОП зразка на ОП, досягнутої позитивним контролем, віднімання цього значення від 1 і множення на 100. Для сироватки ОП трансформували в log10 і аналізували за допомогою нелінійної регресії для визначення 50 % концентрації інгібування (IC50) за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism (версія 9.0). Дані були перетворені в Log1P і нанесені на графік, що представляє взаємне розведення сироватки IC50 розведення сироватки, яке може досягти 50% конкуренції з конкурентним mAb, що цікавить. Усі моноклональні антитела тестували в двох примірниках, кожен експеримент проводили 2 рази незалежно, а значення з 2 незалежних експериментів усереднювали.

Аналіз зубного нальоту. Аналіз бляшок проводили з варіантами вірусів SARS-CoV-2 на клітинах Vero E6/TMPRSS2 (Японська колекція дослідницьких біоресурсів (JCRB)) (додаткова таблиця 5). Клітини культивували для досягнення 90% конфлюентності перед обробкою трипсином і посівом із щільністю 3 × 104 клітини/лунку в 96-лункові планшети. Наступного дня 102 PFU варіанту SARS-CoV-2 інкубували з 2-кратно розведеними моноклональними антителами протягом 1 години. Суміш антитіло-вірус інкубували з клітинами Vero E6/TMPRSS2 протягом 3 днів при 37°. Планшети фіксували 20% метанолом, а потім фарбували розчином кристалічного фіолетового. Повні інгібуючі концентрації (IC99) розраховували за допомогою логарифму (інгібітора) проти нормалізованої відповіді (змінний нахил), виконаного в GraphPad Prism (версія 9.0). Усі моноклональні антитела тестували в двох примірниках, і кожен експеримент проводили двічі. Тест нейтралізації зменшення фокусу. Для визначення активності нейтралізації як додаткову платформу, окрім аналізу зубного нальоту, використовували тести нейтралізації зменшення концентрації (FRNTs). Серійні розведення сироватки, починаючи з кінцевої концентрації 1:20, змішували з 103 вогнищеутворюючими одиницями вірусу на лунку та інкубували протягом 1 години при 37°. Об’єднаний допандемічний зразок сироватки служив контролем. Суміш антитіла та вірусу інокулюють на клітини Vero E6/TMPRSS2 (JCRB) у 96-лункові планшети та інкубують протягом 1 години при 37°. До кожної лунки додавали рівний об’єм розчину метилцелюлози. Клітини інкубували протягом 16 годин при 37 градусах, а потім фіксували формаліном. Після видалення формаліну клітини імунно забарвлювали мишачим mAb проти нуклеопротеїну SARS-CoV-1/2 [клон 1C7C7 (Sigma-Aldrich)], а потім міченим HRP козячим імуноглобуліном проти миші (Sigma- Aldrich; A8924). Інфіковані клітини фарбували субстратом TrueBlue (SeraCare Life Sciences), а потім промивали дистильованою водою. Після сушіння число фокусів було визначено кількісно за допомогою аналізатора ImmunoSpot S6, програмного забезпечення ImmunoCapture та програмного забезпечення BioSpot (клітинна технологія). IC50 розраховували на основі інтерпольованого значення логарифму (інгібітора) проти нормалізованої відповіді, використовуючи нелінійну регресію зі змінним нахилом (4 параметри), виконану в GraphPad Prism (версія 9.0).

Список літератури

1. Hou YJ та ін. Варіант SARS-CoV-2 D614G демонструє ефективну реплікацію ex vivo та передачу in vivo. Наука. 2020; 370 (6523): 1464–1468.

2. Garcia-Beltran WF та ін. Кілька варіантів SARS CoV-2 уникають нейтралізації гуморальним імунітетом, індукованим вакциною. Стільниковий. 2021; 184 (9): 2523.

3. Wall EC та ін. Нейтралізуюча активність антитіл проти SARS-CoV-2 ЛОС B.1.617.2 і B.1.351 шляхом вакцинації BNT162b2. Ланцет. 2021;397(10292):2331–2333.

4. Едара В.В., та ін. Відповіді нейтралізуючих антитіл на SARS-CoV-2 B.1.617, спричинені інфекцією та вакциною. N Engl J Med. 2021; 385 (7): 664–666.

5. Чжоу Д та ін. Докази виходу SARS-CoV-2 варіанта B.1.351 із природної та індукованої вакциною сироватки. Стільниковий. 2021; 184 (9): 2348–2361.

6. Weisblum Y та ін. Втеча від нейтралізуючих антитіл за допомогою спайкових варіантів білка SARS-CoV-2. Elife. 2020;9:e61312.

7. Грем Ф. Щоденний брифінг: варіант коронавірусу «Омікрон» ставить вчених на сполох. природа 2021;.

8. Karim SSA, Karim QA. Варіант Omicron SARS-CoV-2: нова глава в пандемії COVID-19. Ланцет. 2021;398(10317):2126–2128.

9. Carreño JM та ін. Активність реконвалесцентної та вакцинної сироватки проти SARS-CoV-2 Omicron. природа 2021;602(7898):682–688.

10. Wang Q та ін. Тривожні властивості уникання антитіл підваріантів SARS-CoV-2 BQ і XBB. Стільниковий. 2022; 186 (2): 279–286.

11. ВанБларган Л.А. та ін. Інфекційний вірус SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron уникає нейтралізації терапевтичними моноклональними антитілами. Nat Med. 2022; 28 (3): 490–495.

12. Такашіта Е та ін. Ефективність антитіл і противірусних препаратів проти Covid-19 Omicron Variant. N Engl J Med. 2022;386(10):995–998.

13. Юань М та ін. Розпізнавання зв’язуючого домену рецептора SARS-CoV-2 нейтралізуючими антитілами. Biochem Biophys Res Commun. 2021;538:192-203.

14. Барнс CO та ін. Структури нейтралізуючих антитіл SARS-CoV-2 визначають терапевтичні стратегії. природа 2020; 588 (7839): 682–687.

15. Changrob S та ін. Перехресна нейтралізація нових варіантів SARS-CoV-2, що викликають занепокоєння, антитілами, націленими на різні епітопи в спайку. Мбіо. 2021;12(6):e0297521.

16. Guthmiller JJ та ін. Тяжкість інфекції SARS-CoV-2 пов’язана з вищим гуморальним імунітетом проти спалаху. Мбіо. 2021;12(1):e02940–20.

17. Greaney AJ та ін. Картування мутацій SARS-CoV-2 RBD, які уникають зв’язування різними класами антитіл. Нац комун. 2021;12(1):4196.

18 Лю Х, Вілсон І.А. Захисні нейтралізуючі епітопи в SARS-CoV-2. Immunol Rev. 2022; 310 (1): 76–92.

19. Jette CA та ін. Широка перехресна реактивність між арбовірусами, що демонструється підгрупою нейтралізуючих антитіл донора COVID-19. Cell Rep. 2021;36(13):109760.

20. Brouwer PJM та ін. Потужні нейтралізуючі антитіла пацієнтів із COVID{1}} визначають кілька мішеней уразливості. Наука. 2020; 369 (6504): 643–650.

21. Pinto D та ін. Перехресна нейтралізація SARS CoV-2 людським моноклональним антитілом до SARS-CoV. природа 2020; 583 (7815): 290–295.

22. Роббіані Д.Ф. та ін. Конвергентна відповідь антитіл на SARS-CoV-2 у реконвалесцентів. природа 2020; 584 (7821): 437–442.

23. Юань М та ін. Структурна основа загальної відповіді антитіл на SARS-CoV-2. Наука. 2020;369(6507):1119–1123.

24. Dugan HL та ін. Профілювання імунодомінування В-клітин після інфекції SARS-CoV-2 показує еволюцію антитіл до ненейтралізуючих вірусних мішеней. Імунітет. 2021; 54 (6): 1290–1303.

25. Роджерс Т. Ф. та ін. Виділення потужних антитіл, що нейтралізують SARS CoV-2, і захист від хвороби на моделі маленьких тварин. Наука. 2020; 369 (6506): 956–963.

26. Schmitz AJ та ін. Загальнодоступне антитіло, індуковане вакциною, захищає від SARS-CoV-2 і нових варіантів. Імунітет. 2021;54(9):2159–2166.e6.

27. Shi R та ін. Людське нейтралізуюче антитіло націлено на сайт зв’язування рецепторів SARS-CoV-2. природа 2020;584(7819):120–124.

28. Cao Y та ін. Потужні нейтралізуючі антитіла проти SARS-CoV-2, ідентифіковані за допомогою високопродуктивного одноклітинного секвенування В-клітин реконвалесцентних пацієнтів. Стільниковий. 2020; 182 (1): 73–84.

29. Барнс CO та ін. Структури людських антитіл, пов’язаних зі спайком SARS-CoV-2, виявляють загальні епітопи та повторювані особливості антитіл. Стільниковий. 2020; 182 (4): 828–842.

30. Корбетт К. С. та ін. Розробка мРНК-вакцини проти SARS-CoV-2 завдяки підготовленості прототипу збудника. природа 2020; 586 (7830): 567–571.

31. Аманат Ф та ін. Введення двох пролінів і видалення багатоосновного сайту розщеплення призвело до підвищення ефективності рекомбінантної спайкової вакцини проти SARS-CoV-2 на моделі миші. mBio. 2021;12(2):e02648–20.

32. Sun W та ін. Вірус хвороби Ньюкасла, що експресує стабілізований спайковий білок SARS-CoV-2, індукує захисні імунні реакції. Нац комун. 2021;12(1):6197.

33. Hsieh CL та ін. Структурний дизайн спайків SARS-CoV-2, стабілізованих методом попереднього злиття. Наука. 2020; 369 (6510): 1501–1505.

34. Гобейл С. М. та ін. Структурна різноманітність спалаху SARS-CoV-2 Omicron. Mol Cell. 2022; 82 (11): 2050–2068.

35. Юань М та ін. Висококонсервативний криптичний епітоп у доменах зв’язування рецепторів SARS-CoV-2 і SARS-CoV. Наука. 2020;368(6491):630–633.

36. Старр Т. Н. та ін. Повна карта мутацій SARS-CoV-2 RBD, які вислизають від моноклонального антитіла LY-CoV555 та його суміші з LY-CoV016. Cell Rep Med. 2021; 2 (4): 100255.

37. Баум А та ін. Антитіла REGN-COV2 запобігають і лікують інфекцію SARS-CoV-2 у макак-резусів і хом’яків. Наука. 2020; 370 (6520): 1110–1115.

38. Wu NC та ін. Альтернативний спосіб зв’язування антитіл IGHV3-53 із доменом зв’язування рецептора SARS-CoV-2. Cell Rep. 2020;33(3):108274.

39. Wu Y та ін. Неконкуруюча пара нейтралізуючих антитіл людини блокує зв’язування вірусу COVID-19 з його рецептором ACE2. Наука. 2020;368(6496):1274–1278.

40. Юань М та ін. Структурні та функціональні розгалуження антигенного дрейфу в останніх варіантах SARS-CoV-2. Наука. 2021;373(6556):818–823.

41. Yan Q та ін. Зародкові IGHV3-53-кодовані нейтралізуючі антитіла, націлені на RBD, зазвичай присутні в репертуарах антитіл пацієнтів із COVID-19. Виниклі мікроби заражають. 2021;10(1):1097–1111.

42. Zhang Q та ін. Потужні та захисні загальнодоступні антитіла IGHV3- 53/3-66 і їхній спільний мутант утечі під час спалаху SARS-CoV-2. Нац комун. 2021;12(1):4210.

43. Wang Z та ін. МРНК антитіл до SARS-CoV-2 та циркулюючих варіантів, викликаних вакциною. природа 2021; 592 (7855): 616–622.

44. Саймон В та ін. ПАРИЖ і СПАРТА: пошук ахіллесової п’яти SARS-CoV-2. mSphere. 2022;7(3):e0017922.

45. Starr TN та ін. SARS-CoV-2 RBD антитіла, які максимізують ширину та стійкість до втечі. природа 2021;597(7874):97–102.

46. ​​Walls AC, et al. Структура, функція та антигенність спайкового глікопротеїну SARS-CoV-2. Стільниковий. 2020; 181 (2): 281–292.

47. Хендерсон Р та ін. Контроль конформації спайку глікопротеїну SARS-CoV-2. Nat Struct Mol Biol. 2020; 27 (10): 925–933.

48. Shrestha LB, et al. Широко нейтралізуючі антитіла проти нових варіантів SARS-CoV-2. Передній імунол. 2021;12:752003.

49. Greaney AJ та ін. Антитіла, викликані вакцинацією мРНК-1273, ширше зв’язуються з доменом зв’язування рецептора, ніж антитіла від інфекції SARS-CoV-2. Sci Transl Med. 2021;13(600):eabi9915.

50. Reincke SM та ін. Інфекція бета-варіанту SARS-CoV-2 викликає потужні антитіла, специфічні для лінії та перехресно реактивні. Наука. 2022;375(6582):782–787.

51. Wrammert J, et al. Широко перехресно-реактивні антитіла домінують у відповіді В-клітин людини проти пандемічної інфекції грипу H1N1 2009 року. J Exp Med. 2011; 208 (1): 181–193.

52. Guthmiller JJ та ін. Перший контакт із індукованим пандемічним вірусом H1N1 широко нейтралізуючими антитілами, націленими на головні епітопи гемаглютиніну. Sci Transl Med. 2021;13(596):eabg4535.

53. Bajic G та ін. Інженерія антигенів грипу зосереджена на імунних відповідях на субдомінантний, але широко захисний вірусний епітоп. Клітина-господар мікроб. 2019; 25 (6): 827–835.

54. Нахбагауер Р та ін. Підхід універсальної вакцини проти вірусу грипу на основі химерного гемаглютиніну викликає широкий і тривалий імунітет у рандомізованому плацебо-контрольованому дослідженні I фази. Nat Med. 2021; 27 (1): 106–114.

55. Angeletti D, et al. Перехід до імунодомінування для цільових субдомінантних широко нейтралізуючих епітопів. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(27):13474–13479.

56. Guthmiller JJ та ін. Ефективний метод отримання моноклональних антитіл з В-клітин людини. Методи Mol Biol. 2019; 1904: 109–145.

57. Аманат Ф та ін. Серологічний аналіз для виявлення сероконверсії SARS-CoV-2 у людей. Nat Med. 2020; 26 (7): 1033–1036.

58. Stadlbauer D, et al. Сероконверсія SARS-CoV-2 у людей: докладний протокол для серологічного аналізу, виробництва антигену та налаштування тесту. Curr Protoc Microbiol. 2020;57(1):e100.

59. Torres JL та ін. Структурні відомості про високопотужне пан-нейтралізуюче SARS-CoV-2 моноклональне антитіло людини. Proc Natl Acad Sci США. 2022;119(20):e2120976119.

60. Suloway C та ін. Автоматизована молекулярна мікроскопія: нова система Leginon. J Struct Biol. 2005; 151 (1): 41–60.

61. Lander GC та ін. Appion: інтегрований конвеєр, керований базою даних, для полегшення обробки електромагнітних зображень. J Struct Biol. 2009;166(1):95–102.

62. Восс Н.Р. та ін. DoG Picker і TiltPicker: програмні засоби для полегшення вибору частинок в одночастинковій електронній мікроскопії. J Struct Biol. 2009; 166 (2): 205–213.

63. Петтерсен Е. Ф. та ін. UCSF Chimera--система візуалізації для пошукових досліджень і аналізу. J Comput Chem. 2004; 25 (13): 1605–1612.

64. Punjani A та ін. Нерівномірне уточнення: адаптивна регулярізація покращує одночастинкову кріо-ЕМ реконструкцію. Нац методи. 2020;17(12):1214–1221.

65. Чжан К. Gctf: Визначення та корекція CTF у реальному часі. J Struct Biol. 2016;193(1):1–12.

66. Зіванов Дж та ін. Нові інструменти для автоматизованого визначення кріо-ЕМ структури високої роздільної здатності в RELION-3. Elife. 2018; 7: e42166.

67. Casanal A та ін. Сучасні розробки в області Coot для побудови макромолекулярної моделі електронної кріомікроскопії та кристалографічних даних. Protein Sci. 2020; 29 (4): 1069–1078.

68. Frenz B та ін. Автоматичне виправлення помилок у структурах глікопротеїнів за допомогою розетки. Структура. 2019;27(1):134–139.

69. Клахольц Б.П. Отримання й уточнення атомних моделей у кристалографії та кріо-ЕМ: новітні інструменти Phenix для полегшення аналізу структури. Acta Crystallogr D Struct Biol. 2019; 75 (п. 10): 878–881.

70. Петтерсен Е. Ф. та ін. UCSF ChimeraX: візуалізація структури для дослідників, педагогів і розробників. Protein Sci. 2021;30(1):70–82.

71. Otwinowski Z, Minor W. Обробка даних рентгенівської дифракції, зібраних у режимі коливань. Методи Ензимол. 1997;276:307-326.

72. McCoy AJ та ін. Програмне забезпечення для кристалографії Phaser. J Appl Crystallogr. 2007; 40 (п. 4): 658–674.

73. Qiang M, et al. Нейтралізуючі антитіла до SARS CoV-2 були відібрані з бібліотеки антитіл людини, створеної десятиліття тому. Adv Sci (Weinh). 2022;9(1):e2102181.

74. Емслі П, Коутан К. Кут: інструменти побудови моделей для молекулярної графіки. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004; 60 (пункт 12 пункт 1): 2126–2132.

75. Adams PD, et al. PHENIX: комплексна система на основі Python для вирішення макромолекулярної структури. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010;66(п.2):213–221.

76. Montiel-Garcia D, et al. Аналізатор епітопів: веб-інструмент на основі структури для аналізу широко нейтралізуючих епітопів. J Struct Biol. 2022; 214 (1): 107839.