Спермідин полегшує пошкодження мітохондрій міокарда новонароджених у потомства у щурів, спричинене внутрішньоутробною гіпоксією, шляхом пригнічення окислювального стресу та регулювання контролю якості мітохондрій, частина 2

4.4. Вплив спермідину на антиоксидантну активність міокарда та апоптоз у новонароджених, які зазнали внутрішньоутробної гіпоксії

Глікозид цистанхи може також підвищувати активність СОД у тканинах серця та печінки та значно знижувати вміст ліпофусцину та МДА в кожній тканині, ефективно поглинаючи різні реактивні кисневі радикали (OH-, H₂O₂ тощо) та захищаючи від пошкодження ДНК, спричиненого ОН-радикалами. Фенілетаноїдні глікозиди Cistanche мають потужну здатність поглинати вільні радикали, вищу відновну здатність, ніж вітамін С, покращують активність СОД у суспензії сперми, знижують вміст МДА та мають певний захисний ефект на функцію мембрани сперми. Полісахариди цистанхе можуть підвищувати активність SOD і GSH-Px в еритроцитах і легеневих тканинах експериментально старіючих мишей, викликаних D-галактозою, а також знижувати вміст MDA і колагену в легенях і плазмі і підвищувати вміст еластину, мають хороша очищувальна дія на DPPH, подовжує час гіпоксії у старіючих мишей, покращує активність СОД у сироватці та затримує фізіологічну дегенерацію легенів у експериментально старіючих мишей. Експерименти показали, що цистанша має хорошу антиоксидантну здатність до клітинної морфологічної дегенерації. і має потенціал бути лікарським засобом для запобігання та лікування хвороб старіння шкіри. У той же час ехінакозид у Cistanche має значну здатність поглинати вільні радикали DPPH і може поглинати активні форми кисню, запобігати індукованій вільними радикалами деградації колагену, а також має хороший ефект відновлення при пошкодженні аніонів вільних радикалів тиміну.

Клацніть «Як використовувати Cistanche Tubulosa».

【Додаткова інформація:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Ми виміряли активності антиоксидантних ферментів SOD і CAT в міокарді за допомогою колориметрії (рис. 4A і B). Встановлено, що активності СОД і КАТ у групі ВНГ були значно нижчими, ніж у контрольній групі (P < 0.05); Порівняно з групою IUH, активність SOD і CAT у групі SPD значно зросла (P < 0.05), а DFMO скасував ефект SPD (P < 0). 05). Згодом ми оцінили апоптоз клітин шляхом виявлення TUNEL-позитивних ядер (рис. 4C і D) і експресії проапоптозного білка BAX і антиапоптозного BCl-2 (рис. 4E і F). Ми помітили, що кількість TUNELпозитивних кардіоміоцитів і співвідношення експресії білка BAX/BCL2 були значно вищими в групі IUH, ніж у контрольній групі (P <0,05). Навпаки, співвідношення TUNEL-позитивних клітин і співвідношення експресії білка BAX/BCL2 були нижчими в міокарді щурів, які отримували SPD, ніж у групі IUH (P <0,05). DFMO усунув ефект SPD (P <0,05). Підводячи підсумок, SPD, що вводиться внутрішньоутробно, може скасувати зниження активності антиоксидантних ферментів і збільшення апоптозу клітин у серцях нащадків, індукованого IUH.

4.5. Вплив спермідину на виробництво активних форм кисню, потенціал мітохондріальної мембрани та мітофагію в кардіоміоцитах, які піддаються гіпоксії

Мітохондріальна дисфункція в основному проявляється як збільшення продукції АФК, зниження синтезу АТФ і накопичення дисфункціональних мітохондрій. Потенціал мітохондріальної мембрани (∆Ψm) – це протонний електрохімічний градієнт (H плюс градієнт концентрації та трансмембранна різниця потенціалів) через внутрішню мембрану мітохондрій, який утворюється під час перенесення електронів мітохондріального окисного дихального ланцюга, в якому знаходиться невелика кількість АФК. виробляється. Відповідно, основними показниками функції мітохондрій є рівень АФК та ​​зміни ∆Ψm. Надмірне виробництво АФК призводить до накопичення нефункціональних мітохондрій; пошкоджені мітохондрії в основному видаляються мітофагією. Щоб дослідити, чи може екзогенний SPD впливати на цілісність мітохондріальної функції в кардіоміоцитах в умовах гіпоксії, ми спочатку перевірили рівні ROS за допомогою флуоресцентного зонда DHE (рис. 5A). Ми спостерігали, що виробництво АФК збільшувалося після того, як кардіоміоцити були піддані гіпоксії протягом 24 годин (P < 0.05), і що SPD пригнічував індуковане гіпоксією виробництво АФК (P < 0 .05); однак DFMO скасував зниження виробництва АФК, опосередковане SPD, коли DFMO постачали кардіоміоцитам, обробленим SPD (P < 0.05) (Малюнок 5C). Крім того, ∆Ψm було виявлено за допомогою флуоресцентного зонда TMRE (Рис. 5B). Чим сильніша інтенсивність червоної флуоресценції, тим вищий мітохондріальний потенціал (P < 0.05). Ми помітили, що інтенсивність червоної флуоресценції була значно нижчою в групі IUH, ніж у контрольній групі (P < 0.{05). Порівняно з групою IUH, інтенсивність червоної флуоресценції була вищою при лікуванні SPD (P <0,05), а DFMO знову скасувала ефекти SPD (P <0,05) (Рис. 5D). Потім ми оцінили колокалізацію мітохондрій (позначених зеленим кольором MitoTracker) із лізосомами (позначених червоним кольором Lyso-Tracker), що дозволило нам виміряти аутофагічну деградацію мітохондрій (рис. 5E). Як показано на малюнку 5F, порівняно з контролем, гіпоксія зменшила колокалізацію Mito-Tracker Green і Lyso-Tracker Red у кардіоміоцитах (P <0,05). Проте, порівняно з групою гіпоксії, відсоток колокалізованих мітохондрій і лізосом був вищим у групі лікування SPD (P <0,05), а DFMO скасував ефект SPD (P <0,05). Ці результати свідчать про те, що гіпоксія збільшує виробництво АФК і зменшує ∆Ψm і мітофагію; SPD може полегшити спричинене гіпоксією пошкодження мітохондрій, стимулюючи мітофагію та пригнічуючи окислювальний стрес.

4.6. Вплив SPD на систему MQC міокарда у новонародженого потомства, яке зазнало IUH

Контроль якості мітохондрій (MQC), включаючи процеси мітохондріальної аутофагії, мітохондріального біосинтезу та злиття та поділу мітохондрій, має вирішальне значення для підтримки нормальної морфології, кількості та функції мітохондрій і забезпечення нормального функціонування та метаболізму клітин. Мітофагія регулює MQC і опосередковує широку аутофагічну деградацію мітохондрій у відповідь на зміну шляху та фізіологічні зміни. Спочатку ми оцінили мітофагію, спостерігаючи за утворенням мітофагосоми за допомогою ТЕМ (рис. 6A - C). Згідно з результатами, деякі аномальні структури або мітохондрії фрагментації були укладені в подвійну мембрану аутофагічної мембрани, яка була мітофагосомами, і вказувала на активність мітофагії в контрольній групі. Проте кількість мітофагосом сильно зменшилася в міокарді групи ВНГ. Цікаво, що міокард групи SDP продемонстрував майже ідентичні фенотипи мітофагії до фенотипів контрольної групи, тоді як DFMO скасував ефекти, індуковані SPD. Мітохондрії є високодинамічними органелами, які зазнають постійних процесів поділу та злиття, пов’язаних з їх функцією. Далі ми перевірили мітохондріальну фрагментацію за допомогою ТЕМ (рис. 6A). Ми виявили, що кількість малих мітохондрій і фрагментів мітохондрій значно зросла під час IUH порівняно з контролем (P < 0.05), що вказує на те, що поділ мітохондрій був значно підвищеним. Ця зміна була стримана лікуванням SPD, і DFMO також знову скасував роль SPD (рис. 6D). Крім того, були виявлені DRP1 і MFN2 (регулюючі білки мітохондріальної динаміки) (рис. 6E - G). MFN2 значно зменшився, тоді як DRP1 збільшився та спостерігався в групі IUH порівняно з контрольною групою (P < 0.05). У той час як DRP1 був знижений, а MFN2 був активований під час лікування екзогенним SPD (P < 0.05), DFMO скасував ефекти, викликані SPD. Мітохондріальний біосинтез координується з мітофагією для видалення пошкоджених або надлишкових мітохондрій, створення нових мітохондрій і підтримки гомеостазу MQC в умовах стресу. Нарешті, ми оцінили експресію білків, пов’язаних з мітохондріальним біосинтезом, включаючи SIRT-1, PGC-1, NRF-2 і TFAM, за допомогою імуноблот-аналізу (рис. 6H - L). Порівняно з контрольною групою експресія SIRT-1, PGC-1 , NRF-2 і TFAM значно знизилася в міокарді групи IHU (P < 0,05). Порівняно з групою IUH експресія білка SIRT-1, PGC-1, NRF-2 і TFAM у групі SPD значно зросла (P <0,05). DFMO скасував ефект SPD (P <0,05). Підводячи підсумок, ці результати вказують на те, що IUH призводить до дисфункції MQC в міокарді одноденних нащадків і що лікування SPD значно пригнічує дисбаланс системи MQC у новонароджених нащадків, які зазнали впливу IUH.

5. Обговорення

Хвороби серця є серйозною проблемою для здоров’я в усьому світі. Було продемонстровано, що хронічна гіпоксія плода може спровокувати серцеву дисфункцію плода та програмувати підвищений ризик серцевих захворювань у дорослого потомства. Серце має високу швидкість метаболізму, і його залежність від мітохондріальної функції для виробництва енергії є критичною для нормальної роботи серця. Проте вплив IUH на мітохондріальну функцію серця та пов’язаний з цим механізм, а також спрямованість профілактичної стратегії кардіопротекції на мітохондрії у новонародженого потомства досі невідомі. У цьому дослідженні ми виявили, що у одноденних щурів, які зазнали впливу ВНГ, спостерігаються значні відхилення у рості та розвитку, дозріванні кардіоміоцитів, особливо в мітохондріальній структурі та функції міокарда, а екзогенна додаткова СПД у внутрішньоутробному періоді може полегшити це, спричинене ВНГ. зміни шляхом інгібування окисного стресу міокарда та зменшення апоптозу. Важливо, що ми помітили, що пренатальне лікування SPD може значно змінити аномалії мітофагії та біогенезу, а також мітохондріальну фрагментацію в міокарді новонароджених щурів, викликану IUH. Наскільки нам відомо, це дослідження було першим звітом про захисний ефект SPD на ураження серця новонароджених, спричинене IUH, шляхом регулювання механізму MQC, а потім покращення функції мітохондрій.

Достатні докази свідчать про те, що внутрішньоутробне обмеження росту заважає траєкторії розвитку систем плода, що може погіршити роботу серця в подальшому житті (5, 7, 37). У нашому дослідженні IUH спричинив затримку росту та пошкодження серця у новонароджених щурів, оскільки одноденні новонароджені щури, які зазнали впливу IUH, продемонстрували значне зниження BW та HW та збільшення співвідношення HW/BW. Крім того, було порушене розташування волокон міокарда, розрив міофіламентів, виявлена ​​запальна клітинна інфільтрація серед міофіламентів, підвищене відкладення колагену в міокарді. Ці висновки узгоджуються з висновками, повідомленими Ducsay та ін. (2) і Thompson et al. (7). У кількох тваринних моделях серце плода, що піддається хронічній гіпоксії, демонструє знижене дозрівання та проліферацію кардіоміоцитів, а також знижений запас кардіоміоцитів (38, 39). Подібним чином наше дослідження також показало, що частка двоядерних кардіоміоцитів зросла, а експресія Ki67 зменшилася в групі IUH. Час, коли кардіоміоцити стають дво-/багатоядерними, збігається з часом, коли ссавці втрачають свій регенеративний потенціал (40). Дозрівання серця плода має важливе значення для здоров’я серця потомства. Відповідно, ВМГ змушує кардіоміоцити достроково виходити з клітинного циклу, а порушення дозрівання кардіоміоцитів призводить до порушення пластичності постнатального росту серця.

Немає необхідності зазначати, що мітохондрії є основними клітинними органелами, які беруть участь у виробництві АФК; дисфункційні мітохондрії утворюються не тільки у відповідь на зниження виробництва АТФ, але також на підвищений окислювальний стрес і апоптоз (41). У цьому дослідженні IUH значно знижував активність антиоксидантних ферментів SOD і CAT, знижував мітохондріальну дихальну функцію та рівні АТФ, підвищував експресію BAX/BCL2 і порушував мітохондріальну структуру в міокарді одноденних новонароджених щурів. Ці висновки підтверджуються іншими дослідниками (11), які задокументували, що хронічна гіпоксія матері під час вагітності може знизити активність мітохондріального комплексу IV і викликати апоптоз у серцях плодів щурів, які перенесли термін вагітності. Ми стверджували, що мітохондріальний компроміс може лежати в основі окислювального стресу та енергетичної недостатності під час внутрішньоутробного розвитку плода, що завершується перинатальною травмою серця. Це може бути основною причиною підвищеного серцево-судинного ризику у нащадків вагітностей, ускладнених хронічною гіпоксією плода. Відповідно, можливо прийняти мітохондрії як мішень терапевтичного втручання для захисту серцевої функції потомства. Алджунайди та ін. повідомили, що лікування матері мітохондріальним антиоксидантом MitoQ запобігло плацентарному окислювальному стресу, врятувало ріст плоду та покращило серцеву функцію у нащадків, які зазнали впливу IUH (42).

Спермідин - це поліамін з різними біологічними функціями. Як ми вже згадували, SPD може пригнічувати накопичення АФК, викликане H2O2-, і запобігати зниженню потенціалу мітохондріальної мембрани (МММ) і рівнів АТФ у культивованих кардіоміоцитах новонароджених щурів і клітинах H9C2. Крім того, SPD може сприяти мітохондріальному біогенезу та покращувати функцію мітохондрій у старіючому серці (43). Поліаміни спермін і спермідин можуть впливати на динамічний мітохондріальний протеом, тим самим запобігаючи віковим змінам серцевих функцій і старінню серця (36). Інші дослідження також продемонстрували, що додаткове застосування SPD уповільнює серцеве старіння шляхом посилення мітофагії та сприяння мітохондріальному диханню у мишей (44). ODC є ключовим ферментом синтезу поліамінів, і повідомляється, що нокдаун in vivo ODC або застосування DFMO, необоротного інгібітора ODC, призводить до порушення розвитку зачаття та затримки росту плода через недостатню доступність поліамінів (45, 46). Наше поточне дослідження вказує на те, що лікування 5 мг/кг/день SPD у щурів, які піддалися IUH, запобігає затримці росту та зміні морфологічної структури серця та дозрівання у новонароджених дітей. Більше того, посилення серцевого окислювального стресу, спричинене IUH, посилення апоптозу та зниження мітохондріальної дихальної функції у новонароджених, також запобігали SPD, тоді як DFMO, який вводили матері, скасовував опосередкований SPD захист для серця новонародженого. Добре задокументовано, що поліаміни беруть участь у плацентарному ангіогенезі та ембріогенезі, а також у рості та розвитку ембріона та плоду (47). Чжу та ін. повідомили, що рівень поліаміну був нижчим у плазмі пупкової вени у плодів свиней із внутрішньоутробним обмеженням росту (ВЗР), і додаткове СПД матері може запобігти ЗВУР (48). Спермідин є сполукою з прийнятною безпекою та меншою токсичністю (49). Зростаюча кількість доклінічних і клінічних досліджень показала, що дієтичний SPD має такі впливи на здоров’я, як запобігання старінню, захист серцево-судинної системи, нейромодуляція та протизапальні функції, наприклад внутрішньоочеревинна ін’єкція SPD (50 мг/кг) у мишей захищає від індукованого колагеном артрит шляхом інгібування поляризації макрофагів M1 у синовіальній тканині (50). Додавання 10 мг/кг/день SPD скасовувало вікове погіршення серцевої діяльності у щурів (36). Що ще важливіше, мати була втручанням з 5 мг/кг/день SPD під час пізньої вагітності для покращення IUH-індукованого зниження когнітивних і нервових функцій (51) і пошкодження серця окисним стресом у нащадків щурів (32). Відповідно, ми використовували ту саму дозу SPD (5 мг/кг/день) для вагітних щурів, які зазнали впливу IUH, як і в нашому попередньому дослідженні. Ми підозрювали, що додавання матері SPD під час гіпоксичної вагітності може підвищити рівень SPD у кровообігу плода, що могло бути пов’язано із захистом від окислювального стресу, що призводить до плаценти, яка захищатиме мітохондрії в серці, що розвивається, від програмування IUH, дії SPD може бути досягнуто за допомогою його потужного антиоксидантного, антиапоптозного та механізму сприяння проліферації.

Механізми контролю якості мітохондрій є важливими для підтримки нормальної морфології, кількості та функції мітохондрій і забезпечення нормального функціонування та метаболізму клітин (16). Останні дані показали, що механізми MQC відіграють вирішальну роль у перинатальному дозріванні мітохондрій міокарда та розвитку серця (14). Gong та ін. вперше повідомив, що незрілі фетоподібні мітохондрії безпосередньо деградують опосередкованою Паркіном мітофагією протягом раннього постнатального періоду (19). Тим часом, мітохондріальний біогенез різко зростає (52), а фактори мітохондріального злиття та поділу транскрипційно регулюються в серці після народження (20, 21). Однак набагато менше відомо про вплив IUH на MCQ в міокарді новонароджених дітей. У цьому дослідженні ми вперше спостерігали, що кількість мітофагосом значно зменшилася в міокарді групи IUH, що вказує на те, що IUH порушує мітофагію міокарда новонароджених щурів. Далі ми спостерігали суттєво знижену експресію PGC-1 (ключового регулятора мітохондріального біогенезу) і експресію його сигнальних молекул вище та нижче за течією, включаючи SIRT-1, TFAM і NRF{{10} } в міокарді групи ВНГ. Більше того, ми виявили, що вплив IUH призвело до зменшення розміру або фрагментації мітохондрій, а експресія DRP1 зросла; однак експресія MFN2 зменшилася в міокарді новонародженого потомства щурів, що свідчить про те, що поділ мітохондрій було активовано, а злиття було знижено. Ці результати відображають причинно-наслідковий зв’язок між дисбалансом механізму MQC та індукованим IUH пошкодженням міокарда у новонароджених дітей. Ці складні процеси MQC функціонують узгоджено один з одним, щоб усунути дисфункціональні мітохондрії специфічним і цілеспрямованим чином і координувати біогенез нових органел, що є важливим для гомеостазу серцево-судинної системи. Багато внутрішньоклітинних і позаклітинних сигналів можуть регулювати події MQC, включаючи окислювальний стрес, потенційний колапс мембрани, апоптоз та інші. Тут дисбаланс мітохондріального MQC можна пояснити посиленням окислювального стресу та посиленням апоптозу в серці потомства щурів, які зазнали IUH. Відповідно, важливо підтримувати відповідний механізм MQC, щоб забезпечити здорову мітохондріальну мережу в серці новонародженого потомства, яке піддається IUH.

Враховуючи, що плацентарні рівні SPD тісно пов’язані з обмеженням росту плода (53), SPD може регулювати MQC на іншій тваринній моделі. Наприклад, SPD є потужним і специфічним індуктором аутофагії для збільшення тривалості життя, який може захистити процес старіння кількох тканин, включаючи серце, мозок і скелетні м’язи (44, 54, 55). Спермідин може полегшити серцеве старіння, покращуючи мітохондріальний біогенез (43). У цьому дослідженні ми застосували SPD до материнських мишей і виявили, що SPD може нормалізувати дисбаланс міокарда MQC у нащадків, які зазнали IUH. Однак лікування матері інгібітором ODC DFMO скасувало ефекти SPD, що вказує на те, що втручання SPD може запобігти аномальному MQC у міокарді одноденних щурів, які зазнали впливу IUH. Підводячи підсумок, можна сказати, що відмінна робота MQC в міокарді новонародженого потомства може покращити мітохондріальну структуру, функцію та дозрівання, таким чином реалізуючи трансформацію від внутрішньоутробної здатності до гліколізу до постнатального окислення жирних кислот, забезпечення енергією та задоволення зростаючого навантаження на серце після народження. . Крім того, наш експеримент на кардіоміоцитах свідчить про те, що SPD може пригнічувати збільшення індукованого гіпоксією виробництва ROS, зниження ∆Ψm і порушення аутофагічної деградації мітохондрій. Ми прийшли до висновку, що сприятливий вплив SPD можна віднести до підвищених рівнів SPD у плаценті та кровообігу шляхом застосування SPD матері, тим самим захищаючи мітохондрії міокарда потомства від програмування розвитку IUH.

5.1. Висновок

Це дослідження підкреслює, що терапія SPD у внутрішньоутробному періоді може захистити міокард одного дня - серце нащадка від несприятливих наслідків внутрішньоутробної гіпоксії. Ці постнатальні зміни, викликані SPD, можуть бути досягнуті шляхом антиоксидантної дії та антиапоптозу, а також шляхом регулювання шляхів MQC, тим самим зменшуючи розвиток мітохондрій, запрограмований у серці, що піддається впливу IUH. У цьому дослідженні є деякі обмеження. Ми не проводили фармакокінетичні експерименти щодо SPD, тому ми не можемо визначити точні рівні SPD у кровообігу плода, коли матері вводили SPD. У наших майбутніх дослідженнях ми будемо далі досліджувати ефективну концентрацію SPD в крові з використанням плаценти плода. Нинішні результати створюють нову основу для майбутніх досліджень, щоб визначити роль SPD у запобіганні мітохондрій міокарда у новонароджених із ВНГ.

【Додаткова інформація:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】