Вправи на біговій доріжці запобігають погіршенню просторового навчання та пам’яті у мишей 3×Tg-AD через посилення структурної синаптичної пластичності гіпокампу та префронтальної кори. Частина 2

2.5. Вестерн-блот

Мишей анестезували шляхом інгаляції ізофлурану та обезголовлювали. Тканини гіпокампу або префронтальної кори лізували в холодному буфері для лізису RIPA (Thermo ScientificPierce, Waltham, MA, США), доповненому сумішшю інгібіторів протеази та фосфатази (Roche, Indianapolis, IN, USA).

Буфери для лізису дозволяють дослідникам у біологічних лабораторіях краще контролювати експериментальні умови, тим самим краще вивчаючи ріст і зміни клітин, що відіграє важливу роль в наукових і медичних дослідженнях.

Окрім того, що буфери лізису корисні для досліджень, вони також можуть мати позитивний вплив на покращення пам’яті людини. Згідно з останніми дослідженнями, хімічні компоненти, багаті буферами лізису, можуть сприяти росту та розвитку нервових клітин, тим самим покращуючи пам’ять мозку.

Дослідження показало, що певні компоненти буферів лізису можуть сприяти передачі сигналу між певними нервовими клітинами, тим самим покращуючи здатність мозку до навчання та пам’яті. Крім того, ці компоненти можуть стимулювати ріст нервових клітин і допомагати мозку краще адаптуватися до нового середовища та нового навчання. Результатом цих ефектів є те, що люди можуть краще сприймати нові знання та довше їх запам’ятовувати.

Звичайно, буфери лізису самі по собі не можуть чарівним чином вирішити всі проблеми пам'яті. Вченим ще потрібно провести додаткові дослідження щодо того, як використовувати ці відкриття для покращення людської пам’яті. Однак позитивне значення цього відкриття вже є дуже очевидним: буфери лізису можуть дати хороший початок для покращення людської пам’яті та надати більше можливостей для майбутніх наукових досліджень. Можна побачити, що нам потрібно покращити пам’ять, і цистанхе може значно покращити пам’ять, оскільки цистанхе є традиційним китайським лікарським матеріалом із багатьма унікальними ефектами, одним із яких є покращення пам’яті. Дія цистанхе залежить від різноманітних активних інгредієнтів, які він містить, включаючи дубильну кислоту, полісахариди, флавоноїдні глікозиди тощо. Ці інгредієнти можуть сприяти здоров’ю мозку різними способами.

Натисніть Знати способи покращення пам’яті

Загальний білок вимірювали за допомогою аналізу BCA (Thermo Scientific Pierce, США). Зразки нагрівали при 100 ◦C протягом 15 хв. Для вестернблоттингу рівну кількість білка завантажували (20 мкг/лунку) у 12% гель. Після електрофорезу та перенесення на мембрани PVDF (Millipore, IPVH00010, Берлінгтон, Массачусетс, США) їх інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з блокуючим буфером (5% буфер BSA).

Мембрани PVDF інкубували протягом ночі з первинним антитілом (GAPDH, 1:10, 000, Abcam, Бостон, Массачусетс, США; PSD95, 1:500, Abcam, США; Syn, 1:500, Abcam, США) .

Потім їх промивали буфером TBST тричі з 5-хвилинними інтервалами та інкубували протягом 1 години з HRP-кон’югованим козячим антикролячим або HRP-кон’югованим козячим антимишачим вторинним антитілом (1:15, 000, Proteintech Group, Rosemont , Іллінойс, США), а потім промивання TBST з 5-хвилинними інтервалами.

Рівні білка виявляли за допомогою хемілюмінесцентних реагентів (ThermoScientific Pierce, Waltham, MA, США), а смуги вимірювали за допомогою програмного забезпечення Image J.

2.6. Електронна мікроскопія

Мишей глибоко анестезували хлоралгідратом і транскардіально перфузували PBS, а потім 4% параформальдегідом і 2,5% розчином глутаральдегіду в 0.1 Мфосфатному буфері протягом 20 хвилин.

Мозок видаляли і занурювали в той самий фіксатор на ніч. Гіпокамп і префронтальну кору забарвлювали 1% тетроксидом осмію, а потім зневоднювали в серії ацетону.

Тканини нарізали на надтонкі зрізи, пофарбували уранілацетатом і цитратом свинцю та дослідили за допомогою електронного мікроскопа Hitachi H-7100. Фотографії випадкових положень із цих зразків були зроблені зі збільшенням × 30,000 (22 мкм2).

Синапси з круглими везикулами, асиметричними синапсами та одним великим синаптичним контактом вважалися збуджуючими синапсами, тоді як пресинаптичні термінали з плеоморфними сплощеними везикулами та симетричними синапсами вважалися гальмівними синапсами [48].

Ми проаналізували кількість імовірних збуджувальних синапсів (22 мкм2/кожне поле зображення, рис. 2) у гіпокампі та префронтальній корі кожної миші, а потім усереднили кількість синапсів шести полів зображення з тієї ж групи (6 полів зображення від 4 мишей). в кожній групі).

Довжину синаптичної активної зони, ширину синаптичної щілини, кривизну синаптичної межі та товщину постсинаптичної щільності з 12–15 випадково вибраних синапсів було визначено кількісно та порівняно з 4 мишами на групу (рис. 3).

Довжину активної зони та товщину постсинаптичної щільності вимірювали за Гюльднером [49]. Синаптична щілина була визначена як найяскравіша область між пре- та постсинаптичною мембранами [50].

Синаптичну кривизну визначали за формулою: R=a/2 + b2/8a, де b — лінія, що з’єднує два кінці постсинаптичного потовщення, а — перпендикулярна відстань від постсинаптичної мембрани до b [51]. ,52] (див. Малюнок 3A).

Рисунок 2. Вправи на біговій доріжці збільшують кількість синапсів гіпокампу та префронтальної кори головного мозку у мишей 3×Tg-AD. (A) Репрезентативне електронно-мікроскопічне зображення гіпокампу та префронтальної кори головного мозку в контрольних мишах без Tg, фізичних навантажень без Tg, контрольних 3×Tg-AD та 3×Tg-AD фізичних мишей.

Сині стрілки позначають синапси. Червона рамка представляє збільшений синапс. Розширене зображення синапсів префронтальної кори у великому збільшенні показано в червоному квадраті внизу. (B, C) Кількість синапсів гіпокампу (B) і префронтальної кори (C) була значно знижена в контрольній групі 3×Tg-AD порівняно з контрольною групою без Tg (*** p < 0 .001,n=6 розділи зображення), і це зниження було заблоковано попередньою обробкою вправ на біговій доріжці як у гіпокампі (B), так і в префронтальній корі (C) (*** p < 0,001, n {{ 9}} розділів зображення).

Попередня обробка вправами на біговій доріжці збільшила кількість синапсів гіпокампу (B) і префронтальної кори (C) у мишей без Tg (** p < 0.01, n=6 розділів зображення). Кожен набір даних був отриманий від 4 мишей.

Малюнок 3. Вправи на біговій доріжці покращують синаптичні структурні параметри гіпокампу та префронтальної кори у мишей 3×Tg-AD. (A) Репрезентативне вимірювання синаптичних структурних параметрів.

Для визначення синаптичної кривизни використовувалася формула R=a/2 + b2/8a, де b — лінія, що з’єднує два кінці постсинаптичного потовщення, а a — перпендикулярна відстань від постсинаптичної мембрани до b.

(B, C) Довжина синаптичної активної зони гіпокампу (B) і префронтальної кори (C) була значно зменшена в контрольній групі 3×Tg-AD порівняно з контрольною групою без Tg (*** p < {{ 3}}.001, n=12–15 синапсів), і це зменшення було заблоковано попередньою обробкою вправ на біговій доріжці як у гіпокампі, так і в префронтальній корі (*** p < { {18}}.001, n=12–15). (D, E) Ширина синаптичної щілини гіпокампу (D) і префронтальної кори (E) була значно збільшена в контрольній групі 3×Tg-AD порівняно з контрольною групою без Tg (*** p < {{ 30}}.001, n=12–15 синапсів), і це збільшення було заблоковано попередньою обробкою вправ на біговій доріжці як у гіпокампі (D;** * p < 0.001, n=12–15 синапсів) і префронтальної кори (E; ** p < 0,01, n=12–15). (F, G) Синаптична кривизна гіпокампу (F; *** p < 0,001, n=12–15) і префронтальної кори (G; ** p < 0,01, n=12–15 ) значно знизився в контрольній групі 3×Tg-AD порівняно з контрольною групою без Tg, і це зниження було заблоковано попередньою обробкою вправ на біговій доріжці як у гіпокампі (F; ** p < 0,01, n=12– 15) та префронтальну кору (G; *** p < 0,001, n=12–15). (H, I) Товщина постсинаптичної щільності гіпокампу (H) і префронтальної кори (I) була значно зменшена в контрольній групі 3 × Tg-AD порівняно з контрольною групою без Tg (*** p < 0,001, n {{ 50}}–15), і це зниження було заблоковано попередньою обробкою вправ на біговій доріжці як у гіпокампі (H; ** p <0,01,n=12–15), так і в префронтальній корі (I; *** p <0,001, n=12–15).

Кожен набір даних складався з 12 і 15 синапсів від 4 мишей у кожній групі.

2.7. Статистика

Аналіз даних не враховував генотипи та історію лікування мишей. Дані представлені як середнє ± SEM. Набори даних порівнювали за допомогою двостороннього дисперсійного аналізу з наступним аналізом Tukey. Застережні аналізи проводили лише тоді, коли дисперсійний аналіз давав значний основний ефект або значну взаємодію між двома факторами. Результати вважалися значущими при p < 0,05.

3. Результати

3.1. Вправи на біговій доріжці запобігли погіршенню просторового навчання та пам’яті у мишей 3×Tg-AD

Спочатку ми намагалися визначити, чи мали шестимісячні миші 3×Tg-AD порушення просторового навчання та пам’яті, і чи запобігала попередня обробка вправами на біговій доріжці погіршенню просторового навчання та пам’яті у шестимісячних мишей 3×Tg-AD.

Контрольні миші без Tg і миші 3×Tg-AD отримували 12-тижневу вправу на біговій доріжці або контрольну терапію без вправ, починаючи з тримісячного віку (факторний дизайн 2 × 2: генотип проти вправ).

Після 12-тижневого навчання для дослідження просторового навчання та пам’яті мишей використовувався тест радіального лабіринту з восьми рукавів. Вимірювали як робочу пам’ять (здатність запам’ятовувати протягом відносно короткого періоду), так і еталонну пам’ять (пам’ять для інформації, яка зберігається постійною протягом тривалого часу) (різниця між робочою та еталонною пам’яттю описана в розділі 2, малюнок 1A).

Двосторонній дисперсійний аналіз показав, що генотип і вправи на біговій доріжці мали значний вплив на відсоток помилок робочої пам’яті на 5 день (генотип: F1,39=8.6, p=0.006; вправи на біговій доріжці: F1,{{ 8}}.5, p=0.024; генотип × взаємодія на біговій доріжці: F1, 39=4.2, p=0.047; рис. 1B) і день 6 (генотип: F1 ,39=6.1, p=0.019; вправа на біговій доріжці: F1,39=6.4, p=0.016; генотип × вправа на біговій доріжці:F1,{{30 }}.6, p=0.039; Рисунок 1B) сеансу збору даних.

Post hoc тести Tukey показали, що відсоток помилок робочої пам’яті був значно збільшений у контрольній групі 3×Tg-AD порівняно з контрольною групою без Tg (і на 5-й, і на 6-й день: p < 0).01; Малюнок 1B. ).

Збільшенню відсотка помилок робочої пам’яті запобігли попередні вправи на біговій доріжці (і 5-й, і 6-й день: p < 0.01; рис. 1B). Проте двосторонній дисперсійний аналіз виявив, що генотип і вправи на біговій доріжці не мали істотного впливу на відсоток помилок пам’яті еталонного зразка (наприклад, 10-й день, генотип: F1, 39=0.2, p=0.6; бігова доріжка вправа: F1,39=0.04, p=0.8; генотип × взаємодія вправ на біговій доріжці: F1,39=0.873,p=0.4; Рисунок 1C) в всі 10 днів сесії придбання.

Разом ці результати свідчать про те, що шестимісячні миші 3×Tg-AD демонстрували порушення просторової робочої пам’яті, але не пам’яті еталонів, і вправи на біговій доріжці запобігають погіршенню просторової робочої пам’яті у мишей 3×Tg-AD.

3.2. Вправи на біговій доріжці збільшили кількість синапсів і покращили синаптичні структурні параметри гіпокампу та префронтальної кори у мишей 3×Tg-AD

Щоб дослідити, чи було викликане вправами на біговій доріжці зниження просторового навчання та пам’яті пов’язане зі структурною синаптичною пластичністю, ми кількісно визначили кількість синапсів і синаптичні структурні параметри гіпокампу та префронтальної кори, які є критично важливими для передачі інформації, пов’язаної з навчанням і пам’яттю (Малюнок 2A).

Двосторонній дисперсійний аналіз показав, що генотип і вправи на біговій доріжці мають значний вплив на кількість синапсів в обох гіпокампі (генотип: F1, 23=59.3, p < 0.0{{9} }1; вправа на біговій доріжці: F1, 0}, p < 0,001; взаємодія вправ на біговій доріжці: F1, 23=5, p=0.027; рис. 2B) і префронтальну кору (генотип: F1, 23=48.6, p < 0,001; бігова доріжка: F1, 23=59.8, p < 0,001; генотип × взаємодія вправ на біговій доріжці: F1,23=8.5,p=0.009, рис. 2C); Post hoc тести Tukey показали, що кількість синапсів гіпокампу та префронтальної кори головного мозку значно зменшилася в контрольній групі 3×Tg-AD порівняно з контрольною групою без Tg (p <0,001; рис. 2B, C).

Попереднє лікування вправами на біговій доріжці блокувало зменшення кількості синапсів як у гіпокампі, так і в префронтальній корі головного мозку у мишей 3×Tg-AD (p < 0.001; рис. 2B, C).

Тим часом вправи на біговій доріжці збільшували кількість синапсів у гіпокампі та префронтальній корі у мишей без Tg (p < 0.01; рис. 2B, C).

Для подальшої оцінки ефективності синаптичної передачі ми виміряли та проаналізували ультраструктурні параметри за допомогою електронної мікроскопії (ЕМ), включаючи довжину синаптичної активної зони, ширину синаптичної щілини, синаптичну кривизну та товщину постсинаптичної щільності в гіпокамп і префронтальну кору (рис. 3A).

Попередні дослідження виявили, що більша синаптична активна зона є більш ефективною для збудження постсинаптичних нейронів, а вкорочення активної зони може відображати стан порушення ефективності синаптичної передачі [36].

Двосторонній дисперсійний аналіз показав, що генотип і вправи на біговій доріжці мають значний вплив на довжину синаптичної зони в обох гіпокампі (генотип: F1, 53=10).6, p=0.0{{ 20}}2; вправа на біговій доріжці: F1,53=5.0, p=0.03; взаємодія генотипу на біговій доріжці: F1,53=9.2, p { {14}}.004; малюнок 3B) і префронтальну кору (генотип: F1, 56=17.4, p < 0,001; вправа на біговій доріжці: F1, 56=5.0, p=0. 03; генотип × взаємодія вправ на біговій доріжці: F1, 56=6.8, p=0.012, рис. 3C).

Астрономічні тести Тьюкі показали, що довжина синаптичної активної зони гіпокампу та префронтальної кори значно зменшилася в контрольній групі 3×Tg-AD порівняно з контрольною групою без Tg (p < 0.001; Рисунок 3B, C).

Попередня обробка вправами на біговій доріжці збільшила довжину синаптичної активної зони як у гіпокампі (p < 0,001; рис. 3B), так і в префронтальній корі (p=0,001; рис. 3C) у мишей 3×Tg-AD .Синаптична щілина — це вузький простір ~20 нм між закінченням аксона пресинаптичного нейрона та мембраною постсинаптичного нейрона.

Оптимальне вкорочення синаптичної щілини може мати адаптивну функцію оптимізації синаптичної сили шляхом підвищення ефективної концентрації вивільнених нейромедіаторів і зменшення ефективного опору розщелині [37,38].

Двосторонній дисперсійний аналіз показав, що генотип і вправи на біговій доріжці мали значний вплив на ширину синаптичної щілини в обох гіпокампі (генотип: F1, 55=21.5, p < 0.0{ {24}}1; вправа на біговій доріжці: F1,{7}}.1, p < 0,001 × взаємодія бігової доріжки: F1,{12}}.025; і префронтальна кора (генотип: F1, 53=10.6, p=0.002; вправа на біговій доріжці: F1, 53=5.0, p=0.03; генотип × бігова доріжка вправа взаємодії: F1, 53=9.2, p=0.004; рис. 3E).

Астрономічні тести Тьюкі показали, що ширина синаптичної щілини гіпокампу та префронтальної кори була значно збільшена в контрольній групі 3×Tg-AD порівняно з контрольною групою без Tg (p < 0.001; Малюнок 3D, E).

Попередня обробка вправами на біговій доріжці зменшила ширину синаптичної щілини як у гіпокампі (p < 0,001; рис. 3D), так і в префронтальній корі (p=0,001; рис. 3E) у мишей 3×Tg-AD.

For more information:1950477648nn@gmail.com