Синергетичний імунітет і захист у мишей шляхом спільної імунізації з ДНК-вакцинами, що кодують спайковий білок та інші структурні білки SARS-CoV-2

Анотація:Поява нових варіантів коронавірусу 2 важкого гострого респіраторного синдрому (SARS CoV-2) спричинила повторювані спалахи інфекції у всьому світі. Ці сильно мутовані варіанти знижують ефективність поточних вакцин проти коронавірусної хвороби 2019 (COVID-19), які спрямовані лише на спайковий білок (S) вихідного вірусу. За винятком S SARS-CoV-2, імунозахисний потенціал інших структурних білків (нуклеокапсид, N; оболонка, E; мембрана, M) як цільових антигенів вакцини все ще неясний і заслуговує на дослідження. У цьому дослідженні були розроблені синтетичні ДНК-вакцини, що кодують чотири структурні білки SARS-CoV-2 (pS, pN, pE та pM), і мишей імунізували трьома дозами за допомогою внутрішньом’язової ін’єкції та електропорації. Примітно, що спільна імунізація двома ДНК-вакцинами, які експресують білки S і N, індукувала більшу кількість нейтралізуючих антитіл і була більш ефективною для зниження вірусного навантаження SARS-CoV-2, ніж S білок окремо у мишей. Крім того, ко-імунізація pS з pN або pE + pM індукувала вищий S-протеїн-специфічний клітинний імунітет після трьох імунізацій і спричиняла більш м’які гістопатологічні зміни, ніж pS окремо після зараження. Роль консервативних структурних білків SARS-CoV-2, включно з білками N/E/M, слід додатково досліджувати для їх застосування в дизайні вакцин, таких як мРНК-вакцини.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Ключові слова: COVID-19; SARS-CoV-2}}; коімунізація; ДНК-вакцина; шиповий білок; структурний білок

1. Введення

Коронавірус 2 із важким гострим респіраторним синдромом (SARS-CoV-2) є причиною коронавірусної хвороби 2019 (COVID-19), яка спричинила мільйони інфекцій і смертей у всьому світі та поставила під загрозу здоров’я людей і світову економіку . Хоча ефективні терапевтичні підходи все ще недоступні, вони швидко розвиваються, включаючи застосування клітинної терапії CAR-T та нанотехнологій [1,2]. Вакцинація є ефективним способом боротьби з пандемією, і кілька вакцин були схвалені для використання різними регулюючими органами охорони здоров’я [3,4]. Геном коронавірусу кодує чотири основні структурні білки, а саме спайк (S), нуклеокапсид (N), мембрану (M) і оболонку (E), які відповідають за збірку віріону та пригнічення імунної відповіді господаря [5]. ]. Білок S складається з 1273 амінокислотних залишків, що містять дві субодиниці, а саме S1 і S2. Він опосередковує проникнення вірусу та є основною мішенню для розробки вакцин проти коронавірусу [6–11]. Проте білок SARS-CoV-2 S має високу частоту мутацій. Не дивно, що у SARS-CoV-2, РНК-вірусу, мутація безперервна й неминуча. З вересня 2020 року з’явилося п’ять викликаючих занепокоєння варіантів SARS-CoV-2 (VOC), у тому числі B.1.1.7 (Великобританія, альфа), B.1.351 (Південна Африка, бета), P.1 (Бразилія, Гамма), B.1.617.2 (Індія, Дельта) і B.1.1.529 (Південна Африка, Омікрон) (Андреано та Раппуолі, 2021; Гупта, 2021). Усі вони мають декілька мутацій у спайковому білку [12]. Ці варіанти загрожують ефективності поточних вакцин проти COVID-19, які спрямовані лише на спайковий білок.

Білок N SARS-CoV-2 зв’язується з вірусною РНК через 140-домен РНК-зв’язування довжиною амінокислоти в їх ядрі у спосіб «намистинки на нитці». Він дуже консервативний серед коронавірусів, поділяючи приблизно 90% послідовності з послідовністю SARS-CoV, і це також єдиний структурний білок у віріоні [13]. Крім того, він відіграє важливу роль у упаковці вірусної РНК у рибонуклеокапсидний комплекс і необхідний для реплікації вірусної РНК, складання віріону та вивільнення з клітин-господарів [14]. Виходячи з високої подібності послідовності білка N у коронавірусах, його можна запропонувати як мішень вакцини для перехресного захисту. Раніше ми виявили, що коімунізація двома ДНК-вакцинами, що експресують білки E та M, забезпечує частковий захист від SARS-CoV-2, і цей метод слід враховувати під час розробки вакцини [15]. Залежно від ландшафтного документа ВООЗ зазвичай існує сім стратегій для вакцин-кандидатів проти SARS-CoV-2, які можна далі розділити на три категорії: по-перше, білкові вакцини, включаючи інактивовані вірусні вакцини, вірусоподібні частинки та білкові субодиничні вакцини; по-друге, вакцини на основі генів, включаючи вакцини з вірусним вектором, ДНК-вакцини та мРНК-вакцини; по-третє, поєднання як білкових, так і генних підходів, таких як живі аттенуйовані вірусні вакцини. Технології ДНК, як нові стратегії вакцин, засновані на генах, можуть швидко порівнювати численні вакцини-кандидати та стратегії під час доклінічного тестування [16,17]. Теоретично майже всі вірусні білки є потенційними імуногенами та мішенями для вакцин. Однак, наскільки нам відомо, імуногенність і захисний потенціал синтетичних ДНК-вакцин щодо кодування білків SARS-CoV-2 S та інших структурних білків ще не опубліковано систематично. Чотири ДНК-вакцини, що експресують білки SARS-CoV-2 S, N, E та Ml, були оцінені на предмет їх імуногенності та захисної ефективності на мишах, щоб дослідити імунологічні ефекти S у поєднанні з іншими структурними білками.

2. Матеріали та методи

2.1. Клітини

Клітини Huh7.5 і клітини людської ембріональної нирки 293T культивували при 37 ◦C у зволоженій атмосфері при 5% CO2 протягом усього дослідження. Клітини культивували в середовищі DMEM (HyClone, Logan, UT, США), доповненому 10% FBS (GEMINI Co., Шанхай, Китай) і 1% пеніцилін-стрептоміцину (Gibco, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США). Усі клітинні лінії були підтверджені негативними щодо зараження мікоплазмою.

2.2. Конструювання ДНК-вакцин, що кодують SARS-CoV-2 S/N/E/M

Ген, що кодує білок SARS-CoV-2 S/N, містить N-кінцеву послідовність Козака (GCCACC), за якою слідує кодон ініціації (ATG), був синтезований за допомогою кодону, оптимізованого для ссавців (GenScript Co., Nanjing). , Китай). Потім його клонували у вектор експресії pcDNA3.1 (+) за допомогою розщеплення EcoRI та XbaI і назвали pS/pN (ДНК-вакцини) (рис. 1A). Білок pE/PM був сконструйований та ідентифікований, як описано раніше [15]. Вакцини були виготовлені з використанням наборів Maxiprep без ендотоксинів (Qiagen, Пекін, Китай), а послідовності були підтверджені за допомогою секвенування ДНК Sanger. Експресію білка S/N було підтверджено за допомогою вестерн-блоттингу та анти-S (Sino Biological, Пекін, Китай)/анти-N антитіл, розведених у співвідношенні 1:1000. Ці експерименти були проведені, як описано раніше [15,18].

Рисунок 1. Дизайн і експресія білкових вакцинних конструкцій проти SARS-CoV-2 S/N на основі рекомбінантної ДНК. (A) Схематична діаграма вакцин на основі рекомбінантної ДНК, що кодують спайкові (PS), нуклеокапсидні (pN), оболонкові (pE) та/або мембранні (PM) білки SARS-CoV-2. (B) Експресію цільового білка в ДНК-вакцинах підтверджено за допомогою вестерн-блот-аналізу клітин 293T, трансфікованих плазмідами pS/pN/pE/pM.

2.3. Імунізація та виклик

Самок мишей BALB/c (Charles River Laboratories, Франція) у віці 6 тижнів містили в Національному інституті гігієни праці та контролю за отруєннями в середовищі з контрольованою вологістю 21 ◦C з 12-годинними циклами світла/темряви. Тим часом їжу та воду надавали ad libitum, і всі експерименти на тваринах були схвалені Комітетом з етики експериментів на тваринах Китайського центру контролю та профілактики захворювань (China CDC). Дослідження відповідало відповідним етичним нормам.

Мишей розділили випадковим чином на п’ять груп і імунізували лише pS/pN або спільно імунізували pS + pN або pS + pE + PM у дні 0, 21 і 42 за допомогою внутрішньом’язової ін’єкції та електропорації (35 мг/50 мл) (Малюнок 2) [19,20]. Коротко кажучи, ДНК-вакцини вводили в передній великогомілковий м’яз (TA) і негайно запускали електрику за допомогою двоголкового електрода (ECM830; BTX) з голками на відстані 5 мм один від одного. Сироватки мишей збирали для аналізу гуморальної імунної відповіді, а селезінки мишей обробляли для вимірювання клітинної імунної відповіді (рис. 2).

Рисунок 2. Схема імунізації та виклику SARS-CoV-2. Тривалість вакцинації, виклик і взяття крові/тканини. Мишей BALB/C розподіляли випадковим чином на групи.

Експерименти із зараженням SARS-CoV-2 проводилися, як описано раніше [15,21]. Коротко, мишей анестезували, а потім інтраназально трансдукували 2,5 × 108 PFU Ad5-hACE2 у загальному об’ємі 45 мкл. Через п’ять днів після трансдукції мишей анестезували, а потім інтраназально заражали 1 × 105 TCID50 SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC HB-02/2019) у загальному об’ємі 50 мкл фізіологічного розчину. буфер. Усю роботу з живим SARS-CoV-2 на моделях мишей проводили в лабораторіях рівня біобезпеки тварин 3 (ABSL{22}}).

2.4. Імуноферментний аналіз

Імуноферментні аналізи (ELISA) проводили, як описано раніше [15]. Коротко, білки S (придбані в Sino Biological)/N (подарунок від Song), розведені в карбонатному буфері (0.1 М, рН 9,6), наносили на 96-лункові планшети EIA/RIA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) протягом ночі при 4 ◦C. Планшети блокували 200 мкл 10% козячої сироватки в PBS при 37 ◦C протягом 2 годин, після чого п'ять разів промивали PBST. Потім додавали зразки сироватки, серійно розведені в 2% козячої сироватки в PBS, та інкубували протягом 2 годин при 37 ◦C, після чого проводили п’ять промивань PBST. HRP-кон’юговані козячі антимишачі антитела IgG (1:5000) додавали при 37 ◦C протягом 1 години. Загалом 100 мкл субстрату ТМБ додавали до кожної лунки та гасили 50 мкл 2М ​​H2SO4. Поглинання зчитували на довжині хвилі 450 нм за допомогою SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE, Гонконг, Китай).

цистанхе рослина, що підвищує імунну систему

Натисніть тут, щоб переглянути продукти Cistanche Enhance Imunity

【Запитуйте більше】 Електронна пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Експерименти з псевдовірусної інфекції та нейтралізації

Аналіз нейтралізації псевдовірусу проводили, як описано раніше [21,22]. Раніше була сконструйована плазміда, що експресує білок S предкового вірусу [22]. Синтезовано ген спайкового білка варіанту Omicron SARS-CoV-2 (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) (подарунок від Vazyme Biotech Co., Ltd., Нанкін, Китай) використовуючи оптимізований для ссавців кодон і клонований у вектор pcDNA3.1, як описано раніше [22]. Коротко, плазміди, що експресують репортер люциферази, і плазміди, що експресують білок S, були спільно трансфіковані в клітини HEK 293T за допомогою X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent. Культуру клітин оновлювали через 6 годин після трансфекції, а супернатант, що містить псевдовірус, збирали через 48 годин і зберігали при -70 ◦C. У аналізі нейтралізації псевдовірусу рівну суміш сироватки та вірусу потім інкубували при 37 об’ємах супернатанту, що містить псевдовірус, а потім додавали до розведеної сироватки. ◦C протягом 1 год. Культуральне середовище клітин Huh7.5 потім замінювали 100 мкл сироватково-вірусної суміші та інкубували при 37 ◦C протягом 12 годин. Клітини, культивовані лише з псевдовірусами SARS-CoV-2, досліджували паралельно. Потім середовище замінювали на DMEM (2% FBS), і інкубацію інкубували при 37 ◦C протягом 48 годин. Потім сигнал люциферази вимірювали за допомогою набору люциферази світлячка Bright-Glo (Promega).

2.6. Аналіз нейтралізації SARS-CoV-2

У цьому експерименті використовувався SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC-HB-02/2019). Коротко кажучи, сироватки розводили вдвічі з початкового розведення 1:10, змішували з рівним об’ємом (10–15 pfu/лунку) живого SARS-CoV-2 та інкубували протягом 1 години при 37 ◦C, після чого їх додавали до засіяних клітин Vero. Після інкубації при 37 ◦C протягом 48 годин спостерігався цитопатичний ефект (CPE), і 100 мкл супернатанту культури збирали для екстракції нуклеїнової кислоти та ПЛР зі зворотною транскрипцією флуоресценції в реальному часі (RT-PCR). Середню нейтралізуючу дозу (ND50) розраховували за методом Ріда–Мунка [15].

2.7. IFN-ELISpot аналіз

Пептидні пули, що охоплюють весь білок S/N/E/M як послідовні 15-мери, що перекриваються 10 амінокислотами, були синтезовані компанією Scilight Biotechnology, LLC. Приблизно 2,5 мг кожного очищеного пептиду в пептидному пулі було присутнє на флакон. Експеримент проводили, як описано раніше [18]. Коротко, планшети з 96-лунками (набір BD ELISPOT, США) покривали антителами проти захоплення ІФН та інкубували протягом ночі при 4 ◦C. Планшети блокували повним культуральним середовищем після триразового промивання. Спленоцити збирали після евтаназії мишей на 35-й день і 120 свіжих одноклітинних суспензій з кожної групи поміщали в планшети 5 × 106 на лунку та додавали пептиди. Потім планшети інкубували при 37 ◦C у 5% CO2 протягом 22 годин і виявляли за допомогою пристрою для зчитування планшетів ELISpot (Biosys, So. Pasadena, CA, USA). Точково-утворююча одиниця (SFU) являє собою IFN-, що секретує Т-клітини.

2.8. Оцінка захисту мишей після зараження SARS-CoV-2

Експерименти проводили, як описано раніше [15,21]. Коротше кажучи, легені були зібрані після евтаназії мишей. Половину тканин використовували для екстракції нуклеїнової кислоти, флуоресцентної RT-PCR у реальному часі та TCID50. Іншу половину відправили до коледжу ветеринарної медицини Китайського сільськогосподарського університету для патологічної оцінки.

2.9. Статистичний аналіз

Непарні t-тести, двосторонній дисперсійний аналіз і тест множинних порівнянь Даннета проводили за допомогою GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software LLC). p-значення < 0.05 вважалися статистично значущими (* p < 0.05; ** p < 0.01; * ** p < 0,001; **** p < 0,0001).

3. Результати

3.1. Характеристика ДНК-вакцин

Рівні білка E і M виявляли за допомогою вестерн-блоттингу. Ми виміряли експресію кодованих S/N/E/M білків SARS-CoV-2 у HEK-293Т-клітинах, трансфікованих плазмідами pS/pN/pE/pM, за допомогою Вестерн-блот аналізу, використовуючи анти -S/anti-N антитіла та анти-6 x His антитіло в клітинних лізатах. Смуги приблизно відповідали прогнозованій молекулярній масі білків S (140–142 кДа), N (45 кДа), E (10 кДа) і M (22–25 кДа) (рис. 1B).

3.2. Надійне та стійке виробництво анти-S та/або анти-N IgG, індуковане pS та/або pN ДНК

Вакцини. Сироватку крові збирали у мишей BALB/c через 35, 56, 96 і 120 днів (рис. 2). Рівні анти-S/anti-N IgG були виявлені за допомогою ELISA. Величина S- або N-специфічної відповіді IgG, індукованої pS або pN, була збільшена в сироватці після першого та другого стимулювання. Титри анти-S і анти-N IgG були вищими в групі pS + pN, ніж в інших групах; однак різниця не була статистично значущою (рис. 3A, B). Не було виявлено стійких відповідей антитіл, специфічних до білка E/M, що узгоджується з результатами попереднього дослідження (дані не показані) [15].

Рисунок 3. Відповіді В-клітин на SARS-CoV-2 у мишей BALB/c. (A) Титри кінцевих точок зв’язування IgG у сироватці для білків SARS-CoV-2 S (A) і N (B). (C) Титри нейтралізації були визначені на основі системи псевдотипованого вірусу SARS-CoV-2. (D) Титри нейтралізації анти-SARS-CoV-2 визначали за допомогою вірусу SARS-CoV-2. (E) Аналіз нейтралізації на основі псевдотипованої вірусної системи SARS-CoV-2 Omicron. Показано коефіцієнти інгібування для сироваток із груп імітації (синя), pS (червона), pS + pN (зелена), pS + pE + pM (рожева) і pN (помаранчева). Смуги похибок представляють SEM, а р-значення розраховували за допомогою двостороннього дисперсійного аналізу та аналізу Sidak post hoc, де * p < 0.05

3.3. Високі рівні нейтралізуючих антитіл, викликані спільною імунізацією вакцинами pS та pN

Нейтралізуючі титри серійно розведених зразків сироватки визначали за допомогою псевдотипованого вірусу SARS-CoV-2. Найвищі рівні нейтралізуючих антитіл (nAbs) спостерігалися в групі pS + pN, із зворотними середніми геометричними титрами EC50, які досягали 2988 (на 35-й день) і 3578 (на 56-й день) (рис. 3C). Подібні результати були отримані за допомогою аналізу мікронейтралізації живого вірусу (MN), де рівні nAbs у групі pS + pN були вищими, ніж у групі S на 56 і 96 дні (p < 0.05; рис. 3D). Більше того, рівні nAbs у групі pS + pN на 56-й день (друга стимуляція) були значно вищими, ніж на 35-й день (p <0,05; рис. 3D).

Нейтралізуюча активність кожної схеми вакцинації проти варіанту SARS-CoV-2 Omicron була додатково визначена за допомогою псевдотипованої платформи та зразків сироватки. Профіль нейтралізації проти вірусу Omicron на 35-й і 56-й дні був подібним до профілю предкового вірусу (малюнок 3E), що свідчить про те, що лікування PS + pN мало перехресну нейтралізуючу дію.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

3.4. Відповіді Т-клітин, викликані вакцинацією ДНК

Як описано раніше, відповіді Т-клітин проти антигенів SARS-CoV-2 S/N/E/M оцінювали за допомогою IFN-ELISpot, як описано раніше [15]. Як і очікувалося, режими PS + pN і pS + pE + pM індукували значно вищі рівні IFN + T-клітин, специфічних для білка S, на 12-й день 0, ніж на 35-й день (p < 0. 05; Малюнок 4A). Більше того, кількість IFN + Т-клітин, специфічних для білка N, на 120-й день (друга стимуляція) була значно вищою, ніж на 35-й день у групі pS + pN (p <0,05; рис. 4B). Нарешті, кількість IFN + Т-клітин, специфічних для білка М, на 120-й день (друга стимуляція) була значно вищою, ніж на 35-й день в обох групах (p <0,05; рис. 4D).

Рисунок 4. Відповіді Т-клітин на окремі структурні білки SARS-CoV-2 у мишей BALB/c. (A) Відповіді Т-клітин вимірювали за допомогою IFN-ELISpot у спленоцитах, стимульованих протягом 20 год з перекриваючими пулами пептидів, що охоплюють SARS-CoV-2 S, (B) N, (C) E, і (D) М білки. Стовпчики представляють середнє значення ± SD. Статистичний аналіз проводили за допомогою двостороннього дисперсійного аналізу та тесту Sidak post hoc, де * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,01, а **** p < 0,0001.

3.5. Синергетичний захист, викликаний спільною імунізацією pS/pN або pS/pE/pM

Потім ми оцінили захисну ефективність ДНК-вакцин, використовуючи мишей hACE2, імунізованих після зараження предковим вірусом SARS-CoV-2. Після зараження миші в імітаційній групі демонстрували поступову втрату ваги. Навпаки, миші, імунізовані або pS, або pS+, продемонстрували легку втрату ваги відразу після інфікування з подальшим одужанням (Фігура 5A). Жодного живого вірусу не виявлено у мишей, вакцинованих pS, pS + pN або pS + pE + pM. Крім того, вакцинація pS + pN суттєво зменшила кількість копій вірусної РНК порівняно з тими, отриманими лише вакцинацією pS (p=0.0228; рис. 5B). Крім того, гістопатологія легенів продемонструвала, що у мишей як у групі імітації, так і в групі pN спостерігалися вогнищеві плями запалення, плевральна інвагінація, альвеолярний колапс, високий рівень запальної клітинної інфільтрації та геморагічні ділянки. Для порівняння, миші, які отримували або pS + pN, або pS + pE + pM, демонстрували більш легкі гістопатологічні зміни та нижчі показники INHAND після зараження, ніж інша група (рис. 5C).

Рисунок 5. Захисна ефективність імунізації після зараження живим вірусом SARS-CoV-2. (A) Мишей зважували щодня (середнє ± стандартна помилка середнього (SEM), n=4) протягом трьох днів після зараження. (B) Титр інфекційного SARS-CoV-2 у гомогенатах легенів на третій день після зараження, як визначено за допомогою аналізу TCID5{{10}} і кількості копій РНК. Статистично значущі відмінності між групами визначали за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з подальшою корекцією множинного порівняння Даннета (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 і **** p < 0,0001). (C) Гістопатологічний аналіз легень із застосуванням фарбування H&E.

4. Обговорення

У цьому дослідженні ко-імунізація двома ДНК-вакцинами, що експресують білки S і N, викликала високі рівні nAbs і була дуже ефективною для зниження вірусного навантаження SARS-CoV-2 у мишей. ДНК-вакцини, що експресують білок S, викликали підвищення рівня специфічного клітинного імунітету до білка S після трьох імунізацій, коли мишей спільно імунізували білками N/E та M, і полегшували гістопатологічні зміни після зараження. Наскільки нам відомо, це перший звіт про синергетичне посилення імунітету та захисту у мишей, які використовують ДНК-вакцину, що кодує білок S, коли їх спільно імунізують ДНК-вакцинами, що кодують інші структурні білки SARS-CoV{{8 }}.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Імунодомінантні В-клітинні епітопи в областях антигену N спостерігалися в кількох дослідженнях. Вакцини на основі N зазвичай не можуть індукувати nAbs, ймовірно, через те, що білок N не відображається на поверхні вірусу. Примітно, що спільна імунізація білками S і N викликала вищі рівні nAbs проти предкового вірусу та вірусу Omicron SARS-CoV-2, ніж інші групи. Підвищені відповіді на nAb пов’язані з кращим кліренсом вірусу та захисною ефективністю. Наші результати продемонстрували, що лікування pS + pN було більш ефективним, ніж лікування pS окремо, у зниженні вірусного навантаження SARS-CoV-2 після зараження. Попереднє дослідження показало, що хом’яки, імунізовані вакциною, яка коекспресує білки M і N, були захищені від серйозної втрати ваги та патології легенів і мали значно знижені титри вірусу в ротоглотці та легенях після зараження SARS-CoV-2, що узгоджується з нашими результатами [23]. На жаль, зниження титру вірусу не можна конкретно пояснити білком M або N, а рівні nAb не оцінювали в цьому дослідженні. Одне дослідження мРНК-вакцини проти SARS-CoV-2 показало, що коімунізація S + N індукує посилену S-специфічну відповідь CD8+ Т-клітин і активність нейтралізуючих антитіл, забезпечуючи кращий захист легенів від Дельта варіант порівняно з S окремо, що узгоджується з результатами цього дослідження [24]. Інше дослідження показало, що білок N трансмісивного коронавірусу гастроентериту сприяє синтезу нейтралізуючих антитіл, коли клітини TGEV-IMMUNE свиней стимулювали комбінацією білків S і N in vitro, і цей ефект можна пояснити відповіддю хелперних Т-лімфоцитів на білок N [25].

Імунодомінантні CD4+/CD8+ Т-клітинні епітопи в областях N-антигену були ідентифіковані раніше. Кілька досліджень показали, що вакцини на основі білка SARS-CoV-2 N ефективно індукують клітинні імунні відповіді. Група S + N показала підвищений рівень клітинного імунітету, специфічного до білка S, після трьох імунізацій. В одному дослідженні мРНК-вакцини SARS-CoV-2 повідомлено, що комбінаторний S + N індукував посилену S-специфічну CD8+ Т-клітинну відповідь порівняно з лише S, що узгоджується з нашими результатами [24]. Інше дослідження показало, що Т-клітинні відповіді на антигени S і N лише після первинної вакцинації з подвійним антигеном hAd5 S + N були еквівалентними відповідям у раніше інфікованих SARS-CoV-2- пацієнтів, а також моделі прогнозування Т-клітин in silico зв'язування епітопу HLA припустило, що Т-клітинні відповіді на вакцину hAd5 S + N збережуть свою ефективність проти варіанту B.1.351. Крім того, плазма раніше інфікованих SARS-CoV-2-пацієнтів продемонструвала вищу спорідненість зв’язування з клітинами, що експресують конструкцію S-Fusion + N-ETSD з подвійним антигеном, ніж лише з hAd5 S-Fusion, що додатково свідчить про те, що імуногенність Вакцина з подвійним антигеном S + N краща, ніж вакцина з одним антигеном S [26].

Живий вірус не було виявлено в легенях, і втрата ваги після зараження була пом’якшена в групах pS, pS + pN і pS + pE + pM, тоді як лікування pN не призвело до ефективного зниження титру вірусу. Ці висновки підкреслюють незамінність і ефективність білка S як мішені для вакцини. Примітно, що ко-імунізація pS і pN мала кращий ефект, ніж pS або pN, на кліренс вірусу. У групі pS + pE + pM виявлено менше гістопатологічних змін у легенях, що узгоджується з результатами нашого попереднього дослідження [15]. Група S + N мала низькі копії вірусної РНК у легенях, знижену втрату ваги та швидкий час одужання після зараження SARS-CoV-2 порівняно з групою, імунізованою лише S/N, що узгоджувалося з результати цього дослідження. Проте жодна з груп не виявила титрів нейтралізуючих антитіл, що можна пояснити різницею у різновиді вакцини та піддослідних тварин [26]. В одному дослідженні векторної вакцини проти аденовірусу SARS-CoV-2 повідомлено, що S-вакцина забезпечувала гострий захист мозку лише за умови спільної імунізації з N-вакциною [27]. Інше дослідження розробило вакцини Tri: ChAd, Bi: ChAd і Mono: ChAd, що експресують білки S1/N/RdRp, N/RdRp і S1 відповідно, і протестувало їх на тваринній моделі B.1.351. Значна груба патологія спостерігалася в легенях Mono: ChAdlungs, тоді як легені Bi: ChAd і Tri: ChAd були майже вільними від цієї патології [28].

Крім того, невакциновані тварини мали високе вірусне навантаження в легенях, тоді як лікування Tri: ChAd значно знизило вірусне навантаження на 3,5 log. Для порівняння, вакцини Bi: ChAd і Mono: ChAd лише помірно знизили вірусне навантаження. Ці результати свідчать про те, що захисний ефект вакцини з подвійним антигеном S/N проти варіантів може бути кращим, ніж у вакцини з одним антигеном S, що узгоджується з нашими результатами [28]. Кілька досліджень показали, що у мишей, імунізованих білком N, розвивається важке запалення легенів після інфікування SARS-CoV [29–31]. У попередніх дослідженнях також повідомлялося, що імунізація аденовірусною векторною вакциною, що експресує білок N вірусу гепатиту мишей, захищає мишей від летальної інфекції, що демонструє, що білок N може генерувати захисний ефект [32]. Крім того, група, імунізована ДНК-вакциною CRT/N, мала значно знижений титр вірусу після зараження, причому вірус коров’ячої віспи експресував білок N SARS-CoV [33].

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Одне дослідження білка S продемонструвало, що комбінована ДНК/білкова вакцина індукує як гуморальний, так і клітинний імунітет краще, ніж ДНК/білкова вакцина окремо [8]. Вакцини, націлені лише на білок S, продемонстрували знижену ефективність у захисті від легкої та середньої тяжкості COVID-19, спричиненої новими варіантами. Роль консервативних структурних білків SARS-CoV-2, у тому числі білків N/E/M, заслуговує на увагу при розробці та застосуванні вакцини, оскільки індуковані вакциною Т-клітинні відповіді проти консервативних епітопів зазвичай не залежать від мутацій . Одне дослідження показало, що пацієнти, які одужали від ГРВІ (n=23), все ще мали Т-клітини тривалої пам’яті, реактивні на білок N SARS-CoV, через 17 років після спалаху 2003 року, який продемонстрував сильну перехресну реакцію на SARS CoV{ {15}} білок N, що додатково підтверджує використання білка N як мішені для перехресної захисту вакцини [34]. Це дослідження продемонструвало, що коімунізація pS/pN була пов’язана з вищими відповідями nAb, кращим кліренсом вірусу та покращеними клітинними імунними відповідями та може забезпечити кращий захист після зараження SARS-CoV-2 порівняно з лише pS. Крім того, було показано, що варіанти SARS-CoV-2 заражають багато видів тварин, і спостерігалася передача від людини до тварин у деяких диких тварин і домашніх тварин [7]. Отже, ветеринарна вакцина SARS-CoV-2 потребує більшої уваги. Крім того, нанотехнології можуть бути потужним інструментом оптимізації вакцин і заслуговують на більшу увагу [2].

Це дослідження має кілька обмежень. По-перше, ми спостерігали лише стратегію ДНК-вакцини у мишей BALB/c, і майбутні дослідження мають оцінити імуногенні ефекти цих схем вакцинації на інших моделях тварин. По-друге, потрібні додаткові дослідження, щоб повністю зрозуміти молекулярні механізми, що лежать в основі розширених nAb- і S-специфічних CD8 Т-клітинних відповідей, індукованих спільною імунізацією з використанням білків S і N, і використовувати ці знання для оптимізації COVID-19 дизайн вакцини. Нарешті, функція N білок-специфічних антитіл заслуговує на подальше вивчення.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

На завершення це дослідження оцінювало імунозахисний потенціал спільної імунізації білками SARS-CoV-2 S, N, E та M. Кілька вакцин, націлених лише на білок S, мають знижений захисний ефект щодо нових варіантів штамів. Наші результати закладуть основу для розробки перехресно-реактивної вакцини проти COVID-19 для контролю поточних і нових варіантів SARS-CoV-2 і запобігання потенційній пандемії коронавірусу.

Список літератури

1. Змієвська Є.; Валіулліна А.; Ганєєва І.; Пєтухов А.; Різванов А.; Булатов Є. Застосування клітинної терапії CAR-T поза межами онкології: аутоімунні захворювання та вірусні інфекції. Biomedicines 2021, 9, 59. [CrossRef] [PubMed]

2. Рашидзаде, Х.; Данафар, Х.; Рахімі, Х.; Мозафарі, Ф.; Салехіабар, М.; Рахматі, М.А.; Рахамуз-Хагігі, С.; Мусазаде, Н.; Мохаммаді, А.; Ертас, Ю.Н.; та ін. Нанотехнології проти нового коронавірусу (коронавірус важкого гострого респіраторного синдрому 2): діагностика, лікування, терапія та майбутні перспективи. Наномедицина 2021, 16, 497–516. [CrossRef]

3. Фонтанет, А.; Cauchemez, S. COVID-19 колективний імунітет: де ми? Нац. Rev. Immunol. 2020, 20, 583–584. [CrossRef] [PubMed]

4. Джеянатан, М.; Афхамі, С.; Смайлл, Ф.; Міллер, MS; Lichty, BD; Xing, Z. Імунологічні міркування щодо стратегій вакцинації проти COVID-19. Нац. Rev. Immunol. 2020, 20, 615–632. [CrossRef] [PubMed]

5. Ванделлі, А.; Монті, М.; Міланетті, Е.; Армаос, А.; Руперт, Дж.; Закко, Е.; Бечара, Е.; Деллі Понті, Р.; Тарталья, Г. Г. Структурний аналіз геному SARS-CoV-2 і прогнози взаємодії людини. Nucleic Acids Res. 2020, 48, 11270–11283. [CrossRef] [PubMed]

6. Джексон, CB; Фарзан, М.; Чен, Б.; Чоу, Х. Механізми проникнення SARS-CoV-2 у клітини. Нац. Преподобний мол. Cell Biol. 2022, 23, 3–20. [CrossRef]

7. Конфорті, А.; Санчес, Е.; Сальваторі, Е.; Лайон, Л.; Компаньйон, М.; Пінто, Е.; Паломбо, Ф.; Д'Акунто, Е.; Музі, А.; Роскіллі, Г.; та ін. Кандидат у вакцину з лінійною ДНК, що кодує домен зв’язування рецепторів SARS-CoV-2, викликає потужну імунну відповідь і нейтралізуючі антитіла у домашніх котів. мол. Тер. Методи Клін. Dev. 2023. [CrossRef]

8. Боргоякова М.Б.; Карпенко Л.І.; Меркулєва І.А.; Щербаков Д.Н.; Рудометов А.П.; Старостіна, Є.В.; Шаншин, Д.В.; Ісаєва А.А.; Несмеянова, В.С.; Волкова Н.В.; та ін. Імуногенність ДНК/білкової комбінованої вакцини проти COVID-19. Бик. Exp. Biol. Мед. 2023, 1–4. [CrossRef]

9. Ку, Л.; Йі, З.; Шен, Ю.; Лін, Л.; Чен, Ф.; Сюй, Ю.; Ву, З.; Тан, Х.; Чжан, X.; Тянь, Ф.; та ін. Циркулярні РНК-вакцини проти SARS-CoV-2 і нових варіантів. Cell 2022, 185, 1728–1744.e16. [CrossRef]

10. Корбетт, К.С.; Едвардс, DK; Leist, SR; Абіона, О.М.; Бойоглу-Барнум, С.; Гіллеспі, Р.А.; Хімансу, С.; Шефер, А.; Зіваво, Коннектикут; DiPiazza, AT; та ін. Розробка мРНК-вакцини проти SARS-CoV-2 завдяки підготовленості прототипу збудника. Nature 2020, 586, 567–571. [CrossRef]

11. Tian, ​​JH; Патель, Н.; Хаупт, Р.; Чжоу, Х.; Вестон, С.; Хаммонд, Х.; Лог, Дж.; Портнов, А.; Нортон, Дж.; Guebre-Xabier, M.; та ін. Імуногенність проти SARS-CoV-2 у глікопротеїнової вакцини-кандидата NVX-CoV2373 у бабуїнів та захист у мишей. Нац. Комун. 2021, 12, 372. [CrossRef] [PubMed]

12. Андреано, Е.; Пачіелло, І.; Piccini, G.; Манганаро, Н.; Пілері, П.; Гісені, І.; Леонарді, М.; Пантано, Е.; Аббієнто, В.; Бенінкаса, Л.; та ін. Гібридний імунітет покращує В-клітини та антитіла проти варіантів SARS-CoV-2. Nature 2021, 600, 530–535. [CrossRef]

13. Накві, AAT; Фатіма, К.; Мохаммад, Т.; Фатіма, У.; Сінгх, І.К.; Сінгх, А.; Атіф, С.М.; Харіпрасад, Г.; Хасан, Г.М.; Хассан, М.І. Дослідження геному SARS-CoV-2, структури, еволюції, патогенезу та методів лікування: підхід структурної геноміки. Біохім. біофіз. Acta Mol. Основа. дис. 2020, 1866, 165878. [CrossRef] [PubMed]

14. Аббасі, Дж. Нова індійська ДНК-вакцина проти COVID-19 для підлітків і дорослих є першою. JAMA 2021, 326, 1365. [CrossRef] [PubMed]

15. Чен, Дж.; Денг, Ю.; Хуанг, Б.; Хан, Д.; Ван, В.; Хуан, М.; Чжай, К.; Чжао, З.; Ян, Р.; Чжао, Ю.; та ін. ДНК-вакцини, що експресують білки оболонки та мембрани, забезпечують частковий захист мишей від SARS-CoV-2. Фронт. Immunol. 2022, 13, 827605. [CrossRef]

16. Тебас, П.; Крайняк К.А.; Патель, А.; Маслоу, JN; Морроу, М. П.; Сильвестр, AJ; Ноблок, Д.; Гіллеспі, Е.; Аманте, Д.; Расін, Т.; та ін. Внутрішньошкірна ДНК-вакцина SynCon®Ebola GP є термостабільною та безпечною, демонструє переваги клітинної та гуморальної імуногенності у здорових добровольців. Ж. Інфікувати. дис. 2019, 220, 400–410. [CrossRef]

17. Сміт, TRF; Патель, А.; Рамос, С.; Елвуд, Д.; Чжу, X.; Ян, Дж.; Гері, EN; Уокер, SN; Шультхайс, К.; Пурвар, М.; та ін. Імуногенність ДНК-вакцини-кандидата проти COVID-19. Нац. Комун. 2020, 11, 2601. [CrossRef]

18. Чжао, З.; Денг, Ю.; Ніу, П.; Пісня, Дж.; Ван, В.; Ду, Ю.; Хуанг, Б.; Ван, В.; Чжан, Л.; Чжао, П.; та ін. Коімунізація CHIKV VLP і ДНК-вакцинами викликає багатообіцяючу гуморальну відповідь у мишей. Передній імунол. 2021, 12, 655743. [CrossRef]

19. Гуан, Дж.; Денг, Ю.; Чен, Х.; Інь, X.; Ян, Ю.; Tan, W. Примінг двома ДНК-вакцинами, що експресують білок NS3 вірусу гепатиту С, націлений на дендритні клітини, викликає чудовий гетерологічний захисний потенціал у мишей. Арк. Вірол. 2015, 160, 2517–2524. [CrossRef]

20. Чень, Х.; Вен, Б.; Денг, Ю.; Ван, В.; Інь, X.; Гуань, Дж.; Руан, Л.; Тан, У. Посилення ефекту імунізації ДНК плюс електропорація in vivo за допомогою комбінації плазмід core-PreS1 і S-PreS1 вірусу гепатиту В. Clin. Вакцина Імунол. 2011, 18, 1789–1795. [CrossRef]

21. Ян, Р.; Денг, Ю.; Хуанг, Б.; Хуан, Л.; Лін, А.; Лі, Ю.; Ван, В.; Лю, Дж.; Лу, С.; Жан, З.; та ін. МРНК-вакцина COVID-19 зі структурованою ядром і оболонкою зі сприятливим закономірністю біорозподілу та багатообіцяючим імунітетом. Передача сигналу. Target Ther. 2021, 6, 213. [CrossRef] [PubMed]

22. Ян, Р.; Хуанг, Б.; А, Р.; Лі, В.; Ван, В.; Денг, Ю.; Тан, В. Розробка та ефективність псевдотипованої системи SARS-CoV-2, визначена ефективністю нейтралізації та тестом на інгібування проникнення in vitro. Біосаф. Health 2020, 2, 226–231. [CrossRef] [PubMed]

23. Цзя, К.; Білефельдт-Оман, Х.; Maison, RM; Маслеша-Галіц, С.; Купер, С.К.; Боуен, Р.А.; Horwitz, MRA Реплікуюча бактеріально-векторна вакцина, що експресує мембранні та нуклеокапсидні білки SARS-CoV-2, захищає хом’яків від важких захворювань, схожих на COVID-19-. Вакцини NPJ 2021, 6, 47. [CrossRef] [PubMed]

24. Гайник Р.Л.; Plante, JA; Лян, Ю.; Аламе, М.-Г.; Тан, Дж.; Zhong, C.; Адам, А.; Шартон, Д.; Рафаель, GH; Лю, Ю.; та ін. Комбінаторна мРНК-вакцинація посилює захист від дельта-варіанту SARS-CoV-2. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Антон, І.М.; Гонсалес, С.; Булідо, MJ; Корсін, М.; Risco, C.; Langeveld, JP; Enjuanes, L. Співпраця між структурними білками трансмісивного коронавірусу гастроентериту (TGEV) в індукції in vitro вірус-специфічних антитіл. Virus Res. 1996, 46, 111–124. [CrossRef]

26. Дешамбо, Ю.; Лінч, Дж.; Уорнер, Б.; Тірні, К.; Huynh, D.; Вендрамеллі, Р.; Кравець Н.; Мороз, К.; Бут, С.; Саджеш, Б.; та ін. Одноразова імунізація рекомбінантними вірусами коров’ячої віспи ACAM2000, які експресують спайк і білки нуклеокапсиду, захищають хом’яків від клінічного захворювання, спричиненого SARS-CoV-2-. bioRxiv 2021. [CrossRef]

27. Penaloza-MacMaster, P.; Клас, Дж.; Дангі, Т.; Richner, JM. Нуклеокапсидна вакцина SARS CoV-2 захищає від дистального поширення вірусу. bioRxiv 2021.

28. Афхамі, С.; D'Agostino, MR; Чжан, А.; Стейсі, HD; Марзок, А.; Кан, А.; Сінгх, Р.; Баванантасівам, Дж.; Є, Г.; Ло, X.; та ін. Вакцина проти COVID-19 наступного покоління через слизову оболонку дихальних шляхів забезпечує надійний захист як від предків, так і від варіантних штамів SARS-CoV-2. Cell 2022, 185, 896–915.e19. [CrossRef]

29. Чжен, Н.; Ся, Р.; Ян, К.; Інь, Б.; Лі, Ю.; Дуань, К.; Лян, Л.; Го, Х.; Xie, Q. Підвищена експресія білка нуклеокапсиду SARS-CoV в тютюні та його імуногенність у мишей. Vaccine 2009, 27, 5001–5007. [CrossRef]

30. Ясуї, Ф.; Кай, К.; Кітабатаке, М.; Іноуе, С.; Йонеда, М.; Йокочі, С.; Кейс, Р.; Секігучі, С.; Моріта, К.; Хісіма, Т.; та ін. Попередня імунізація нуклеокапсидним білком коронавірусу, асоційованого з важким гострим респіраторним синдромом (SARS) (SARS-CoV), викликає важку пневмонію у мишей, інфікованих SARS-CoV. J. Immunol. 2008, 181, 6337–6348. [CrossRef]

31. Демінг Д.; Шеахан, Т.; Хейзе, М.; Юнт, Б.; Девіс, Н.; Сімс, А.; Сутар, М.; Харкема, Дж.; Вітмор, А.; Піклз, Р.; та ін. Ефективність вакцини у старіючих мишей, інфікованих рекомбінантним SARS-CoV, які несуть епідемічні та зоонозні спайкові варіанти. PLoS Med. 2006, 3, e525. [CrossRef] [PubMed]

32. Весселінг, Дж. Г.; Годеке, Дж. Дж.; Шійнс, В.Є.; Превек, Л.; Грем, Ф.; Horzinek, MC; Rottier, PJ Білки вірусу мишачого гепатиту та нуклеокапсид, експресовані аденовірусними векторами, захищають мишей від летальної інфекції. Дж. Ген. Вірол. 1993, 74, 2061–2069. [CrossRef] [PubMed]

33. Кім, TW; Лі, Дж. Х.; Хунг, CF; Пен, С.; Роден, Р.; Ван, MC; Віскіді, Р.; Цай, Ю.К.; Він, Л.; Chen, PJ; та ін. Створення та характеристика ДНК-вакцин, націлених на білок нуклеокапсиду коронавірусу тяжкого гострого респіраторного синдрому. Ж. Вірол. 2004, 78, 4638–4645. [CrossRef] [PubMed]

34. Ле Бер, Н.; Тан, AT; Кунасегаран, К.; Там, CYL; Хафезі, М.; Чіа, А.; Chng, MHY; Лін, М.; Тан, Н.; Лінстер, М.; та ін. SARS-CoV-2-специфічний Т-клітинний імунітет у випадках COVID-19 і SARS, а також неінфіковані контрольні особи. Nature 2020, 584, 457–462. [CrossRef]