Шлях до прогресу в доклінічних дослідженнях вікових нейродегенеративних захворювань: погляд на моделі гризунів і HiPSC, частина 2

На додаток до трансгенних моделей, розроблених окремими академічними лабораторіями, Національний інститут здоров’я (NIH) зараз очолює Проект цільового відкриття та доклінічної перевірки Accelerating Medicines Partnership-AD (AMP-AD), який є консорціумом багатоінституційних та міждисциплінарних грантів які разом мають намір пришвидшити шляхи відкриття ліків для AD (https://www.nia.nih.gov/research/dn/amp-ad-target-discovery-and-preclinicalvalidation-project).

З бурхливим розвитком біотехнологій трансгенна технологія поступово стала застосовуватися в біологічній сфері. Трансгенна технологія — це технологія генної інженерії, яка вводить чужорідні гени в організми, щоб вони виявляли певні характеристики. Проте існують суперечки щодо зв’язку між трансгенними моделями та пам’яттю.

Деякі дослідники вважають, що трансгенні моделі можуть позитивно впливати на пам'ять. Наприклад, деякі експерименти з трансгенними тваринами показали, що шляхом зміни певних генів можна покращити здатність до навчання та пам’ять тварин. Ці експериментальні результати показують, що трансгенна технологія потенційно може покращити когнітивні здібності людини.

Незважаючи на те, що результати цих досліджень дуже цікаві, нам також потрібно бути обережними, оскільки результати цих експериментальних процесів не є результатом сприяння людини чи поспішного застосування. Нам потрібно провести більше досліджень цієї технології, щоб зрозуміти її потенційні ризики для навколишнього середовища та людей, а також виміряти її можливий соціальний вплив. У той же час ми також повинні визнати, що покращення пам’яті залежить не лише від генів, але також від фізичного здоров’я та здорових звичок життя, які можуть досягти хорошого стану пам’яті через нормальні канали.

Одним словом, ми повинні з нетерпінням чекати позитивних аспектів трансгенної технології та належним чином регулювати та оцінювати її. Завдяки раціональному використанню трансгенних технологій ми можемо змінити наш геном, що допоможе нам вирішити деякі медичні та екологічні проблеми, одночасно сприяючи прогресу людства в багатьох сферах, включаючи покращення пам’яті. Можна побачити, що нам потрібно покращити пам’ять, і Cistanche може значно покращити пам’ять, оскільки він має антиоксидантну, протизапальну та антистарільну дію, що може допомогти зменшити окислення та запальні реакції в мозку, тим самим захищаючи здоров’я нервова система. Крім того, Cistanche також може сприяти росту та відновленню нервових клітин, тим самим покращуючи зв’язок і роботу нейронних мереж. Ці ефекти можуть допомогти покращити пам’ять, здатність до навчання та швидкість мислення, а також можуть запобігти виникненню когнітивної дисфункції та нейродегенеративних захворювань.

Клацніть «Знай, як покращити роботу мозку».

Особливо актуальним для цього огляду є підрозділ AMP-AD під назвою «Ініціатива «Розробка та оцінка моделі організму для НАВАНТАЖЕННЯ» (MODEL-AD). MODEL-AD має на меті генерувати нові трансгенні лінії мишей, які точно моделюють фенотипи AD і служать удосконаленою платформою для конвеєра розробки ліків, а також більш придатних для перекладу та біологічно релевантних моделей для доклінічної перевірки DMT.

Ініціатива MODEL-AD складається з Центру Медичної школи Університету Індіани, Лабораторії Джексона, Sage Bionetworks, Медичної школи Університету Пітсбурга та центру Каліфорнійського університету в Ірвайні.

Разом цей консорціум має намір створити наступне покоління моделей AD in vivo на основі даних про людину суворим і строго контрольованим способом. Таким чином, він спрямований на узгодження патофізіологічних особливостей моделей AD з відповідними стадіями клінічного захворювання, використовуючи трансляційні біомаркери як засіб підвищення трансляційності доклінічних результатів.57

На сьогоднішній день створено 54 моделі мишей AD, включаючи мишей fAD, APOE, APP, MAPT/tau, а також моделі LOAD на основі накопичення Ab та інших раніше ідентифікованих варіантів, пов’язаних з LOAD (https://www.model-ad.org). /strain-table/), які доступні через JAX/IU/Pitt AD Precision ModelsCenter.

Хіміко-токсинові моделі AD

На додаток до останніх трансгенних моделей, моделі гризунів AD історично базувалися на впливі токсичних сполук, які викликають селективну нейродегенерацію, що призводить до когнітивних і поведінкових порушень, подібних до тих, що спостерігаються у пацієнтів з AD.

У той час як різноманітні моделі впливу токсинів були використані для вивчення як AD, так і PD, моделі AD були значною мірою замінені новішими трансгенними моделями, які обговорювалися вище.

Хімічні моделі AD індукують AD-подібну патологію за допомогою сполук, які вибірково та оборотно порушують активність холінергічних нейронів, або токсинів, які назавжди порушують процеси клітинного гомеостазу, що призводить до загибелі клітин, таких як окадаїнова кислота та різні класи важких металів 58 (таблиця 2). Незважаючи на те, що ці моделі викликають деякі неврологічні та поведінкові дефіцити, які нагадують симптоми AD, включаючи порушення навчання та пам’яті, у них здебільшого відсутні патологічні ураження AD (тобто бляшки Ab та NFT).

Моделі на тваринах, які чітко зосереджуються на руйнуванні холінергічних нейронів, базуються на дещо застарілій холінергічній гіпотезі AD.59 У таких моделях антагоністи мускаринових рецепторів, наприклад, сполука скополамін, доставляються до цільових областей мозку, таких як HP, для блокування ендогенну активність ацетилхоліну та викликають когнітивні порушення в навчанні та пам’яті.60

Інші моделі хімічного втручання AD передбачають місцеве або периферичне введення нейротоксинів, що призводить до неспецифічної загибелі нейрональних клітин61–64 (табл. 2).

Трансгенні моделі БП

Як і у випадку AD, трансгенні мишачі моделі PD дозволяють вивчати клінічні ознаки захворювання, викликані маніпуляціями з генетичними локусами, пов’язаними з менделівськими формами захворювання, і сотні унікальних ліній зараз доступні для продажу.

Як і AD, більшість клінічних випадків хвороби Паркінсона класифікуються як спорадичні, причому спадкові форми хвороби становлять менше 1% усіх випадків.89 Генетичні зміни в генах SNCA, LRRK2 і UCH-L1 пов’язані з аутосомно-домінантними формами PD, тоді як зміни в генах PRKN, PINK1 і DJ-1 пов’язані з аутосомно-рецесивними формами90 (табл. 1).

Двома генами, на які найчастіше вражають трансгенні моделі БП, є SNCA та LRRK2.91,92 Мутації в цих генах викликають сімейну БП і також були пов’язані зі спорадичною формою БП через GWAS.93

Крім того, роль гіперекспресії SNCA у сімейних (випадки трьох/подвоєння) та спорадичних БП була добре встановлена.94

На сьогоднішній день більшість трансгенних моделей, які маніпулюють SNCA, не лише вводять сімейні міссенс-мутації, але й використовують стратегію надекспресії шляхом введення кількох копій гена SNCA людини чи миші для імітації збільшення виробництва a-синуклеїну (a-syn), окремо або в комбінації з сімейна міссенс-мутація.95–97

Місенс-мутація в LRRK2 є найбільш поширеною мутацією, пов’язаною з сімейним БП98, і кілька трансгенних ліній мишей було створено на основі різноманітних відомих мутацій LRRK2.

Мутація GS2019S, наприклад, призводить до мутації посилення функції з посиленою активністю кінази.99 Інші моделі, такі як мутації R1441C/G, T1348N і A2016T, повідомляють про зміни в експресії або агрегації ina-syn, а в деяких випадках, номінальний моторний дефіцит; однак точні дефіцити та клінічні ознаки суттєво відрізняються серед моделей.89,92,100

На додаток до генів SNCA і LRRK2 було створено кілька інших трансгенних ліній, для яких націлені інші гени, асоційовані з PD (Таблиця 1). У той час як багато з цих моделей успішно змінюють експресію та агрегацію a-syn, більшість демонструють невелику кількість або відсутність нейродегенерації, і, отже, рухові функції залишаються відносно непорушеними92 (Таблиця 1).

Ретельний аналіз а-син-агрегатів, утворених у багатьох із цих трансгенних ліній, також показав, що утворені включення не нагадують природні тільця Леві (LB), які спостерігаються в посмертному мозку при ПД, а замість цього демонструють унікальний структурний склад.101

Нездатність трансгенних моделей відтворити як молекулярні, так і нейродегенеративні аспекти хвороби Паркинсону, ймовірно, пов’язана з поєднанням кількох факторів. Головне серед цих занепокоєнь полягає в тому, що природа та ступінь залучення генів, пов’язаних із сім’єю, і більш поширеної спорадичної форми захворювання залишаються неясними, що ставить під сумнів відповідність моделей, заснованих на маніпуляції цими генами, для переважної більшості випадків хвороби Паркінсона.

Іншим обмеженням є те, що трансгенні моделі призводять до надмірної експресії трансгену, яка не імітує фізіологічні рівні і, таким чином, може вводити артефакти. Крім того, спорадична форма захворювання, ймовірно, включає зміни в багатьох генах, причому на сприйнятливість додатково впливають компоненти навколишнього середовища, що свідчить про те, що моногенні трансгенні моделі можуть мати обмежену корисність.

Загалом, багато тих самих проблем, що мучать трансгенні моделі AD, стосуються і моделей хвороби Паркінсона: наразі недостатньо розуміння точної ролі генів, пов’язаних із сім’єю, в етіології хвороби хвороби та ступеня, до якого вони сприяють виникненню спорадичних форм захворювання.

Ці проблеми надзвичайно ускладнили створення трансгенної моделі PD, яка точно відтворює накопичення a-syn і формування LB, у свою чергу, що призводить до моделі нейродегенерації та поведінкових порушень, які відповідають тим, що спостерігаються в клінічних популяціях.

Сучасні трансгенні моделі повторюють лише деякі з цих ознак і, як наслідок, виявилися малопрогностичними для оцінки ефективності потенційних ДМТ. Навпаки, хімічно-токсинові моделі БП досі широко використовуються завдяки їхній здатності достовірно відтворювати селективну нейродегенерацію ДА, характерну для БП.

Хіміко-токсинові моделі БП

Протягом останніх півстоліття для моделювання моделі нейродегенерації, що спостерігається при ХП, було використано широкий спектр токсичних сполук. З них чотири моделі хімічного ураження стали найбільш широко використовуваними для доклінічних досліджень, і їх ефекти були детально охарактеризовані.

До них належать 6-гідроксидопамін (6-OHDA), аналог катехоламіну; 1-метил-4-феніл1,2,3,6-тетрагідропіридин (MPTP), синтетичний аналог опіоїду; ротенон, пестицид; і паракват, гербіцид102 (табл. 2). Інша нетрансгенна модель PD базується на ін’єкції попередньо сформованих фібрил (PFF; рекомбінантні мономерні білки a-syn, перетворені у форму фібрилярного агрегату) у мозок тварин, що запускає гіперфосфорилювання ендогенних білків a-syn і викликає LB-подібну патологію в SN pars compacta (SNpc)87,88 (табл. 2).

Ці засновані на токсинах моделі можуть індукувати різним ступенем агрегацію a-syn і селективну нейродегенерацію нейронів DA в нігростріарному шляху, що є помітним недоліком аналогів трансгенної моделі.

Шляхи, залучені до запуску клітинної смерті, і ступінь втрати DA-нейронів, однак, суттєво відрізняються серед моделей, які були детально розглянуті в інших місцях.103 Зрештою, результатом втрати DA-клітин при PD є те, що рухові ядра смугастого тіла більше не можуть підтримувати свою функцію. нормальна фізіологічна функція, що спричиняє широкий спектр порушень рухових здібностей.

Однак втрата нігростріарних нейронів DA сама по собі не є моделлю хвороби Паркінсона як такої, а натомість імітує більш загальний паркінсонізм, що характеризується ширшим спектром моторних симптомів.104

До цього моменту, хоча деякі моделі на основі токсинів, включаючи PFF, хронічне введення MPTP і ротенону, можуть індукувати агрегати a-syn і LB-подібне утворення, вони відрізняються від характерних включень LB у PD і загального розподілу цих агрегатів. не відображає картину, що спостерігається в PDbrains.102

Ці моделі також обмежені у своїй здатності моделювати прогресуючий характер ХП та поширення патології на інші ділянки мозку, оскільки пацієнти з ХП також страждають від нейродегенерації в підкіркових і, зрештою, кортикальних областях на пізніх стадіях хвороби.105

Таким чином, моделі, засновані на впливі токсинів, демонструють певну схожість із патологіями, що спостерігаються при ХП; однак механізм загибелі клітин, спричинений токсинами, ймовірно, відрізняється від тих, що лежать в основі втрати нейронів при БП.106,107 Слід зазначити, що типові графіки дозування для моделей ХП з хімічними токсинами відбуваються протягом кількох днів або тижнів, тоді як перебіг БП розвивається протягом десятиліть і прогресує протягом років.

Ці обмеження свідчать про те, що моделі, засновані на впливі токсинів, спрямовані на індукування селективної смерті нейронів DA в нігростріатальному шляху, представляють неповну картину хвороби Паркінсона та дають пояснення, чому спроби виявити DMT у таких моделях не були ефективними в клінічних дослідженнях.12

Вірусні векторні моделі для PD та AD. Переваги вірусних векторних систем

Вірусні векторні системи доставки пропонують ряд переваг, яких важко досягти за допомогою інших підходів.108 По-перше, вірусні векторні системи забезпечують надійний контроль над тимчасовою експресією цікавого гена.

По-друге, старіння є основним фактором ризику розладів спектру AD-PD, і можливість доставки вектора в будь-який момент життя тварини є головною перевагою для планування дослідження. По-третє, вірусні вектори підтримують локальну доставку та експресію трансгенів, таким чином дозволяючи точне та конкретне націлювання на ділянки мозку, що цікавлять.

По-четверте, точні маніпуляції з дозуванням можна легко досягти за допомогою вірусних векторів. По-п'яте, модель, що представляє інтерес, може бути створена на багатьох видах тварин, починаючи від дрібних гризунів і закінчуючи великими нелюдськими приматами.

По-шосте, різні варіації генів можна легко зробити, щоб отримати цікавий фенотип. По-сьоме, універсальність і гнучкість різних векторних платформ, які використовуються для опосередкованого вірусами переносу генів у центральну нервову систему, величезні.

Вірусні системи, включаючи рекомбінантні аденоасоційовані вектори (БПЛА) та лентивірусні вектори (ЛВ), ефективно та надійно підтримують короткострокову або довгострокову експресію генів, відповідно, як локально, так і глобально. Нарешті, системи на основі вірусних векторів значно економічніші , як зусилля, так і вартість, порівняно з іншими моделями захворювань.

Вірусні векторні моделі AD та PD: AAV та LV

Вірусний векторний підхід для моделювання фенотипів AD і PD in vivo використовувався декількома різними групами з використанням rAAV або LV. З моменту їх першого використання на початку тисячоліття для AD було розроблено та використано різноманітні моделі на основі вірусів.

Початкові моделі AAV-тауопатії використовували AAV2/2 для експресії білка humantau P301L у мозку мишей і щурів.109,110 У цих дослідженнях вектор AAV-tau-P301L вводили в базальний передній мозок дорослих щурів, що призводило до підвищення рівня тау. протягом щонайменше 8 місяців після трансдукції. Важливо, що через 3-4 тижні після трансдукції були виявлені гіперфосфорильовані тау-агрегати, схожі на NFT.110,111

Ці дослідження дали перший доказ концепції того, що ін’єкція AAV-P301L tau може призвести до стійкої експресії білка та його агрегації у мишей і щурів.

Відповідно, ін’єкція AAV-дикого типу (WT) або потрійного мутанта APP призвела до утворення бляшок Ab, але не до явної нейродегенерації. Ці висновки контрастують із наведеними вище спостереженнями про те, що AAV-WTtau або AAV-P301L tau здатні викликати значну нейродегенерацію пірамідних нейронів HP.112

У останніх експериментах AAV2/5 використовувався для доставки WT tau та контрольного вектора GFP у дорсальний HP старих щурів Fischer 344.113 Обидва віруси сильно експресувалися в нейронах HP і призводили до аберантної аксональної структури, дегенерації аксонів і фрагментації tau в Аксони HP порівняно з контрольними аксонами, що експресують GFP, виглядають нормальними.

В іншій моделі тау P301L, експресований промотором синапсину I людини, доставлявся вектором AAV2/9 у латеральну енторинальну кору, що дозволило авторам виявити численні форми фосфорильованих і агрегованих варіантів тау до втрати синапсів перфорантного шляху та нейродегенерації.114

Ці дані підтверджують корисність підходів на основі AAV при AD, зокрема в моделюванні ранніх патологічних змін, таких як дегенерація та деградація аксонів. Кілька досліджень використовували моделі на основі вірусів, спрямовані на індукцію інших патологічних аспектів LOAD.115,116 Наприклад, AAV-BRI-Ab42 та Вектори AAV-BRI-Ab40 використовували для контрольованої експресії та секреції пептидів Ab у HP гризунів.116

Примітно, що тварини, яким вводили AAV-BRIAb42-, продемонстрували, що ці вектори здатні індукувати утворення бляшок, але цього не спостерігалося при експресії rAAV2/1-BRIAb40.

В іншому дослідженні AAV2/2 використовувався для доставки Ab40 і Ab42, C-кінцевого фрагмента АРР, що містить пептиди Ab (C100), і мутант V717F C100 до мишей HP і мозочка.

Цікаво, що мутанти Ab42 і V717F продемонстрували більшу індукцію мікрогліозу та руйнування гематоенцефалічного бар’єру (ГЕБ) порівняно з формами Ab40, але не активували утворення бляшок, індукцію астроцитів або нейродегенерацію. Використання технології AAV і LV для експресії різних форм АТ та його прекурсорів залишатиметься важливим методом вивчення їх ролі в LOAD.117

Нещодавно LV використовувався для експресії TDP-43, Ab42 або обох у моторній корі щурів, що виявило, що втрата TDP-43 вказує на те, що мікроглія є причиною синаптичної дегенерації, що спостерігається в LOAD. 118

Крім того, lenti-TDP-43 викликав зміни в процесингі АРР, пов’язаному з продукуванням Ab42, і індукував активність каспази та нейрозапалення, що подібно спостерігалося з lenti-Ab42.

Комбінована експресія як TDP-43, так і білка Ab42 призвела до результату, подібного до TDP-43 окремо, але з додатковою ознакою втрати нейронів, що свідчить про можливий синергічний ефект між двома факторами. Інше дослідження з використанням LV для експресії TDP-43 у моторній корі виявило змінений метаболізм амінокислот, окислювальний стрес і смерть нейронів.119

Ці результати разом демонструють корисність модельної системи БА на основі ЛШ для з’ясування ключових патогенних факторів, пов’язаних з білковою дисфункцією, пов’язаною з БА, тоді як АТ і тау були ретельно протестовані в LOAD, що відповідає давній думці, що АТ є ключовим підозрюваним у патогенезі АД. . Тим не менш, триваючі невдачі в випробуваннях ліків, спрямованих на зниження рівня амілоїду, вимагають переорієнтації зусиль на інших потенційних винуватців.

Кілька останніх досліджень продемонстрували, що APOEε4 може сприяти токсичності, пов’язаній з фенотипом AD, і на сьогоднішній день APOE залишається найбільш значущим і відтворюваним генетичним фактором ризику AD.120

Враховуючи роль APOEε4 у патогенезі AD та потенційний захисний ефект ізоформи ε2, Hu та його колеги121 створили мишачі моделі з використанням ізоформ AAV8-APOE, керованих промотором GFAP, який специфічно експресується в астроцитах у всіх областях мозку, що призвело до загального збільшення рівнів APOE у всьому мозку миші.

Вірусно-опосередкована гіперекспресія APOEε4 у мишей APOEε{2}}TR збільшувала кількість погано ліпідованих частинок ліпопротеїну APOE та знижувала асоційований з APOE холестерин у мишей APOEε4-TR. І навпаки, надмірна експресія APOEε2 у APOEε4-TR у мишей посилюється ліпідізація APOE і пов'язаний з ним холестерин.

Крім того, надмірна експресія APOEε4 підвищувала рівні ендогенного Ab, тоді як надмірна експресія APOEε2 мала тенденцію до зниження ендогенного Ab. На основі цих даних автори припускають, що збільшення APOEε2 у носіїв APOEε4 є корисною стратегією лікування AD, тоді як збільшення APOEε4 у носіїв APOEε4 є шкідливим. В іншому дослідженні була виконана пряма інтрацеребральна ін’єкція з використанням AAV для експресії APOEε2.

Дослідження показало, що надмірна експресія APOEε2 помітно знижує розчинні в мозку (включаючи олігомерні) і нерозчинні рівні Ab, а також амілоїдний навантаження у двох мишачих моделях амілоїдозу мозку, причому патологія залежить від експресії ізоформ APOEε4 миші або людини.122

Zhao et al.122 також показали, що широкомасштабне зниження мозкових антитіл може бути досягнуто за допомогою одноразової ін’єкції вірусу шляхом внутрішньоталамічної доставки AAV, що експресує APOEε2.

У сукупності ці дані свідчать про те, що доставка APOEε2 гена AAV за допомогою AAV може врятувати шкідливий вплив APOEε4 на амілоїдну патологію мозку; таким чином, цей підхід може представляти життєздатний терапевтичний шлях для лікування або запобігання LOAD.

For more information:1950477648nn@gmail.com