Метаболомічні зміни в сечі, що супроводжують ремісію альбумінурії після операції шлункового шунтування при діабетичному захворюванні нирок 2 типу

Анотація:У рандомізованому клінічному дослідженні Microvascular Outcomes after Metabolic Surgery (MOMS RCT, NCT01821508) комбінована метаболічна хірургія (шунтування шлунка)плюс медикаментозна терапія(CSM) було краще, ніж лише медикаментозна терапія (MTA) як засіб досягнення ремісії альбумінурії під час 2--річного спостереження у пацієнтів з ожирінням ірання діабетична хвороба нирок(DKD). У цьому дослідженні ми оцінили метаболом 1H-ЯМР сечі в підгрупі пацієнтів з обох груп РКД MOMS на початковому етапі та 6-місячному спостереженні. У той час як CSM і MTA знижували екскрецію цукрів із сечею, CSM створював характерний метаболічний профіль сечі, який характеризувався збільшенням ко-метаболітів господаря та мікробів (N-фенілацетилгліцину, триметиламіну N-оксиду та 4-амінобутирату (ГАМК)) і амінокислоти (аргінін і глутамін). Крім того, знижується вміст ароматичних амінокислот (фенілаланіну та тирозину), а також амінокислот з розгалуженим ланцюгом (BCAA) і пов’язаних з ними катаболітів (валін, лейцин, 3-гідроксибутират, 3-гідроксиізовалерат та {{11 }}метил-2- ізовалерат), спостерігалися після CSM, але не MTA. Поліпшення ІМТ не корелювало з покращенням метаболічних і ниркових показників після CSM. Навпаки, метаболіти в сечі, змінені CSM через 6 місяців, від середнього до сильного корелювали з поліпшенням артеріального тиску, глікемії, тригліцеридів і альбумінурії до 24 місяців після початку лікування, підкреслюючи потенційну участь цих зрушень у метаболічному профілі сечі в метаболічному процесі. і ренопротекторний ефект CSM.

Ключові слова: альбумінурія; баріатрична хірургія; BCAA;хронічні захворювання нирок;діабетична хвороба нирок; шунтування шлунка; метаболоміка; спектроскопія ЯМР; ожиріння;діабет 2 типу 

Служба підтримки Wecistanche - найбільшого експортера cistanche в Китаї:

Електронна адреса:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Тел.:+86 15292862950

Зверніться в магазин, щоб дізнатися більше про технічні характеристики:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

НАТИСНІТЬ ТУТ, ЩОБ ОТРИМАТИ НАТУРАЛЬНИЙ ОРГАНІЧНИЙ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНШИ З 25% ЕХІНАКОЗИДУ ТА 9% АКТЕОЗИДУ ДЛЯ ФУНКЦІЇ НИРОК

1. Введення

Діабетична хвороба нирок (ДЗН) вражає до 40% людей із тривалим цукровим діабетом 2 типу та є основною причиною термінальної ниркової недостатності [1,2]. Хоча блокада ренін-ангіотензин-альдостеронової системи була основою лікування DKD протягом останніх двох десятиліть [3], значний залишковий ризик прогресуючої ниркової недостатності та прискореного серцево-судинного захворювання залишався у людей з DKD, незважаючи на інтенсивне лікування [4]. Нещодавно до фармакологічного озброєння було додано два нових класи препаратів, а саме інгібітори котранспортера-2 натрію й глюкози [5,6] та аналоги рецепторів GLP-1 [7]. Доказова база для антагоніста рецепторів ендотеліну-А атрасентану [8] і нестероїдного селективного антагоніста мінералокортикоїдних рецепторів файнер енону [9] слідкує за ними. Разом ці ліки обіцяють покращити результати.

Епідеміологічні дані з медичних реєстрів, лонгітюдних когорт і аналізів близнюків встановлюють, що ожиріння є незалежним фактором ризику виникнення та прогресування хронічної хвороби нирок (ХХН), включаючи ХНН [10–13]. Враховуючи високу поширеність ожиріння серед людей із ХХН, зареєстровані показники коливаються від 35–44% [14,15], спеціальне лікування ожиріння є перспективним засобом покращення серцево-судинних та ниркових наслідків у цій ситуації. Оскільки баріатрична хірургія є найефективнішим заходом для зниження ваги, все більше досліджень зосереджено на ренопротекторних і кардіопротекторних ефектах баріатричної хірургії у пацієнтів із ДЗН [16–18].

Нещодавно ми повідомили про 2--річні результати рандомізованого клінічного дослідження (РКВ) «Мікросудинні наслідки після метаболічної хірургії» (МОМС), у якому порівнювали вплив комбінованої метаболічної хірургії та медикаментозної терапії (КМС) і лише інтенсивної медикаментозної терапії (МТА) на екскреція альбуміну з сечею у пацієнтів із DKD та індексом маси тіла (ІМТ) у діапазоні 30–35 кг/м2 (NCT01821508). Операція шлункового шунтування Roux-en-Y (RYGB) була використаною метаболічною операцією [19]. Ремісія мікроальбумінурії відбулася у 55% ​​(95% ДІ, 39–70%) пацієнтів після MTA та у 82% (95% ДІ, 72–93%) пацієнтів після CSM під час 2-річного спостереження [ 20].

Вимірювання екскреції альбуміну з сечею саме по собі дає неповну картину реакції ниркової паренхіми на RYGB. З цією метою ми показали на доклінічних моделях DKD у щурів, що вплив RYGB на альбумінурію відображає структурні покращення клубочка та появу репаративної моделі глобальних змін у кортикальному транскриптомі нирок [21–24]. Хоча гістологічна та молекулярна оцінка ниркової тканини після RYGB у людей неможлива, оцінка змін у виведенні метаболітів із сечею є можливою. Такий аналіз має потенційну цінність для створення гіпотез щодо механізмів і посередників зниженняураження нирокпісля процедури, а також може дати шаблони зміни метаболітів прогностичної користі.

Таким чином, у цьому дослідженні було проведено профіль траєкторій змін у виведенні метаболітів із сечею, що відбуваються між вихідним рівнем і 6-місячним спостереженням у підгрупі пацієнтів з обох груп РКВ MOMS. Ми мали на меті охарактеризувати дискретні ранні зміни в метаболомі сечі, пов’язані з CSM, з наміром виявити ранні метаболомічні зрушення, які передбачають і потенційно функціонально пов’язані з більш сприятливим метаболічним і нирковим прогнозом, пов’язаним із цим втручанням на {{2} } рік спостереження.

2. Результати

2.1. Вихідні характеристики пацієнтів MOMS RCT, включених до піддослідження

У таблиці 1 зазначені базові клінічні та біохімічні параметри для учасників піддослідження. Вік і стать були порівнянними в усіх групах дослідження, хоча поширеність кавказької етнічної приналежності була вищою в групі CSM порівняно з групою MTA (92% проти 64%, p=0.05). Не спостерігалося жодних відмінностей між групами дослідження на початку дослідження щодо антропометрії, артеріального тиску, ліпідів крові, глікованого гемоглобіну (HbA1c), сироваткового креатиніну або співвідношення альбуміну до креатиніну в сечі (ACR). Основні тенденції щодо метаболічних і ниркових параметрів характеризують досліджувану популяцію як пацієнтів з ожирінням класу I (ІМТ 30–35 кг/м2), неадекватно контрольованим цукровим діабетом 2 типу (HbA1c більше або дорівнює 48 ммоль/моль або 6,5%). , мікроальбумінурія (uACR 30–300 мг/г) і збережена функція нирок (середній креатинін сироватки ~0,8 мг/дл).

Таблиця 1. Базові характеристики когорти піддослідження 1,

2.2. Поліпшення метаболічних і ниркових параметрів у пацієнтів, включених у піддослідження

Порівняно з початковим рівнем, після 6 і 24 місяців спостереження, пацієнти, включені в обидві групи піддослідження, показали значне зниження uACR, що відбувалося в контексті поліпшення глікемічного контролю та дисліпідемії, а у випадку CSM групі, середнє зниження ІМТ на 26% (табл. 2). Серед пацієнтів, включених у піддослідження, покращення ліпідних індексів і uACR були подібними в групах CSM і MTA на 6 і 24 місяці. Зниження ІМТ, систолічного артеріального тиску та HbA1c були більшими на {{1{{14} }}}місячне спостереження в групі CSM порівняно з групою MTA, із середнім зниженням ІМТ на 26%, що спостерігалося в групі CSM, що зберігалося до 24 місяця (p <0,001 для порівняння з середнім зниженням ІМТ на 6%, що спостерігалося в групі MTA в той самий момент часу).

2.3. Огляд метаболома 1H-ЯМР сечі та показників контролю якості

Всього в спектрах 1H-ЯМР було виявлено 475 піків. З них 208 були анотовані, що дало метаболом сечі, що складається з 70 унікальних метаболітів. Коефіцієнт варіації нормалізованої за PQN пікової інтенсивності серед вихідних (n=5) і 6-го місяців (n=5) ​​об’єднаних зразків становив менше 5% для багатьох і менше 15% для більшості, анотованих піків 1H-ЯМР (рис. 1A). Ілюстративні графіки нормалізованих за PQN спектрів об’єднаних зразків для певних піків, які були змінені CSM за допомогою багатофакторного аналізу, демонструють, що дисперсія базового рівня та об’єднаних зразків за 6 місяців була низькою (рис. 1B). Таким чином, отримання даних 1H-ЯМР було технічно задовільним, із прийнятними рівнями варіації, що спостерігалися між об’єднаними зразками, включеними як внутрішній контроль якості.

Таблиця 2. Зміни в результатах дослідження через 6 і 24 місяці в когорті піддослідження з доступними парними зразками сечі 1,2.

1 CSM, комбінована метаболічна хірургія плюс медикаментозна терапія; HbA1c, глікований гемоглобін; IQR, інтерквартильний діапазон; ЛПНЩ, ліпопротеїни низької щільності; MTA, тільки медикаментозна терапія; uACR, співвідношення альбуміну до креатиніну в сечі. 2 Значення наведено як медіана [IQR]. Порівняння між групами проводили за допомогою критеріїв суми рангів Вілкоксона. p-значення < 0.05 виділено жирним шрифтом.

Малюнок 1. Розбіжності в піковій інтенсивності серед базових (n=5) і 6 місяців (n=5) об’єднаних зразків, включених як внутрішній контроль якості. (A) Графік щільності, що описує розподіл значень коефіцієнта варіації для нормалізованої PQN пікової інтенсивності анотованих піків 1H-ЯМР (n=208). Коефіцієнт варіації у відсотках був розрахований таким чином для кожного піку: (стандартне відхилення інтенсивності піку/середня інтенсивність піку) × 100. Розрахунки проводилися окремо для базової лінії та для об’єднаних зразків за 6 місяців. Вісь х було логарифмічно перетворено за допомогою перетворення 'log1p' з пакетних шкал R [25]. Вертикальні пунктирні лінії розмежовують значення коефіцієнта варіації 5% і 15%. (B) Графіки нормалізованих за PQN спектрів об’єднаних зразків для певних піків були виявлені зміненими CSM за допомогою багатовимірного аналізу. Графіки були створені за допомогою функції «ROIplot» з пакету R speak [26]. Вертикальні пунктирні лінії окреслюють зсув PPM для кожного піку на осі x. Значення коефіцієнта варіації для базової лінії (синій) і для об’єднаних зразків за 6 місяців (помаранчевий) накладаються на графіки. 1H-ЯМР, спектроскопія протонного ядерного магнітного резонансу; CV, коефіцієнт варіації (%); PPM, частки на мільйон хімічного зсуву відносно TSP-d4; PQN, нормалізація ймовірнісного коефіцієнта.

2.4. Аналіз основних компонентів піків 1H-ЯМР сечі

Кластеризація вздовж перших трьох основних компонентів виявила дискретні зміни між групами в метаболомі сечі (рис. 2A, B). Три вибірки, що виходять за межі (дві базові лінії, одна MTA6), були ідентифіковані на графіку оцінки (рис. 2A). Ці зразки були включені в багатофакторний аналіз, оскільки їх виключення не змінило помітно продуктивність моделей часткових найменших квадратів (PLS) або піки, визначені як важливі для моделей. Найбільша варіабельність спостерігалася у базових зразках, які, виходячи з навантажень, було ідентифіковано як головним чином викликані екскурсіями цукрів, таких як глюкоза, маноза та сахароза, перед інтенсифікацією лікування (рис. 2C). Амінокислота з розгалуженим ланцюгом (BCAA) валін також сприяла дисперсії у базових зразках. Зразки MTA6 кластеризовані ближче до базових зразків, ніж зразки CSM6. Було визначено, що відокремлення зразків CSM6 від інших зразків пов’язане з підвищеною кількістю таких метаболітів, як N-фенілацетилгліцин і N-оксид триметиламіну, на графіку навантажень.

Рисунок 2. Аналіз головних компонентів (PCA) нормалізованих за PQN піків 1H-ЯМР сечі для всіх доступних зразків (n=97). Кількість зразків по групах: базова лінія, n=54; CSM6, n=19; MTA6, n=24. Наведено перші три основні компоненти з відсотками загальної дисперсії, поясненими кожним із цих основних компонентів, окресленим у назвах осей. Оцінки PCA та еліпсоїди стратифіковані за групами дослідження. Базові зразки з груп CSM і MTA розглядалися разом. (A) Оцінки PCA. Оцінки PCA позначаються точками, вертикальні лінії окреслюють розташування точок xy; (B) PCA еліпсоїди. Точки еліпсоїда PCA були розраховані за допомогою функції 'makeEllipsoid' з пакета R ChemoSpec [27] і представлені для більш чіткого окреслення дискретного кластеризування між групами зразків. Центроїди (середні показники PCA) виділені для трьох груп зразків чорними точками; (C) Навантаження PCA з позначеними вибраними піками. Точки забарвлені відповідно до значень навантаження вздовж основного компонента 1. CSM6, зразки 6 місяця з групи CSM; MTA6, зразки 6 місяців з групи MTA; ПК, головний компонент; PCA, аналіз головних компонентів; PQN, нормалізація ймовірнісного коефіцієнта.

2.5. Відмінності кратних змін у піковій інтенсивності 1H-ЯМР сечі шляхом однофакторного тестування

Не було виявлено істотних відмінностей у кількості метаболітів у сечі між базовими зразками з груп MTA та CSM за допомогою однофакторного тестування (рис. 3A). Найсильнішою зміною в зразках MTA від вихідного рівня до 6-го місяця було статистично незначуще зниження екскреції глюкози з сечею (рис. 3B). Величина зниження екскреції глюкози з сечею була більшою від вихідного рівня до 6-го місяця в зразках CSM і досягла статистичної значущості (рис. 3C). Крім того, після CSM спостерігалося ексклюзивне збільшення екскреції із сечею ряду метаболітів. Найбільш помітними серед них були кілька піків, що містять N-фенілацетилгліцин, N-оксид триметиламіну, 4-амінобутират (ГАМК) і 1-метилнікотинамід. Отже, основні відмінності між зразками 6-го місяця з груп MTA та CSM стосувалися підвищеної екскреції метаболітів із сечею після RYGB, включаючи вищезгадані метаболіти, а також амінокислоти аргінін і глутамін (рис. 3D). Порівняно з групою MTA, концентрації цукрів у сечі, таких як сахароза та арабіноза, а також BCAA валіну, також були нижчими в групі CSM на 6-му місяці.

2.6. Базові метаболомічні відмінності в сечі між групами дослідження: MTA0 проти CSM0

Модель класифікації PLS для базових відмінностей між групами показала кращі результати, ніж очікувалося, хоча вона все ще була досить слабкою з AUC 0,7 (додатковий малюнок S1A). Модель PLS неправильно класифікувала 17 із 54 зразків, в результаті чого загальна точність склала 69% (рис. S1B), причому модель «максимального» MUVR, що відповідає всім вимогам, ідентифікує 200 1піки Н-ЯМР як потенційно корисні для класифікації CSM і Зразки MTA на початковому рівні (рис. S1C). Фактична модель PLS неправильно класифікувала менше вибірок, ніж переставлені моделі з випадково відібраним вектором відповіді Y (p=0.01; рис. S1D). Багато піків, важливих для ефективності моделі, були уремічними токсинами (фенол, гуанідиноацетат) або цукрами (фукоза, маніт, сахароза), хоча спрямованість змін цих двох груп метаболітів не була узгодженою між двома групами дослідження (рис. S1E). Крім того, жоден із метаболітів, визначених цією моделлю, не мав суттєвих відмінностей між обома групами на вихідному рівні за допомогою однофакторного тестування (рис. 3A). Таким чином, ці незначні зміни в метаболічних профілях сечі не вказували на систематичну різницю в тяжкості захворювання на початковому рівні між групами CSM і MTA.

2.7. Метаболіти сечі, пов’язані з відмінностями в етнічній приналежності в групі MTA: кавказька проти інших етнічних груп у зразках MTA0

Оскільки на початковому етапі були відмінності в етнічній приналежності в групі MTA (Таблиця 1; 64% були представниками європеоїдної раси, а 36% належали до іншої етнічної приналежності, включаючи південноамериканців, азіатів та африканців), модель класифікації PLS для європеоїдів (n {{3} }) порівняно з іншими етнічними групами (n=10) було сконструйовано для вивчення пов’язаних з етнічною приналежністю відмінностей у метаболомі сечі у базових зразках MTA. Модель PLS мала високий рівень неправильної класифікації (18 із 28 зразків неправильно класифіковано; загальна точність класифікації 36%) і низьку чутливість (50%) і специфічність (10%; рисунок S2A), незважаючи на оптимізацію ефективності перевірки (рисунок S2B). . Фактична модель PLS не працювала краще, ніж переставлені моделі з вектором відповіді Y із випадковою вибіркою (p=0.97; рис. S2C). Загалом модель PLS не надала доказів, які б свідчили про систематичну різницю в метаболомічних профілях сечі між особами європеоїдної та інших етнічних груп.

2.8. Зміни в метаболомі сечі після MTA: MTA0 проти MTA6

Модель PLS із використанням усіх доступних зразків між базовим рівнем і 6 місяцем у групі MTA була досить слабкою, з AUC 0,68 (рис. S3A). Модель неправильно класифікувала 19 із 52 зразків, що призвело до загальної точності 63% (рис. S3B), незважаючи на оптимізацію продуктивності перевірки «максимальної» моделі шляхом мінімізації кількості неправильних класифікацій (рис. S3C). Фактична модель PLS не мала нижчого рівня неправильної класифікації, ніж випадково переставлені моделі (p {{10}}.06; рис. S3D). Два анотованих піки, які були найважливішими для продуктивності моделі, обидва беруть участь у метаболізмі нікотинаміду, а саме 1-метилнікотинамід і тригонеллін (N-метилнікотинат) (рис. S3E). Екскреція 1-метилнікотинаміду з сечею зросла після MTA, тоді як екскреція тригонеліну зменшилася. В іншому випадку основні відмінності між зразками MTA від вихідного рівня до 6-го місяця були пов’язані зі зниженням екскреції глюкози та пов’язаних з нею метаболітів із сечею. Однак жоден із метаболітів, ідентифікованих цією моделлю, не істотно відрізнявся між зразками MTA0 і MTA6 за однофакторним тестуванням (рис. 3B).

Модель PLS, яка використовувала лише парні зразки між базовим рівнем і 6 місяцем у групі MTA, була слабкою, з AUC 0.56 (Малюнок S4A) і загальною точністю класифікації 46% (Малюнок S4B), незважаючи на навчання та налаштування параметрів моделі для оптимізації продуктивності перевірки (рис. S4C). Кількість неправильних класифікацій за цією моделлю була не нижчою, ніж кількість, досягнута випадково переставленими моделями (p=0.59; рис. S4D). Коли вміст усіх метаболітів у зразках за 6 місяців із групи MTA розглядався разом, наприклад, за допомогою аналізу головних компонентів, їх можна було відрізнити від базових зразків (рис. 2A). Однак ідентифікація окремих метаболітів, яка дозволяла точно передбачити початковий рівень і стан на 6-му місяці в групі MTA, виявилася складною, що вказує на те, що зміни окремих метаболітів у групі MTA були загалом слабкими. Відповідно, значення змінної важливості в проекції (VIP) для 2 0 метаболітів, які вносять внесок у модель PLS парних зразків MTA0 проти MTA6, були вищими (що вказує на нижчу важливість змінної), ніж для 20 основних метаболітів, які вносять внесок в інші моделі PLS. (Рисунок S4E), зокрема ті, що включають зразки за 6 місяців із групи CSM.

2.9. Зміни в метаболомі сечі після CSM: CSM0 проти CSM6

Модель PLS із використанням усіх доступних зразків між базовим рівнем і 6 місяцем у групі CSM показала набагато кращі результати, ніж відповідна модель для групи MTA, з AUC 0,93 (Малюнок 4A). Модель неправильно класифікувала 6 із 45 зразків, що призвело до загальної точності 87%, чутливості 88% і специфічності 84% (рис. 4B). Під час оптимізації продуктивності перевірки кількість помилкових класифікацій також було зведено до мінімуму приблизно до нуля (рис. 4C). Ефективність фактичної моделі CSM0 порівняно з моделлю CSM6 PLS була значно кращою, ніж випадково переставлені моделі (p < 0.001; рис. 4D).

Малюнок 4. Багатофакторний аналіз змін у метаболомі сечі від вихідного рівня до 6 місяця в групі CSM (усі доступні зразки). Кількість зразків, введених у модель MUVR PLS: CSM0, n=26; CSM6, n=19. (A) Крива робочих характеристик приймача для класифікаційної моделі MUVR PLS, що відповідає пікам 1H-ЯМР сечі для цих двох груп зразків. На вставці наведено AUC і відповідний 95% ДІ для кривої. (B) Матриця плутанини, що описує вибіркову класифікацію за моделлю PLS. Вісь X представляє фактичний клас введених зразків. Вісь ординат представляє клас вибірки, передбачений моделями. Правильно та неправильно класифіковані вибірки окреслені на протилежних діагоналях матриці плутанини. Додаткові показники продуктивності, що стосуються класифікації вибірки за порогом імовірності 50%, представлені в таблиці поруч із матрицею помилок. (C) Рекурсивне ранжування та зворотне усунення змінних (справа наліво на осі x) у внутрішніх сегментах моделі MUVR PLS для досягнення оптимальної продуктивності перевірки, кількісно визначеної кількістю неправильних класифікацій (вісь y). Зелені лінії представляють криві перевірки на внутрішній сегмент і можуть коливатися. Помаранчеві та чорні лінії представляють криві внутрішнього сегмента, усереднені на повторення моделі та загалом (100 повторень моделі), відповідно, і описують фактичну ефективність перевірки з вищою роздільною здатністю. Вертикальні лінії окреслюють кількість змінних, вибраних у моделях MUVR «min», «mid» і «max» на осі x. (D) Гістограма та крива щільності, що описують розподіл неправильних класифікацій за 500 переставленими моделями PLS, у яких вектор відповіді Y, що вказує на клас вибірки, був відібраний випадковим чином. Кількість неправильних класифікацій за фактичною моделлю PLS із правильним вектором відповіді Y виділено на осі абсцис синьою пунктирною лінією. Р-значення, отримане з t-критерію Стьюдента, що порівнює кількість помилкових класифікацій між фактичною та зміненою моделями, представлене поруч із гістограмою та кривою щільності. (E) Точкова графіка 20 найбільш важливих анотованих піків ефективності моделі PLS, упорядкованих за значеннями VIP. Для певних метаболітів було виявлено кілька піків. Якщо в певному піку присутні кілька метаболітів, метаболіти перераховуються в порядку відносної кількості в піку, при цьому найпоширеніший метаболіт вказується першим. Прилегла теплова карта ілюструє відносну кількість метаболітів на основі середньої пікової інтенсивності для всіх зразків у двох групах, оцінених за допомогою моделі PLS. 95% ДІ, 95% довірчий інтервал; AUC, площа під кривою робочої характеристики приймача; CSM0, базові зразки з групи CSM; CSM6, зразки 6 місяця з групи CSM; MUVR, багатовимірні методи з неупередженим відбором змінної в R; ЯМР, спектроскопія ядерного магнітного резонансу; NPV, негативне прогностичне значення; PLS, часткові найменші квадрати; PPM, частки на мільйон хімічного зсуву відносно TSP-d4; PPV, позитивне прогностичне значення; VIP, змінна важливість в проекції.

Таким чином, після RYGB відбулися характерні метаболомічні зміни, що дозволило точно класифікувати базові зразки та зразки 6 місяців у групі CSM. Усі сім найбільш важливих анотованих піків для продуктивності моделі містили ко-метаболіт хазяїна та мікробів N-фенілацетилгліцин, екскреція якого з сечею була збільшена після CSM (рис. 4E). Після CSM спостерігалося посилення екскреції із сечею інших супутніх метаболітів хазяїна та мікробів, включаючи N-оксид триметиламіну та 4-амінобутират (ГАМК). Екскреція з сечею амінокислот глутаміну та аргініну також збільшилася після CSM, тоді як екскреція глюкози та BCAA валіну зменшилася. Значення кратних змін у Log2 та скориговані p-значення, отримані в результаті однофакторного тестування відмінностей між групами в піковій інтенсивності 1H-ЯМР сечі для піків, ідентифікованих як диференційовано надлишкові між зразками CSM0 і CSM6, підсумовані в таблиці 3 нижче. VIP-метрики з моделей PLS відповідних порівнянь також представлені в таблиці.

Модель PLS, яка використовувала лише парні зразки між початковим рівнем і 6-м місяцем у групі CSM, працювала так само добре, як і модель, яка використовувала всі доступні зразки з обох часових точок, з AUC 0.94 (Малюнок S5A) і загальна точність класифікації 82% (Малюнок S5B). Подібно до моделі PLS CSM0 проти CSM6 з використанням усіх доступних зразків, продуктивність перевірки цієї моделі парних зразків була оптимізована, щоб майже не було помилкових класифікацій (рис. S5C). Кількість неправильних класифікацій у фактичній моделі PLS парних зразків була значно нижчою, ніж у випадково переставлених моделях (p=0.006; рис. S5D). Обидві моделі CSM0 проти CSM6 PLS, використовуючи всі доступні зразки та лише парні зразки, визначили дуже схожі метаболіти як важливі для розрізнення базових зразків і зразків за 6 місяців у групі CSM. Кілька піків N-фенілацетилгліцину знову були ідентифіковані як найважливіші анотовані піки для ефективності моделі PLS парних зразків (рис. S5E). Екскреція з сечею більшості метаболітів, визначених як важливі для продуктивності моделі, зросла після CSM, за винятком фенілаланіну та валіну, екскреція яких із сечею зменшилася після CSM.

2.10. Відмінності в метаболомі сечі між CSM і MTA

Групи після 6 місяців лікування: MTA6 проти CSM6. Модель PLS для 6-го місяця міжгрупових відмінностей показала хороші результати з AUC 0,91 (Малюнок 5A). Модель неправильно класифікувала 6 із 43 зразків, в результаті чого загальна точність класифікації склала {{10}}%, чутливість 79% і специфічність 92% (рис. 5B). Подібно до обох моделей PLS CSM0 проти CSM6, продуктивність перевірки цієї моделі була оптимізована, щоб майже не було помилкових класифікацій (рис. 5C). Кількість неправильних класифікацій за фактичною моделлю PLS MTA6 проти CSM6 була значно нижчою, ніж досягнута моделями з перестановкою з випадково відібраним вектором відповіді Y (p <0,001; рис. 5D).

Метаболіти, визначені як важливі для ефективності моделі MTA6 проти CSM6, були в основному тими, чия екскреція із сечею сильно змінилася після CSM, і тому були ідентифіковані як впливові метаболіти з точки зору класифікації базових зразків і зразків за 6 місяців у групі CSM (Малюнок 5E). . Кілька піків, що містять N-фенілацетилгліцин, знову були визначені як найважливіші піки для класифікації моделі. Концентрації аргініну, глутаміну, N-фенілацетилгліцину, 4-амінобутирату та N-оксиду триметиламіну в сечі були вищими в групі CSM порівняно з групою MTA на 6-му місяці. І навпаки, екскреція глюкози, валіну та фенілаланіну з сечею була нижче в групі CSM порівняно з групою MTA на 6 місяці.

Малюнок 5. Багатофакторний аналіз відмінностей між групами в метаболомі сечі на 6 місяці (всі доступні зразки). Кількість зразків, введених у модель MUVR PLS: CSM6, n=19; MTA6, n=24. (A) Крива робочих характеристик приймача для класифікаційної моделі MUVR PLS, що відповідає пікам 1H-ЯМР сечі для цих двох груп зразків. На вставці наведено AUC і відповідний 95% ДІ для кривої. (B) Матриця плутанини, що описує вибіркову класифікацію за моделлю PLS. Вісь X представляє фактичний клас введених зразків. Вісь ординат представляє клас вибірки, передбачений моделями. Правильно та неправильно класифіковані вибірки окреслені на протилежних діагоналях матриці плутанини. Додаткові показники ефективності, що стосуються класифікації вибірки за порогом імовірності 50%, представлені в таблиці поруч із матрицею помилок. (C) Рекурсивне ранжування та зворотне усунення змінних (справа наліво на осі x) у внутрішніх сегментах моделі MUVR PLS для досягнення оптимальної продуктивності перевірки, кількісно визначеної кількістю неправильних класифікацій (вісь y). Зелені лінії представляють криві перевірки на внутрішній сегмент і можуть коливатися. Помаранчеві та чорні лінії представляють криві внутрішнього сегмента, усереднені на повторення моделі та загалом (100 повторень моделі), відповідно, і описують фактичну ефективність перевірки з вищою роздільною здатністю. Вертикальні лінії окреслюють кількість змінних, вибраних у моделях MUVR «min», «mid» і «max» на осі x. (D) Гістограма та крива щільності, що описують розподіл неправильних класифікацій за 500 переставленими моделями PLS, у яких вектор відповіді Y, що вказує на клас вибірки, був відібраний випадковим чином. Кількість неправильних класифікацій за фактичною моделлю PLS із правильним вектором відповіді Y виділено на осі абсцис синьою пунктирною лінією. Р-значення, отримане з t-критерію Стьюдента, що порівнює кількість помилкових класифікацій між фактичною та зміненою моделями, представлене поруч із гістограмою та кривою щільності. (E) Точкова графіка 20 найбільш важливих анотованих піків ефективності моделі PLS, упорядкованих за значеннями VIP. Для певних метаболітів було виявлено кілька піків. Якщо в певному піку присутні кілька метаболітів, метаболіти перераховуються в порядку відносної кількості в піку, при цьому найпоширеніший метаболіт вказується першим. Прилегла теплова карта ілюструє відносну кількість метаболітів на основі середньої пікової інтенсивності для всіх зразків у двох групах, оцінених за допомогою моделі PLS. 95% ДІ, 95% довірчий інтервал; AUC, площа під кривою робочої характеристики приймача; CSM6, зразки 6 місяця з групи CSM; MTA6, зразки 6 місяців з групи MTA; MUVR, багатовимірні методи з неупередженим відбором змінної в R; ЯМР, спектроскопія ядерного магнітного резонансу; NPV, негативне прогностичне значення; PLS, часткові найменші квадрати; PPM, частки на мільйон хімічного зсуву відносно TSP-d4; PPV, позитивне прогностичне значення; VIP, змінна важливість в проекції.

У таблиці 3 подано зведення значень кратної зміни log2 та скоригованих значень p, отриманих за допомогою однофакторного тестування відмінностей між групами в інтенсивності піків 1H-ЯМР сечі, а також показників VIP з моделей класифікації PLS відповідних порівнянь для піків, змінених на CSM від базового рівня до 6-місячного спостереження. Перші 20 анотованих піки, відповідно до VIP-рангу, визначені моделями PLS для CSM0 проти CSM6 усіх доступних зразків, CSM0 проти CSM6 парних зразків і MTA6 проти CSM6 усіх доступних представлено порівняння зразків. Спостерігалося значне перекриття найбільш важливих піків у всіх 3 моделях, у результаті чого CSM виявив загалом 25 окремих піків, визначених як змінені. Серед цих 25 піків кілька сполук, таких як N-фенілацетилгліцин і валін, були представлені більше одного разу. Для кожної сполуки з декількома піками було обрано один репрезентативний хімічний зсув, щоб зменшити дублювання інформації, наведеної в таблиці 3.

2.11. Міжпікові кореляції та чисельність за групою дослідження та часові точки піків, змінені CSM від базової лінії до місяця 6

На основі моделей PLS, виділених вище, а також ручного перегляду спектрів, було ідентифіковано 14 метаболітів, змінених CSM від базового рівня до 6-го місяця та з відповідними функціональними групами. Кластеризація міжпікових кореляцій між цими 14 метаболітами визначила три кластери, що складаються з ко-метаболітів хазяїн-мікроб, розгалужених і ароматичних амінокислот і катаболічних проміжних продуктів BCAA (рис. 6A). Концентрації в сечі різних ко-метаболітів хазяїн-мікроб сильно корелюють один з одним, як і амінокислоти з розгалуженим ланцюгом і ароматичні амінокислоти. Катаболічні проміжні продукти BCAA були більш слабко корельовані один з одним. Ароматичні амінокислоти були сильніше пов’язані з BCAA, ніж з ко-метаболітами хазяїн-мікроб, незважаючи на той факт, що змінений метаболізм ароматичних амінокислот хазяїн-мікроб спричинив утворення таких метаболітів, як N-фенілацетилгліцин і 4-гідроксифенілацетат. постійно повідомлялося після RYGB [28–33].

У групі CSM збільшення екскреції метаболітів із сечею від базового рівня до 6-го місяця, що відображає зміни в кишковому мікробному метаболізмі та кишковому транспорті амінокислот після RYGB, було помітним і статистично значущим для N-фенілацетилгліцину (p < 0). 001), N-оксид триметиламіну (p=0.001), 4-амінобутират (GABA; p=0.002), аргінін (p=0.001) і глутамін (p=0.001) (Малюнок 6B). Екскреція цих метаболітів із сечею не була змінена MTA.

Так само екскреція з сечею ароматичних амінокислот, фенілаланіну (p=0.003) і тирозину (p=0.003), а також BCAA валіну (p=0.001) і лейцину (p=0.02), було значно знижено від вихідного рівня до 6 місяця після CSM, але не MTA. Екскреція із сечею BCAA ізолейцину також мала тенденцію до зниження після CSM, але це не було значущим (p=0.25). Відповідно до зниження екскреції BCAA із сечею та вказуючи на посилений катаболізм BCAA, екскреція BCAA катаболічних проміжних продуктів також зменшилася після CSM. Концентрація валіну (3-гідроксиізобутирату; p=0.04), ізолейцину (3-метил-2-оксовалерат; p=0.04) і лейцину ( 3-гідроксіізовалерат; p=0.06) катаболіти зменшилися після CSM, але не MTA.

Малюнок 6. Міжпікові кореляції та кількість за групами дослідження та часовими точками піків, змінених CSM від початкового рівня до 6 місяця. (A) Теплова карта кореляцій між нормалізованими за PQN значеннями пікової інтенсивності для 14 вибраних метаболітів. Метаболіти були відібрані на основі визначення CSM як сильно змінених від початкового рівня до 6 місяця за допомогою багатофакторних моделей PLS. Додаткові метаболіти були відібрані вручну на основі приналежності до функціональних груп, подібних до тих метаболітів, ідентифікованих за допомогою моделей PLS. Рядки та стовпці теплової карти зображують окремі метаболіти, а значення кореляції Пірсона r представлені в клітинках теплової карти. Функціональні групи метаболітів ідентифікуються анотаціями в рядках і стовпцях таким чином: сині=метаболіти відображають зміни кишкового мікробного метаболізму або кишкового транспорту після RYGB; сірі=метаболіти, що відображають катаболізм BCAA; коричневі=ароматичні амінокислоти. Прогалини в рядках і стовпцях теплової карти розмежовують кластери метаболітів на основі коефіцієнтів кореляції. (B) Нормалізована за PQN кількість 14 метаболітів, зазначених на тепловій карті на панелі (a), за групами дослідження та часовими точками. Кількість зразків: CSM0, n=26; CSM6, n=19; MTA0, n=28; MTA6, n=24. 2 верхні рядки (сині панелі) вказують на метаболіти, що відображають зміни в кишковому мікробному метаболізмі або кишковому транспорті після RYGB. Нижні 2 рядки вказують на ароматичні амінокислоти (коричневі панелі) і метаболіти, що відображають катаболізм BCAA (сірі панелі). Представлено р-значення, отримані з непарних t-тестів базової лінії та різниці пікової інтенсивності за 6 місяців у групах CSM та MTA. р-значення були скориговані на кратність для кількості порівнянь за допомогою методу Бенджаміні-Хохберга. BCAA, амінокислота з розгалуженим ланцюгом; CSM, комбінована метаболічна хірургія плюс медикаментозна терапія; CSM0, базові зразки з групи CSM; CSM6, зразки 6 місяця з групи CSM; MTA, тільки медикаментозна терапія; MTA0, базові зразки з групи MTA; MTA6, зразки 6 місяців з групи MTA; PLS, часткові найменші квадрати; PQN, нормалізація імовірнісного коефіцієнта; RYGB, Roux-en-Y операція шлункового шунтування.

2.12. Кореляції між змінами в метаболітах, що відображають ко-метаболізм «хазяїн-хазяїн-мікроб» і BCAA

Катаболізм із покращенням метаболічних і ниркових індексів після CSM для DKD Поліпшення окремих метаболічних і ниркових параметрів від базового рівня до 6 місяця після CSM були тісно пов’язані зі ступенем покращення, що спостерігається на 24 місяці. Кореляції, виділені помаранчевим затіненням на малюнку 7, підкреслюють, що Значення r > 0.7 спостерігалися між 6 і 24 місяцями зміни індивідуальних метаболічних і ниркових індексів після CSM, включаючи ІМТ, САТ, HbA1c, тригліцериди та ACR. Усі ці кореляції були статистично значущими, із спостережуваними p-значеннями < 0.05 (рис. S6).

Зв’язок між зміною рівня HbA1c на 6-му та 24-му місяцях був особливо сильним, зі значенням r 0,97 (p < 0,001). Таким чином, величина ранніх покращень індивідуальних метаболічних і ниркових індексів після CSM чітко передбачила величину покращень, що спостерігаються під час 2--річного спостереження.

Зменшення ІМТ є одним із найбільш постійних ефектів баріатричної хірургії, а ступінь втрати ваги вважається основним визначальним фактором покращення інших метаболічних параметрів. Однак, як зазначено в клітинках, виділених чорним кольором на малюнку 7, спостерігалися відсутні або слабкі кореляції між змінами ІМТ на 6 і 24 місяці зі змінами артеріального тиску, глікемії, тригліцеридів і log uACR на 6 і 24 місяці в CSM. рука. Усі p-значення для цих кореляцій були > 0.25 і незначущі (Малюнок S6). Найсильніші такі кореляції спостерігалися між змінами ІМТ та log uACR (місяць 6, r=0,36 [p=0,27]; місяць 24, r=0,22 [p=0.54]), хоча вони залишалися досить слабкими. Таким чином, у групі CSM кількість втрати ваги не сильно корелювала з покращенням інших метаболічних параметрів і ниркових показників. У той час як поліпшення ІМТ були цілком постійними на 6-му місяці після CSM, покращення інших метаболічних параметрів і ниркових індексів були більш мінливими, і ця мінливість не була добре відображена змінами ІМТ. Ми досліджували, чи корелюють зміни в екскреції метаболіту з сечею сильніше, ніж зміни в ІМТ, з поліпшенням метаболічних і ниркових показників після CSM.

Помірно сильні кореляції спостерігалися між метаболітами, що відображають катаболізм BCAA (валін плюс катаболічні проміжні продукти BCAA {{0}}гідроксиізобутират, 3-гідроксиізовалерат і 3-метил-2-оксовалерат) із покращенням артеріального тиску, HbA1c та альбумінурії в групі CSM (рис. 7, S6 та S8). Кореляції між метаболітами, що відображають катаболізм BCAA, з ІМТ і тригліцеридами були загалом слабкими. Як показано в клітинках, виділених жовтим кольором на малюнку 7, кореляції з покращенням артеріального тиску на 6 і 24 місяці були найсильнішими для валіну, 3-гідроксиізобутирату та 3-метил-2-оксовалерату (місяць 6: r=0.76 [p=0.01] для валіну, r=0.46 для 3-гідроксиізобутирату [p=0.18], і r=0.84 [p < 0,001] для 3-метил-2- ізовалерату; місяць 24: r=0.55 [p=0.12] для валіну , r=0.67 [p=0.05] для 3-гідроксиізобутирату та r=0.67 [p=0.05] для {{44 }}метил-2-оксовалерат). Зміни валіну та 3-метил-2- оксовалерату не корелювали суттєво з покращенням інших клінічних параметрів. Однак, як виділено в клітинках, окреслених жовтим кольором на малюнку 7, як 3-гідроксиізобутират, так і 3-гідроксиізовалерат помірно сильно корелюють із покращенням рівня HbA1c та альбумінурії на 6-му та 24-му місяцях із взаємозв’язком із log uACR дещо сильніше (місяць 6: r=0.57 [p=0.07] для 3-гідроксиізобутирату та r=0.55 [p=0.08 ] для 3-гідроксиізовалерату; місяць 24: r=0.59 для 3-гідроксиізобутирату [p=0.07] і r=0.65 [p {{ 73}}.04] для 3-гідроксіізовалерату). Помірно сильні кореляції з покращенням клінічних параметрів, очевидні для 6-го місяця зміни метаболітів у сечі, що відображають катаболізм BCAA, контрастують зі слабкими, що спостерігаються для 6-го місяця зміни ІМТ на кореляційних діаграмах розсіювання на малюнку S8.