Синергічна протизапальна дія фукоідану ламінарії японської та екстракту цистанхи тубулозної

У якості імунної відповіді проти чужорідних антигенів макрофаги вивільняють прозапальні цитокіни, такі як фактор некрозу пухлини (TNF-), інтерлейкін-1 (IL- 1), IL-6 та інші. Такі цитокіни індукують хемотаксичний приплив гранулоцитів, моноцитів, лімфоцитів і тучних клітин до пошкодженої тканини, що сприяє видаленню антигену та відновленню тканини. Однак надмірна інфільтрація та активація клітин посилює пошкодження тканин, що призводить до набряку (судинної ексудації) і болю, які є добре відомими явищами запалення.

TNF- є важливим фактором для індукції експресії гена синтази оксиду азоту (iNOS) у кількох клітинних лініях. Активація iNOS призводить до вироблення оксиду азоту (NO), який не тільки модулює декілька фізіологічних функцій, таких як бактерицидна та вазодилатація, але також викликає запалення. Після пошкодження тканини розкладання фосфоліпазами фосфоліпідів клітинної мембрани генерує арахідонову кислоту. Арахидонова кислота далі розкладається циклооксигеназою (ЦОГ) до простагландинів (PG). Надмірна кількість PGE2, що утворюється ЦОГ-II, індукує кілька цитокінів для запалення. Оскільки і NO, і PGE2 діють як основні чинники запалення та індукції болю, шляхи TNF- –NO та COX-II–PGE2 є основними потоками запального процесу, які пригнічуються кортикостероїдами та нестероїдними препаратами.протизапальні засоби(НПЗП) відповідно.

Незважаючи на те, що існує кілька стероїдів і НПЗП длятерапія запальних захворювань, ці препарати можуть спричинити негативний вплив на імунну систему, шлунково-кишковий тракт, нирки, печінку, центральну нервову систему, артеріальний тиск і серцево-судинну систему. Тому необхідно звести до мінімуму негативний вплив хімічних терапевтичних засобів шляхом їх заміни або використання в поєднанні з натуральними продуктами.

Фукоїдан, сульфатний полісахаридний комплекс із морських водоростей, таких як Laminaria japonica та Cladosiphon okamuranus, широко поширений у багатьох країнах, використовувався як терапевтичний засіб у східній медицині протягом тривалого періоду. У попередніх дослідженнях було продемонстровано, що фукоїдан має антиоксидантну, антикоагулянтну, протиракову тапротизапальну діяльність. Відповідно, сприятливий вплив фукоїдану на запальні захворювання, ішемію, імунну дисфункцію та пухлини привертає увагу дослідників. З іншого боку,Цистанка трубчаста(CT) також широко використовувався як традиційний лікарський засіб у Китаї. Повідомлялося, що екстракти CT знижують вироблення TNF-α та IL- 4, які є основними факторами вироблення NO у шляхах запалення [19].

Такі попередні висновки змусили нас дослідити комбіновану ефективність фукоїдану та екстракту СТ на 2 основних шляхах запалення. Щоб з'ясувати механізм дії, ми проаналізували NO і PGE2 в ексудатах від запалення повітряного мішка, викликаного карагенаном.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИЗАПАЛЬНІ ДІЯЛЬНОСТІPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Матеріали та методи

Матеріали

Напівочищений фукоїдан і водний екстракт СТ були отримані від Misuba RTech Co., Ltd. (Асан, Корея). Фукоїдан і екстракт CT зберігали при 4 градусах, змішували (1:3), розчиняли в очищеній воді перед використанням і вводили перорально в об’ємі 5 мл/кг.

Культивування клітин і кількісне визначення NO

Клітинну лінію мишачого макрофага RAW 264.7 було придбано в Американській колекції типових культур (Манассас, США) і культивовано в середовищі Ігла, модифікованому Дульбекко (Sigma, Сент-Луїс, США), що містить 10% фетальної бичачої сироватки та антибіотики [100 ОД/мл]. пеніцилін (Sigma) і 100 мкг/мл стрептоміцин (Sigma)]. Клітини інкубували у зволоженій 5% CO2 атмосфері при 37 градусах.

Щоб оцінити вплив фукоїдану та екстракту CT на секрецію NO, клітини RAW 264.7 (1×106 клітин/мл) інкубували з фукоїданом або екстрактом CT (1–320 мкг/мл) протягом 5 хв. , а потім інтерферон- (IFN-, 10 ОД/мл) і ліпополісахарид (ЛПС, 10 мкг/мл) протягом 24 годин. У наших попередніх дослідженнях було підтверджено, що лікування IFN-плюс LPS для активації клітин RAW 264.7 не впливало на життєздатність клітин до 24 годин і що фукоїдан і екстракт CT не були цитотоксичними до 1 мг/мл. Як індикатор NO вимірювали концентрацію нітриту (NO2 – ), окисненого продукту NO. Культуральне середовище змішували з рівним об’ємом реактиву Ґрісса (1 % сульфаніламіду, 0,1 % нафтилетилендіаміну в 2,5 % фосфорній кислоті) [21] та інкубували при кімнатній температурі 10 хв. Концентрацію нітриту аналізували при 540 нм, де для створення стандартної кривої використовували NaNO2.

Тварини і лікування

Самці мишей ICR (7 тижнів) були придбані в Daehan Biolink (Eumseong, Корея) і поміщені в кімнату з постійними умовами навколишнього середовища (22±2ºC; 40-70% відносна вологість; 12-годинне світло - темний цикл; яскравість 150-300 люкс). Гранулований корм і очищена вода були доступні ad libitum. Усі експерименти на тваринах були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин (IACUC) Національного університету Чунбук (CBNU), Корея, і проводилися відповідно до стандартних операційних процедур (SOP) Центру досліджень лабораторних тварин CBNU.

Мишам (n{0}}/групу) перорально вводили фукоїдан (18 або 54 мг/кг), екстракт CT (54 або 162 мг/кг) або їх суміш (18+54, {{6 }} або 90+270 мг/кг) один раз на день протягом 7 днів. Низькі дози фукоїдану (18 мг/кг) і екстракту CT (54 мг/кг) були отримані з орієнтовних доз для людини 100 мг/тіло (70 кг) і 300 мг/тіло після трансляції площі поверхні маси тіла (Km{{14). }} для людини/км=3 для миші) відповідно. Високі дози фукоїдану та екстракту CT були встановлені у 3 рази, окремо або в суміші, а найвища доза суміші була зафіксована у 5 разів для оцінки максимального синергічного ефекту.

У 1-й день лікування фукоїданом і екстрактом CT мишам підшкірно вводили 10 мл стерильного повітря в спину, щоб сформувати мішок [22, 23]. Через 2 і 5 днів у мішечок повторно ввели 5 мл повітря. Через годину після останньої обробки в пакет вводили 1 мл карагенану (1% у фізіологічному розчині; Sigma) або його носій (фізіологічний розчин).

Аналізи ексудату

Повітряний мішок промивали 1 мл холодного фізіологічного розчину через 6 годин після ін’єкції карагенану, і реєстрували чистий об’єм промивної рідини. Загальну кількість запальних клітин, нейтрофілів, моноцитів і лімфоцитів визначали за допомогою лічильника сошника. Концентрації NO та PGE2 визначали за допомогою реактиву Griess (Sigma) та імуноферментного аналізу (EIA) з використанням набору Correlate-EIA (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA), відповідно.

НАТУРАЛЬНА CISTANCHE TUBULOSA ДЛЯ БЛОКУВАННЯ ДІЇ НА ХЕМОТАКСИС ЗАПАЛЬНИХ КЛІТИН PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Патогістологічне дослідження

Тканину, що вистилає мішок, видаляли та фіксували в розчині нейтрального формаліну. Залиті парафіном предметні скла тканини пофарбували гематоксилін-еозином і дослідили під світловим мікроскопом на наявність запальних уражень.

Статистичний аналіз

Результати представлені як середнє ± SE. Порівняння експериментальних груп проводили за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з наступною корекцією за критерієм Тьюкі. значення AP<0.05 was considered statistically significant.

Результати

In vitro культура клітин RAW 264.7, обробка IFN- та LPS значно підвищила виробництво NO (рис. 1). Попередня обробка фукоїданом (1–320 мкг/мл) не вплинула на вивільнення NO з клітинної лінії макрофагів (рис. 1A). Для порівняння, екстракт CT (32–320 мкг/мл) значно пригнічував вироблення NO, що свідчить про протизапальну активність (рис. 1B).

Ін’єкція карагенану в повітряний мішок миші помітно збільшила об’єм ексудату в мішку (рис. 2). Така підвищена ексудація була послаблена обробкою фукоїданом (18 мг/кг) і екстрактом СТ (54 і 162 мг/кг). Примітно, що комбіноване лікування фукоїданом і екстрактом CT ще більше зменшило об’єм ексудату порівняно з індивідуальними ефектами, хоча комбінації з вищими дозами (54+162 мг/кг і 90+270 мг/кг) не продемонстрували додаткової ефективності до найнижчої комбінації доз (18+54 мг/кг) (Малюнок 2A). Після ін’єкції карагенану також різко зросла концентрація N ступеня в пакеті (рис. 2B). У порівнянні з м'яким ефектом фукоїдану, екстракт CT помітно знизив концентрацію ступеня N. Комбіноване лікування фукоїданом і екстрактом CT додатково знижувало рівень NO залежно від дози. Подібним чином, підвищений вміст PGE2 синергетично пригнічувався комбінованою терапією фукоїданом і екстрактом CT (рис. 2C).

Паралельно з медіаторами запалення в мішку, кількість запальних клітин різко зросла під час ін’єкції карагенану: у 37,8, 4,8 і 24,1 рази більше контрольних рівнів для нейтрофілів, моноцитів і лімфоцитів відповідно (таблиця 1). Однак фукоїдан і екстракт СТ значно зменшили інфільтрацію запальних клітин, у якій фукоїдан дещо перевершував екстракт СТ. Несподівано не було досягнуто синергічного ефекту при інфільтрації запальних клітин при спільному введенні фукоїдану та екстракту CT.

Як видно з інфільтрації запальних клітин в ексудатах, підшкірна клітковина, що оточує повітряні мішки, демонструє серйозні запальні ураження (рис. 3). Було виявлено надзвичайно багато клітин у потовщеній підшкірній клітковині, підданих впливу карагенану (Малюнок 3B), порівняно з майже нормальними показниками у контрольних тварин (Малюнок 3A). Такі запальні ураження були значно послаблені лікуванням фукоїданом (рис. 3C і 3D) або екстрактом CT (рис. 3E і 3F).

Примітно, що більш високі протизапальні ефекти були отримані при комбінованій терапії фукоїданом і екстрактом CT (рис. 3G-3I).

Обговорення

Використовуючи in viv модель запалення повітряного мішка, викликаного арагенаном, впорскування повітря в спину гризунів викликає проліферацію клітин, які розшаровуються на поверхні порожнини, утворюючи структуру, подібну до синовіальної оболонки. У цій моделі ін'єкція інфільтрації запальних клітин, спричиненої карагенаном, збільшила ексудат, що вказує на просочування судин. Повітряний мішок служить резервуаром запальних клітин і медіаторів, які можна легко виміряти в рідині, що накопичується локально.

Серед різноманітних медіаторів запалення, які можуть індукувати проникність судин, добре відомо, що NO і PGE2 є основними факторами, залученими до патогенезу багатьох запальних захворювань. Вони також відомі як медіатори індукції болю та сприйняття. iNOS, який експресується та активується в різних типах клітин шляхом стимуляції TNF- та/або LPS під час запалення, створює високі стійкі концентрації NO. NO є важливою регуляторною молекулою в різноманітних фізіологічних функціях, таких як вазодилатація, що призводить до витоку судин. PGE2, який утворюється з арахідонової кислоти через ЦОГ, сприяє розвитку багатьох запальних захворювань, а надлишкова продукція PGE2 у відповідь на різні запальні стимуляції пов’язана з підвищенням рівня ЦОГ-II і прогресуванням запалення. Таким чином, шляхи TNF- - NO та COX-II-PGE2 розглядаються як два основних потоки запальних процесів, які блокуються інгібіторами iNOS (кортикостероїди) та COX (НПЗП) відповідно.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ЗАБОРОНИ ЗАПАЛЬНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ PHGS75% ECH 30% ДІЯ 12%

У цьому дослідженні спільне введення фукоїдану та екстракту CT зменшило об’єм ексудату в мішечку, що свідчить про те, що вони володіють супресивною дією проти витоку судин (рис. 2A). Порівняно з окремими ефектами кожного фукоїдану та екстракту CT, комбіноване лікування ще більше посилилося, маючи на увазі, що двоступенева дія сполук є синергетичною. Такі синергічні ефекти між фукоїданом і екстрактом CT підтверджувалися їх дією на рівні NO і PGE2 в ексудатах (рис. 3B і 2C).

Цікаво, однак, що було підтверджено, що фукоїдан безпосередньо не пригнічує активацію макрофагів in vitro (рис. 1A). Подібним чином, інгібуючий потенціал фукоїдану щодо накопичення NO та PGE2 в аналізі in vivo був відносно нижчим, ніж у екстракту CT (рис. 2B та 2C). Такий механізм дії фукоїдану відрізняється від прямої інактивації клітин екстрактом CT (рис. 1B). Для порівняння, фукоїдан виявляв високу ефективність щодо інгібування запальної клітинної інфільтрації в мішках (табл. 1). Фукоїдан перевершував екстракт СТ у блокуванні міграції нейтрофілів, моноцитів і лімфоцитів до місць ушкодження тканин, спричинених карагенаном. Цікаво, що не було синергетичного антиміграційного ефекту, що вказує на різні механізми дії між фукоїданом і екстрактом CT: тобто фукоїдан блокує інфільтрацію запальних клітин, тоді як екстракт CT пригнічує активацію клітин.

Поліморфноядерні клітини, особливо нейтрофіли, є основними клітинними компонентами, що залучаються до гострих запальних ділянок, індукованих карагенаном. Крім того, клітини запалення, такі як макрофаги та лімфоцити, також відіграють центральну роль у запальному процесі шляхом секреції цитокінів. При попередній обробці фукоїданом або екстрактом CT кількість лейкоцитів, які мігрували в повітряні мішки з введеним карагенаном, помітно зменшувалася. Цей результат узгоджувався з ефектом, який могли б отримати кортикостероїди, такі як дексаметазон, але не НПЗЗ, включаючи індометацин. Тому передбачається, що фукоїдан і екстракт CT частково мають властивості стероїдів.

На додаток до блокуючої дії на хемотаксис клітин запалення, екстракт CT, як виявилося, пригнічує активацію макрофагів. Це було підтверджено його інгібіторною дією на NO in vitro та in vivo, який є основним медіатором запалення, що виробляється макрофагами. Таким чином, вплив екстракту CT на макрофаги може бути наслідком пригнічення експресії мРНК та/або прямого інгібування активності iNOS у цих клітинах.

PGE2 також є одним із основних медіаторів запалення. Він наростає паралельно з набряком тканин, який пригнічується НПЗЗ, інгібіторами ЦОГ. Карагенан може збільшити виробництво PGE2 шляхом індукції мРНК ЦОГ-II і білка ЦОГ-II в ексудаті мішка. У цій моделі карагенан значно збільшив кількість PGE2, і він був істотно пригнічений екстрактом CT. Цікаво відзначити, що цей результат узгоджувався з ефектом, який був би отриманий за допомогою НПЗЗ індометацину. Таким чином, з результатів зроблено висновок, що екстракт CT має додаткові властивості НПЗП. Взяті разом, вважається, що екстракт CT справляв як кортикостероїдні, так і НПЗП-подібні ефекти в моделі запалення, викликаного карагенаном, і що фукоїдан посилювавпротизапальну дію екстракту CTшляхом блокування запальної клітинної інфільтрації.

Хоча визначення точного механізму дії потребує подальшого вивчення, суміш фукоїдану та екстракту СТ помітно послабила ознаки запалення шляхом блокування шляхів TNF- –NO та COX-II–PGE2 при запаленні повітряного мішка, спричиненому карагенаном. Ці результати свідчать про те, що комбіноване лікування фукоїданом і екстрактом CT може бути перспективним кандидатом для полегшення різних типів запалень, які реагують на кортикостероїди або НПЗЗ.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ЗАБОРОНИ ЗАПАЛЬНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ PHGS75% ECH 30% ДІЯ 12%