Індустрію нанотехнологій потрібно швидко розвивати в усьому світі

Будь ласка зв'яжітьсяoscar.xiao@wecistanche.comдля отримання додаткової інформації

Анотація

Наночастинки оксиду цинку (ZnO) зазвичай використовуються в косметичних товарах, навісах, біосенсорах і доставці ліків. Як ідеальні системи in vitro, мезенхімальні стовбурові клітини (МСК) використовуються для перевірки гострої токсичності. У цьому дослідженні оцінювали залежні від розміру ефекти цитотоксичності наночастинок ZnO на МСК. МСК кісткового мозку та жирової тканини обробляли НЧ ZnO із середніми розмірами 10-30 та 35-45 нм. Концентрації 5 і 10 мкг/мл ZnO NP були визнані безпечними концентраціями для розмірів NP 10-30 і 35-45 нм відповідно.переваги cistancheАналіз клітинного циклу показав, що малий розмір наночастинок ZnO має більш негативний вплив на процес входження клітини до синтезу ДНК порівняно з більшим розміром. Результати β-галактозидазного тесту показали стимулювання старіння Forocess у клітинах, оброблених меншими розмірами ZnO NP. Було виявлено, що обидва розміри NP посилюють регуляцію пов’язаних зі старінням генів NF-kB і p53 і знижують регуляцію гена Nanog, що запобігає старінню. Підсумовуючи, менший розмір наночастинок ZnO може посилити процес старіння в клітинах.

Натисніть тут, щоб дізнатися більше

1. Введення

В останнє десятиліття галузь нанотехнологій потребує швидкого розвитку в усьому світі. Наночастинки оксиду цинку (ZnO) зазвичай використовуються в косметичних засобах, навісах, біосенсорах, доставці ліків, біозображенні, а також як протигрибкові та антибактеріальні засоби [1-5]. Наноструктури ZnO мають декілька чудових властивостей, а також стабільність сполуки, великий діапазон питомої поверхні, високу електронну відповідність і активність електросполуки [6]. НЧ ZnO здебільшого використовуються як додаткова речовина, що розсіює ультрафіолетове світло, у косметичних продуктах, таких як сонцезахисні креми, зубна паста та косметичні продукти [7, 8]. З широким застосуванням наноструктурованих речовин для комерційних товарів, біобезпека цих матеріалів була розглянута для вивчення природних і токсикологічних ефектів аномального та негайного прояву цих речовин [9]. Завдяки своїм активним формам кисню (АФК) і нерозчинним іонам металів наноматеріали, такі як ZnO, мають токсичний вплив на клітини [10,11].цистанний холестеринОскільки токсичність НЧ ZnO вища в надчистій воді, ніж у фосфатно-сольовому буфері (PBS) у різних водних середовищах, токсичність НЧ ZnO здебільшого відповідає вільним іонам цинку [12]. У той час як комплекс цинку NP із середовищем викликає меншу токсичність, концентрація іонів Zn2 плюс значно знижується. Утворені Zn2 плюс нерозчинні НЧ ZnO викликають некроз і запалення [13]. Міжклітинні АФК, спричинені НЧ ZnO, індукують загибель клітин і дисфункцію мітохондріального окисного фосфорилювання [10].

Cistanche може омолоджувати старіння

Кілька експериментів in vivo показали шкідливий вплив наночастинок Zn на різні форми життя, такі як дрозофіли [14], риби [15], бокоплави [16], миші [17], щури [18] і бактерії [19]. Повідомлялося також про токсичність Zn in vitro [20-22]. Незважаючи на багато прихованої токсичності, пов’язаної з наночастинками ZnO, вони широко використовуються в різних біомедичних і фармацевтичних цілях [23]. Отже, необхідні подальші дослідження для оцінки токсичного впливу цієї сполуки на клітини. У токсикологічних дослідженнях МСК використовуються як ідеальне моделювання in vivo [24]. Виділення та розширення МСК у культурі легко, а їх диференціація здійснюється шляхом належної стимуляції. Мезенхімальні стовбурові клітини кісткового мозку (КМСК) виявляють чутливість до тестів на цитотоксичність ліків від раку та деяких інших цитотоксичних препаратів [25]. Більше того, мезенхімальні стовбурові клітини жирової тканини (AMSC) використовуються для оцінки безпеки ліків і для виявлення ліків [26]. Таким чином, у цьому дослідженні ми припустили, що AMSC і BMSC, націлені на наночастинки ZnO, можуть бути придатними для розгляду потенційних ризиків розвитку старіння. Для оцінки клітинної токсичності дуже важливим є аналіз експресії генів, фактора, який відіграє роль у ранніх токсичних процесах [26]. Таким чином, як специфічний маркер стовбурової клітини, ген Nanog був використаний у цьому дослідженні для передбачення токсичності. Nanog виконує дві функції в диференціації стовбурових клітин і самовідновленні [27]. Крім того, ген Nanog стимулює пригнічення старіння шляхом зниження експресії гена p27KIPI [28].Cistanche deserticola побічні ефектиУ класичній відповіді на генотоксичність, щоб обмежити проліферацію клітин, p53 у пошкоджених геномах викликає зупинку клітинного циклу та загибель клітин. Численні дослідження підкреслюють роль каркаса NF-kB в активації стимулюючих змін у тканинах під час старіння [29]. Тому в цьому дослідженні розглядалися аналіз клітинного циклу, аналіз галактозидази in situ та рівні мРНК генів NF-kB, p53 і Nanog.

2 Матеріали та методи

2.1 Властивості та характеристика наночастинок

Було придбано два різних розміри наночастинок ZnO (Sigma Aldrich, США) із такою інформацією: один із середнім розміром 10-30 нм, чистотою 99 відсотків, щільністю 5,606 г/см³ та приблизно 20-60 м2/ г площі поверхні, а інший має середній розмір 35-45 нм,＋99 відсотків чистоти, 5,606 г/см³ щільності та близько 65 м-/г площі поверхні (рис. 1). Потім 100 мкг/мл суспензії наночастиц ZnO в 1 мл PBS готували обробкою ультразвуком протягом 3 хв.

2.2 Виділення мезенхімальних стовбурових клітин

BMSC були відібрані у {{0}}тижневих (200-250 г) самців щурів. Видаляли епіфізи, проводили доступ до кістковомозкових порожнин і видаляли пробки загального кісткового мозку (КМ) із великогомілкової та стегнової кісток за допомогою шприца об’ємом 10 мл, що містив модифіковане середовище Ігла за Дульбекко (DMEM) (Laboratories Inc., Массачусетс, США) плюс 10 відсоток фетальної сироватки великої рогатої худоби (FBS). Зразки BM були зібрані та точно засмучені послідовними голками 18 та 20 калібру, доданими до аналогічного шприца на 10 мл. Потім клітинну суспензію центрифугували протягом 5 хв при 1000 об/хв. Після осадження клітини їх ресуспендували в середовищі з 10% FBS. Щоб відтворити лічильник підрахунку клітин, 4% оцтової кислоти змішали з невеликою кількістю суспензії для лізису еритроцитів. Підрахунок клітин проводили гемоцитометром. Згодом клітини розміром 5 × 10 футів поміщали в 100-мм чашку для культур, зберігали в 5-відсотковому CO2 при 37 градусах і змінювали свіжим середовищем кожні 3-4 днів [30]. Використовуючи колагеназу типу I (0,15 відсотка ваги до об’єму) протягом 1 години при 37 градусах, потім ферментативно відділяли жирову тканину. Для видалення недисоційованих частинок суспензію фільтрували за допомогою фільтра 70-um. Потім додавали DMEM з 10% (об./об.) FBS і центрифугували при 700×g протягом 5 хв. Нарешті, осад клітини ресуспендували в DMEM з 1 відсотком (об’єм/об’єм) пеніциліну/стрептоміцину та 10 відсотками (об’єм/об’єм) FBS [31].

2.3 Культура клітин

AMSC і BMSC культивували в DMEM (Laboratories Inc., Массачусетс, США) з 1 відсотком антибіотиків і 10 відсотками FBS у стандартних умовах культивування (при 37 градусах, у 5 відсотках CO2 і 95 відсотках вологості)[32].

2.4 Характеристика поверхневих маркерів BMSC та AMSCS

BMSC і AMSC збирали протягом 5 хвилин при 37 градусах, висівали на чашки центрифугуванням 200×g протягом 5 хвилин і промивали охолодженим PBS. Потім 5 мкл антитіл, кон’югованих із флуоресцеїн ізотіоціанатом (FITC), включаючи CD34-PE, CD90-FITC, CD45-FITC і CD73-FITC (Thermo Fisher Scientific, Німеччина), додавали до BMSC і AMSC, а потім зберігали при кімнатній температурі (RT) і темному місці протягом 20 хвилин. Зразки оцінювали за допомогою проточного цитометра (BD FACS Caliber; Сан-Хосе, Каліфорнія, США) [33, 34].

2.5 Цитотоксичність in vitro

Для тестування на цитотоксичність NPS BMSC і AMSC культивували в {{0}}планшетах з лунками зі злиттям 70-80 відсотків, усі частинки суспендували в повному DMEM (10 відсотків розбавлених NP з 90 відсотками DMEM, що містить PBS) [35]. Обробку ультразвуком проводили двічі, кожного разу протягом 5 хвилин, щоб ретельно змішати кінцеві концентрації наночастинок ZnO. Тому BMSC та AMSC обробляли різними концентраціями (0,3,5,10,25 та 50 мкг/мл) наночастинок ZnO протягом 24, 48 та 72 годин. Потім використовували МТТ-аналіз для перевірки життєздатності оброблених клітин.cistanche дозування redditПриготування основного розчину МТТ ((3-(4,5-диміниш етилтіазол-2-іл)- 2,5-дифенілтетразолію бромід) проводили шляхом додавання 1 мл PBS до 5 мг МТТ (Sigma, США) у темному місці.Потім 20 мкл вихідного розчину змішували з усіма експериментальними лунками (контрольні клітини та наночастинки ZnO, оброблені різними концентраціями), вібрували протягом 10 хв та інкубували при 37° протягом 3 год. Зрештою, зразки були витягнуті з інкубатора та змішані з DMSO, з фіолетовим кольором, помітним на цій стадії.Вони були виявлені за допомогою піпетування та негайно зчитані в присутності УФ при 570 нм.

2.6 Аналіз клітинного циклу

BMSC і AMSC були висіяні в різні 6-лункові планшети. Хоча спостерігалося 70-відсоткове злиття клітин, безпечні концентрації наночастинок ZnO (отримано 5 і 10 мкг/мл у менших і більших розмірах наночастинок ZnO відповідно) обробляли клітини для аналізу MTT та інкубували протягом 72 годин при 37 градусах (5 відсотків) CO2). Середовище видаляли з конфокального диска через 72 години, двічі промивали PBS і центрифугували. Клітини фіксували за допомогою етанолу (70 відсотків) при 4 градусах протягом 2 днів. Потім інкубовані клітини знову промивали PBS і злегка струшували, після чого середовище повністю видаляли з конфокального диска. Потім додавали 10 мкл РНКази та інкубували протягом 45 хв. Для фарбування клітини суспендували в 10 мкл розчину йодиду пропідію (Sigma, США). Для оцінки ДНК клітин використовували проточний цитометр [36].

2.7 Тест галактозидази in situ для клітинного старіння

Активність пов’язаної зі старінням галактозидази (SA-gal), як загального біомаркера для аналізу старіння в клітинах, оцінювали за допомогою набору для фарбування SA- -gal (Thermo Fisher Scientific, Німеччина) так само, як і в попередніх дослідженнях [37]. Клітини висівали в 24-лункові планшети та обробляли двома різними розмірами наночастинок ZnO з безпечними концентраціями. Далі їх промивали PBS, фіксували у суміші G/F фіксатора (20 відсотків глутарового альдегіду + 37 відсотків формальдиду) та інкубували при кімнатній температурі протягом 3-5 хв. Потім клітини фарбували у свіжому розчині для фарбування (10 мл цитрату Na плюс 250 мкл фероціаніду калію + 250 мкл фероціаніду калію + 100 мкл MgCl + 250 мкл NaCl + 200 мкл X-gal) протягом 2 годин у темному місці при 37 градусах. SA- -gal-позитивні клітини демонстрували зелений колір візуалізували за допомогою інвертованого світлового мікроскопа.

2.8 ПЛР у реальному часі

BMSC і AMSC з двома різними розмірами ZnO NPs були оброблені в оптимальних концентраціях 5 і 10 мкг/мл відповідно. Їх збирали через 48 годин і використовували набір для екстракції РНК (Bio Basic INC) для виділення загальної РНК. Перший ланцюг кДНК був синтезований шляхом зворотної транскрипції за допомогою набору SYBR Green qPCR MasterMix 2X, SYBR degree Premix Ex TaqIM (TaKaRa, Японія). Потім якість і кількість синтезованої кДНК оцінювали на спектрофотометрі NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, Німеччина).переваги екстракту цистанчіПотім 2 мкл кДНК використовували для ампліфікації цільового гена. Специфічні праймери були розроблені за допомогою програмного забезпечення Primer 3 і використані для ампліфікації експресії генів p53, NF-kB і Nanog (General Biotech, Корея). Послідовність праймерів представлена ​​в таблиці 1.

Рівні експресії були нормалізовані до рівня експресії гена GAPDH як домашнього гена. Для проведення ПЛР у реальному часі використовували перший цикл при 95 градусах протягом 3 хвилин і 40 циклів при 95 градусах протягом 20 секунд, при 60 градусах протягом 20 секунд і при 72 градусах протягом 30 секунд.

2.9 Статистичний аналіз

Усі тести проводили в трьох повторах, і результати відображалися як середнє ± стандартне відхилення (SD). Дані були введені в програмне забезпечення SPSS (IBM Corp., Нью-Йорк, США) і проаналізовані за допомогою двостороннього дисперсійного аналізу (ANOVA).

3 Результати

3.1 Аналіз мезенхімальних стовбурових клітин методом проточної цитометрії

Мезенхімальні стовбурові клітини щурів були виділені з двох джерел, включаючи жирову тканину та BM. Було перевірено поверхневі CD-маркери MSC, і більшість AMSC або BMSC (98,18 і 99,62 відсотка) були виявлені для CD90 як позитивного поверхневого маркера в MSC (рис. 2A, B). Крім того, 94,80 і 99,76% CD73 в AMSCs або BMSCs були точно пофарбовані відповідно (рис. 2A, B). Крім того, невеликий відсоток BMSCs або AMSCs продемонстрував експресію CD45 (0.18 або 0,56 відсотка) і CD34 (0,71 або 12,65 відсотка) в AMSC або BMSCs, відповідно, які є маркерами гемопоетичних ліній (рис. .2A, B). Ці молекулярні профілі демонструють надзвичайні властивості BMSC і AMSC. Крім того, вони схвалюють якісне видалення гемопоетичних клітин і виділення мезенхімальних стовбурових клітин з жирової тканини та КМ під час виділення стромальних клітин.

3.2 Цитотоксичність in vitro

Колориметричний тест цитотоксичності на основі МТТ був застосований для дослідження життєздатності BMSC або AMSC після їх обробки 10-30 і 35-45 nm ZnO NPs протягом 1, 2 і 3 днів (рис. 3). Згідно з даними, показаними на рис. 2, вплив двох різних розмірів наночастинок ZnO на BMSC або AMSC залежав від дози та часу. У дозах 5 і 10 мкг/мл 10-30 і 35-45 нм ZnO NPs показали хорошу життєздатність для AMSCs і BMSCs, відповідно (рис. 3). Крім того, життєздатність AMSC і BMSC з 35-45 нм ZnO NPs була знижена залежно від дози та часу при тих самих концентраціях (рис. 3).

3.3 Аналіз клітинного циклу

Вплив наночастинок ZnO на розподіл BMSC і AMSC у клітинному циклі вивчали за допомогою фарбування йодидом пропідію та вимірювали за допомогою проточної цитометрії. Як показано на рис. 4, AMSC та BMSC, оброблені 10-30nm ZnO NPs

вказали, що співвідношення клітин, які вступають у фазу GO/Gl, зросло (82,2 і 82.01 відсоток) порівняно з контрольною групою (81,92 і 78,76 відсотка відповідно). Коли сигнали, що керують проліферацією, зазнають апоптозу або відсутні, клітини мають тенденцію до збільшення G0/G1 [38].

Більше того, у AMSC та BMSC, оброблених 10-30nm ZnO NPs, фаза G2/M зменшилася (7,38 та 9,98 відсотка сприйнятливо) порівняно з контрольною групою (10,04 та 13,47 відсотка), що вказує на те, що клітини були зупинені за S-клітинного циклу та фази G2/M і не активно проліферували (рис.4). Проте аналіз клітинного циклу 35-45 nm ZnO NPs показав підвищене накопичення клітин фази G2/M в AMSC та BMSC (14,19 та 16,18 відсотка, сприйнятливо) порівняно з контрольною групою G2/M (10,04 та 13,47). відсотків), що свідчить про уповільнення процесу клітинного циклу (рис. 4). Коли ДНК пошкоджено, контрольна точка G2 пригнічує мітоз клітин і забезпечує проліферацію безпомилкових дублікатів геному в кожній дочірній клітині.

3.4 Дослідження галактозидази in situ

Активність ферменту бета-галактозидази використовувалася в цій роботі для перевірки впливу 10-30 і 35-45 nm ZnO NP на старіння BMSCs і AMSCs. Наші результати показали, що клітинні ділянки з позитивним зеленим фарбуванням спостерігалися частіше в групі, обробленій ZnO NP, в обох типах стовбурових клітин щурів порівняно з контрольною групою (рис. 5A, B).

У нормальних клітинах кислі лізосомальні галактозидази вироблялися та збиралися в лізосомах, як це спостерігалося в контрольних групах. Але в старіючих клітинах лізосоми збільшувалися і виробляли верхній рівень -галактозидази, яка називається пов'язаною зі старінням -галактозидазою (SA- -gal), як виявлено в клітинах, оброблених наночастицями ZnO (рис. 5). Позитивні клітини SA-gal були пофарбовані в синьо-зелений колір під мікроскопом у світлому полі. Обидві оброблені клітини були позитивними порівняно з контрольними групами. Найбільше синьо-зелене забарвлення було отримано в АМСК із 10-30нм НЧ ZnO (рис. 5А).

3.5 ПЛР у реальному часі

Відносну експресію генів NF-kB, P53 і Nanog оцінювали відносно GAPDH як гена господарювання як на BMSC, так і на AMSC, які зазнали впливу 5 і 10 мкг/мл наночастиц ZnO в 10-30 і 35-45 нм розмірів відповідно через 48 год. Результати експресії генів Nanog у клітинах, оброблених НЧ ZnO 10-30 та 35-45 нм, показали достовірну (P<0.01)lower regulation="" in="" the="" amscs="" (fig.6a)="" and="" bmscs="" in="" comparison="" with="" the="" control="" group="" (fig.="">

Клітини, оброблені 10-30nm ZnO NP, продемонстрували нижчу експресію гена Nanog порівняно з клітинами, обробленими

4 Обговорення

У цьому дослідженні оцінювався токсичний вплив двох розмірів наночастинок ZnO на BMSC і AMSC: 10-30nm як менший розмір і 35-45nm як більший розмір. Результати показали, що менший розмір наночастинок ZnO мав більший токсичний ефект, ніж більший розмір. Зона поверхні та розмір частинок НЧ є значущими якостями матеріалу з токсикологічної точки зору. У міру того, як розмір частинки зменшується, її поверхнева область піднімається і дозволяє більшій мірі частинок або атомів бути показано поверхнево, на відміну від внутрішньої сторони матеріалу [39].

Наноматеріали розміром менше 50 нм демонструють унікальні фізико-хімічні властивості через їх невеликий розмір, високу область поверхні, низьку вартість, покращену реакційну здатність і легке проникнення в клітинні дільники [40-42]. Згідно з результатами нашого аналізу МТТ, оптимальні та безпечні концентрації досліджуваних менших та більших розмірів НЧ ZnO становили 5 та 10 мкг/мл відповідно у порівнянні з контрольними групами. Наш аналіз клітинного циклу показав, що безпечні концентрації наночастинок ZnO розміром 10-30 нм мають токсичний вплив на AMSC, зменшуючи кількість клітин у фазах S та GO/G1, що вказує на зупинку процесу клітинного циклу та втрату сигналів проліферації драйву. НЧ ZnO розміром 35-45 нм зменшували кількість клітин у фазах G2/M та S, що призводило до уповільнення процесу клітинного циклу.

Результати нашого дослідження збігаються з результатами інших досліджень, які показали, що НЧ можуть призводити до загибелі клітини шляхом пошкодження ДНК або органел [43, 44]. Хоча є обмежені токсикологічні звіти про вплив наночастинок ZnO, є кілька звітів про цитотоксичну дію наночастинок ZnO in vitro [45-47]. Дослідження показало, що окислювальний стрес активувався в клітинах TR146 з концентрацією NP ZnO 10 мкг/мл [48] і в клітинах SH-SY5Y з концентрацією 15 мкг/мл [49]. Прозапальний цитокін, що вивільняється в клітинах THP-1 із 17,69 мкг/мл наночастинок ZnO 【20】. Пошкодження ДНК також було спричинено при концентрації 6,4 мкг/мл НЧ ZnO у клітинах карциноми товстої кишки людини [50] та при концентрації 12,5 мкг/мл в епітеліальних клітинах нирок щурів [51]. Контакту з наноматеріалами не уникнути, оскільки вони стають частиною нашого повсякденного життя; відповідно, враховується токсичність досліджень наноматеріалів [52]. Рисунок 9 ілюструє взаємодію НЧ ZnO в клітині ссавців. Визначення старіючих клітин показало підвищення рівня активності лізосомальної -галактозидази [53]. Результати нашого тесту SA- -gal показали, що наночастинки ZnO як меншого, так і більшого розміру (10-30 і 35-45 нм) стимулюють клітини виробляти лізосому. Однак високий синьо-зелений колір був викликаний високими рівнями лізосом у клітинах, які піддалися впливу 10-30 нм НЧ ZnO порівняно з контрольною групою.

P53 працює як досконалий показник тривалості життя завдяки своїй сильній активності глушника пухлин і контролеру старіння [54]. p53 може зменшувати та збільшувати окислювальний стрес, можливо, через його подвійний вплив на старіння. Наші результати ПЛР у реальному часі вказують на значно підвищену експресію генів p53 і NF-kB у клітинах, які зазнали впливу НЧ ZnO обох розмірів. Однак найвища надекспресія цих генів була виявлена ​​в клітинах, оброблених наночастинками меншого розміру (10-30 нм). Крім того, рівень мРНК гена Nanog вважався геном антистаріння. Для гена Nanog результати нашого дослідження показали значне зниження регуляції обох досліджуваних розмірів ZnO NP в обох оброблених клітинах. Однак найнижче зниження регуляції розміру 10-30 нм вказує на те, що наночастинки ZnO можуть бути більш токсичними в меншому розмірі, ніж у більшому розмірі (35-45 нм).

5 Висновок

НЧ ZnO (10-30 і 35-45 нм) спонукають клітини до процесу старіння. Менший розмір наночастинок ZnO має більш токсичний вплив на синтез ДНК, ніж більший розмір. Найвище фарбування -галактозидазою спостерігалося в НЧ ZnO меншого розміру, ніж більшого розміру. Крім того, значна надмірна експресія пов’язаних зі старінням генів (NF-kB і p53) була отримана в клітинах ZnO NP, оброблених обома розмірами. Крім того, значне зниження регуляції гена, пов’язаного зі старінням (Nanog), було отримано в клітинах, оброблених наночастицями ZnO.

Цю статтю взято з Journal of Materials Science: Materials in Medicine (2021) 32:128https://doi.org/10.1007/s10856-021-06602-x