Захисна дія альфа-ліпоєвої кислоти проти 5-індукованого фторурацилом шлунково-кишкового мукозиту у щурів. Частина 1

Анотація: Альфа-ліпоєва кислота (ALA) широко використовується в полівітамінних формулах і продуктах проти старіння. Метою цього дослідження було дослідити потенційні захисні переваги АЛК щодо 5-фторурацилу (5-ФУ)-індукованого шлунково-кишкового мукозиту у щурів-альбіносів Вістар. Вирізали тканини шлунка, тонкої кишки та товстої кишки та отримували сироватки крові для визначення біохімічних показників, таких як TNF-, IL-1, MDA, GPx, SOD, MMP-1, {{ 8}}, -8 і TIMP-1. Також було проведено патогістологічне дослідження. Результати виявили підвищені через мукозит рівні TNF-, IL-1, MDA, MMP-1, -2, -8 і TIMP-1 як у тканинах, так і в сироватці і ці значення різко впали після лікування ALA. Зниження активності SOD і GPx у групах мукозиту було скасовано в групах, які отримували ALA. Відповідно до гістопатологічної оцінки пошкодження, спричинене мукозитом у шлунку та тонкій кишці, регресувало в групі, яка отримувала ALA. Отже, застосування добавок АЛК у 5-терапії ФУ може діяти як захисне втручання для хворих на рак із шлунково-кишковим мукозитом. У світлі висновків ALA, отриманий з їжі антиоксидант із плейотропними властивостями, може бути ефективним засобом для лікування 5-індукованого ФУ мукозиту шлунково-кишкового тракту та запобігати окислювальному стресу, запаленню та пошкодженню тканин у хворих на рак, які отримують {{ 24}}ФУ терапія.

Глікозид цистанхи може також підвищувати активність СОД у тканинах серця та печінки та значно знижувати вміст ліпофусцину та МДА в кожній тканині, ефективно поглинаючи різні реактивні кисневі радикали (OH-, H₂O₂ тощо) та захищаючи від пошкодження ДНК, спричиненого ОН-радикалами. Фенілетаноїдні глікозиди Cistanche мають потужну здатність поглинати вільні радикали, вищу відновну здатність, ніж вітамін С, покращують активність СОД у суспензії сперми, знижують вміст МДА та мають певний захисний ефект на функцію мембрани сперми. Полісахариди цистанхе можуть підвищувати активність SOD і GSH-Px в еритроцитах і легеневих тканинах експериментально старіючих мишей, викликаних D-галактозою, а також знижувати вміст MDA і колагену в легенях і плазмі і підвищувати вміст еластину, мають хороша очищувальна дія на DPPH, подовжує час гіпоксії у старіючих мишей, покращує активність СОД у сироватці та затримує фізіологічну дегенерацію легенів у експериментально старіючих мишей. Експерименти показали, що цистанхе має хорошу антиоксидантну здатність до клітинної морфологічної дегенерації. і має потенціал бути лікарським засобом для запобігання та лікування хвороб старіння шкіри. У той же час ехінакозид у Cistanche має значну здатність поглинати вільні радикали DPPH і може поглинати активні форми кисню, запобігати індукованій вільними радикалами деградації колагену, а також має хороший ефект відновлення при пошкодженні аніонів вільних радикалів тиміну.

Натисніть на Cistanche Tubulosa

【Додаткова інформація:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

1. Введення

Альфа-ліпоєва кислота (ALA) присутня в широкому спектрі харчових продуктів, включаючи овочі (шпинат, брокколі, помідори) і м’ясо (особливо нутрощі), а також кілька харчових добавок [1,2]. ALA має численні антиоксидантні ефекти, включаючи активацію ендогенних антиоксидантних механізмів і хелатування іонів металів, таких як залізо, цинк і мідь [3,4]. Будучи сіркоорганічною молекулою, АЛК може поглинати активні форми кисню (АФК) і посилювати активність тканинних антиоксидантних ферментів, таких як глутатіонпероксидаза (GPx) і супероксиддисмутаза (СОД) [5–7]. Завдяки своїм антиоксидантним властивостям ALA зменшує залежну від ALA загибель клітин при раку легенів [8], раку молочної залози [9] і раку товстої кишки [10]. Крім того, попередні дослідження показали, що ALA має протизапальні властивості [11–16]. ALA зменшує запалення, модулюючи експресію запальних цитокінів, таких як фактор некрозу пухлини-альфа (TNF-) та інтерлейкін-1 (IL-1) [17,18]. Фармакологічні переваги ALA були доведені в широкому спектрі пов’язаних з медициною галузях, включаючи серцево-судинні, нейропротекторні, когнітивні моделі та моделі проти старіння [19].

Рак є головною причиною смертності в кожній країні та основною перешкодою для довголіття [20]. Побічні ефекти хіміотерапевтичних препаратів є одним із найважливіших виснажливих факторів у боротьбі з раком, а мукозит є одним із найпоширеніших захворювань, які зустрічаються у онкологічних пацієнтів [21]. Мукозит – це патологічний запальний стан, що характеризується виразкою та запаленням слизової оболонки шлунково-кишкового тракту [22]. Мукозит збільшує використання опіоїдних анальгетиків через біль і прискорює перехід до повного парентерального харчування через проблеми з харчуванням [23]. Мукозит і труднощі, пов’язані з мукозитом, погіршують якість життя пацієнта, тоді як розвиток станів, що загрожують життю, і негативна реакція на терапію викликають занепокоєння через погане лікування уражень [24].

Найбільш часто використовуваним хіміотерапевтичним препаратом при злоякісних пухлинах шлунково-кишкового тракту є аналог піримідину 5-фторурацил (5-ФУ). 5-ФУ проявляє свою протиракову дію шляхом інгібування тимідилатсинтази (ТС) та інтеграції її метаболітів у РНК і ДНК [25]. Однак цей засіб викликає шлунково-кишковий мукозит, серйозний виснажливий побічний ефект [26]. Зокрема, деградація оксидантно-антиоксидантного балансу, підвищення рівня прозапальних цитокінів і активності протеолітичних ферментів відіграють головну роль у розвитку цих побічних ефектів. Незважаючи на те, що антиоксиданти та протизапальні препарати використовувалися для вирішення цієї проблеми, особливо надійний терапевтичний метод ще не визначено [27,28].

На сьогодні кілька досліджень повідомляють про використання 5-ФУ та АЛК разом при різних видах раку; до них належать пухлини шийки матки та колоректальні [29,30]. Крім того, допоміжні препарати, які можуть бути включені в процедури лікування для запобігання онкологічних пацієнтів від побічних ефектів шлунково-кишкового мукозиту, викликаного 5-FU, були б корисними. Таким чином, мета цього дослідження полягала в тому, щоб визначити біологічні ефекти використання АЛК у щурів із моделлю мукозиту, створеною 5-FU, на додаток до вивчення її можливого використання як препарату-кандидата в протоколах лікування.

2. Матеріали та методи

2.1. Тварини

Тварини були взяті з відділу експериментів на тваринах Близькосхідного університету. Щурів (Wistar albino, обох статей) з самого початку утримували в режимі темряви/світла 12:12 годин при кімнатній температурі 22 ± 2 ◦C у приміщенні з контрольованою вологістю (50 ± 5 відсотків). Годування проводилося ad libitum без будь-яких обмежень щодо стандартної їжі щурів і питної води. Щурів містили в клітці з оргскла (по 4 щури на клітку з розмірами 60 × 40 × 40 см). Протокол дослідження було схвалено Комітетом з етики місцевих експериментів на тваринах Близькосхідного університету (Схвалення № 2019/01 від 17 січня 2019 року та 2020/11 від 27 листопада 2020 року), а також етичні рекомендації, згадані в Гельсінкській декларації 1964 року та її пізніших поправках. слідували.

Тридцять два щури Wistar Albino обох статей вагою 200–250 г були розподілені на чотири групи по вісім щурів у кожній (n=8): контрольна група, група ALA, мукозит і група мукозит плюс ALA. Контрольна група отримувала лише внутрішньоочеревинний (ip) фізіологічний розчин (SF) один раз на день протягом одного тижня. Група АЛК отримувала лише АЛК у дозі 100 мг/кг внутрішньовенно один раз на день протягом одного тижня з 1 дня [31,32]. Групу пацієнтів із мукозитом лікували SF (ip) у день 1 і 400 мг/кг 5-FU ip з дня 2 до кінця експерименту [33]. Група, яка отримувала мукозит плюс АЛК, отримувала 100 мг/кг внутрішньовенно АЛК в день 1 і 400 мг/кг в/б 5-FU в день 2. Потім продовжували вводити АЛК у дозі 100 мг/кг/день внутрішньовенно до кінця експерименту. . За тваринами спостерігали протягом одного тижня, за цей час не було зафіксовано жодної смертності. Тварини в усіх групах були піддані евтаназії наприкінці періоду дослідження введенням комбінації передозування кетаміну/ксилазину. Лабораторні аналізи проводили в діагностичній лабораторії та гістопатологічній лабораторії лікарні для тварин Близькосхідного університету.

2.2. Збір зразків крові та тканин

Зразки крові відбирали та надсилали до лабораторії в пробірках із сепаратором сироватки. Зразки сироватки розділяли при 2000 × g протягом 10 хвилин і зберігали при -80 ◦C до подальшого аналізу. Щоб усунути додаткову кров, тканини шлунка, тонкої та товстої кишки збирали та промивали розчином фосфатного буфера (pH=7.4). Потім, після доставки в лабораторію, вони проходили процедуру гомогенізації. Гомогенізацію тканин проводили відповідно до протоколу виробника з використанням буфера RIPA (арт. № 10010263, партія № 0490889-1, Cayman Chemicals, Енн-Арбор, штат Мічиган, США) і набору для подрібнення тканин Dounce (D8938, партія 3110, Sigma). -Олдріч, Сент-Луїс, Міссурі, США) на льоду. Після гомогенізації зразки центрифугували при 1600× g протягом 10 хв при плюс 4 ◦C. Для кількісного визначення рівня білка в зразках тканини використовували метод визначення білка Бредфорда, а потім супернатанти заморожували при -80 ◦C для подальшого дослідження.

2.3. Вимірювання біохімічних показників

Активність аланінтрансамінази (ALT), аспартаттрансамінази (AST), лужної фосфатази (ALP), лактатдегідрогенази (LDH), ліпази (LIP), амілази (AMY), креатиніну, азоту сечовини крові (BUN), загального білка (TP) , а рівні альбуміну вимірювали як біохімічні показники в зразках сироватки за допомогою автоматизованого аналізатора клінічної хімії BS-240 VET (Mindray, Шеньчжень, Китай).

2.4. Вимірювання цитокінів у сироватці крові та тканинах

Концентрації TNF- та IL-1 у сироватках і зразках тканин вимірювали за допомогою комерційно доступних наборів для специфічного для щурів імуноферментного аналізу (ELISA) (ELR-TNF- і ELR-IL1 -, RayBiotech Life). Inc., Норкрос, Джорджія, США), дотримуючись інструкцій виробника.

2.5. Вимірювання матриксних металопротеїназ (MMP) і тканинних інгібіторів металопротеїназ-1 (TIMP-1) у сироватці крові та тканинах

MMP і TIMP-1, які беруть участь у різноманітних біологічних процесах, таких як рак і запалення, вимірювали як у тканинних гомогенатах, так і в сироватках із застосуванням інструкцій виробника та рекомендацій комерційно доступних аналізів ELISA для щурів (MMP{ {2}} E-EL-R0617; Elabscience, Ухань, Китай; MMP-2 ELR-MMP2; MMP-8 ELR-MMP8; TIMP-1 ELR-TIMP-1 RayBiotech Life Inc., Норкросс, Джорджія, США). Сироваткові концентрації MMPs і TIMP-1 виражали як пг/мл, тоді як рівні в тканинах виражали як пг/мг білка.

2.6. Вимірювання малонового діальдегіду (MDA), GPx і SOD у тканинах

Рівні MDA у тканинах оцінювали за допомогою комерційно доступних наборів для визначення стану перекисного окислення ліпідів (TBARS Assay Kit, артикул № 10009055, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA). Принцип вимірювання заснований на реакції з тіобарбітуровою кислотою (ТБК) у киплячій воді протягом 60 хвилин у кислому середовищі та вимірюванні абсорбції реакційної суміші при 532 нм (Ohkawa et al., 1979). Для вимірювання абсорбції використовувався пристрій VersaMax Tunable Microplate Reader (Molecular Devices, Сан-Хосе, Каліфорнія, США). Концентрації МДА в тканинах виражали як нмоль МДА/мг білка.

У тканинах активність GPx і SOD оцінювали за допомогою готових до використання наборів для аналізу. (RANSEL RS505, RANSOD SD125, Randox Laboratories Ltd., Крамлін, Великобританія) за допомогою автоматизованого клінічного хімічного аналізатора BS-240 VET (Mindray, Шеньчжень, Китай). Кількість GPx і SOD у зразках тканин (шлунок, тонка кишка та товста кишка) виражали як U/мг білка.

2.7. Гістопатологічна оцінка

Тканини шлунка, тонкої та товстої кишки, отримані одразу після експериментального періоду, фіксували в 10% (об/об) нейтральному формаліні протягом 24 годин при кімнатній температурі. Після фіксації тканини поміщали на пристрій відстеження тканин Leica TP1020 (Leica Microsystems GmbH, Вецлар, Німеччина). Потім тканини, взяті з пристрою відстеження тканин, заливали в парафін. Зрізи товщиною 5- мкм вирізали з тканин за допомогою мікротома Leica RM2255 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Німеччина) і проводили рутинне фарбування гематоксиліном і еозином (HE). Зрізи досліджували гістоморфологічно за допомогою світлового мікроскопа Leica DM500 у поєднанні з інтегрованою системою аналізу цифрових зображень Leica Microsystem Framework (Leica Application Suite версія 3.0 Series 38132019, Leica ICC50 HD, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Nußloch, Німеччина).

2.8. Статистичний аналіз

Для статистичного аналізу використовували програмне забезпечення GraphPad Prism (версія 7.04, програмне забезпечення GraphPad, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Усі дані були виражені як середнє ± стандартне відхилення (X ± SD). Тест дисперсійного аналізу (ANOVA) використовувався для порівняння груп даних, а потім тест множинного порівняння Тьюкі. Крім того, для порівняння гістоморфологічних балів між групами використовувався тест Крускала–Уолліса. Різниця p < 0,05 вважалася статистично значущою.

3. Результати

3.1. АЛК позитивно впливає на біохімічні показники

Таблиця 1 відображає активність ферментів сироватки крові та концентрації метаболітів. Порівняно з контрольною групою група хворих на мукозит мала значно вищі рівні альбуміну, АЛТ, АСТ, ЩФ, ЛДГ, амілази, ліпази, BUN, креатиніну та TP (p < 0.05 –0.0001). Проте була значна різниця в рівнях альбуміну, АСТ, АЛТ, ЩФ, ЛДГ, BUN, креатиніну, амілази, BUN і креатиніну між групою ALA плюс мукозит і групою мукозиту (p < 0,05–0,001). Рівні АЛФ, АЛТ, АСТ, ЛДГ та амілази також суттєво відрізнялися між групами мукозиту та АЛК (p <0,05–0,0001). Відповідно, спостерігалося різке зниження рівнів ферментів печінки, ферментів підшлункової залози та метаболітів у групі мукозиту, коли до лікування додавали АЛК.

3.2. ALA зменшує вироблення прозапальних цитокінів

Рівні прозапальних цитокінів TNF- та IL-1 у зразках сироватки, шлунку, тонкої та товстої кишок можна побачити на малюнку 1. Рівні TNF- та IL-1 у сироватці та всіх тканини тварин у групі мукозиту були значно вищими порівняно з контрольною, ALA та групами мукозит плюс ALA (p < 0.05–0.0{ {17}}{{20}}1). Однак рівні TNF- та IL-1 у сироватці крові та всіх тканинах значно знизилися в групі мукозиту плюс ALA порівняно з групою мукозиту (p < 0.05–0.0001). Між групами «Контроль» і «Мукозит плюс ALA» спостерігалася значна різниця в рівнях TNF- у тонкому та товстому кишечнику. (р <0,01). Були також значні відмінності в рівнях TNF у товстому та тонкому кишечнику між групами ALA та Mucositis plus ALA. (p < 0,01, p < 0,001 відповідно). Крім того, спостерігалися статистично значущі відмінності між контрольною групою та групою мукозит плюс ALA щодо рівнів IL-1 у шлунку (p <0,05). Таким чином, виявилося, що ALA значно пригнічує рівні прозапальних цитокінів при мукозиті.

3.3. Лікування АЛК зменшує перекисне окислення ліпідів і підвищує активність антиоксидантних ферментів у тканинах

Рівні MDA, GPx і активності SOD були кількісно визначені для оцінки перекисного окислення та антиоксидантного статусу на рівні тканин (рис. 2). Рівні MDA у шлунку, тонкому та товстому кишечнику в групі мукозиту були значно вищими, ніж у контрольній групі, ALA та групах мукозит плюс ALA (p < 0.05–0 .0001). Крім того, рівні MDA у товстому кишечнику групи мукозит плюс АЛК суттєво відрізнялися від рівнів контрольної та АЛК груп (р <0,0001).

Щури в контрольній групі та групах ALA мали значно вищі рівні СОД у всіх тканинах, ніж щури в групі мукозиту (p < {{0}}.05–0.{{8 }}{{10}}01). Рівні СОД у зразках товстого кишечника значно відрізнялися в групах ALA та Mucositis plus ALA (p <0,01). У зразках шлунка рівні СОД були значно нижчими в групах ALA та Mucositis plus ALA (p <0,05). Крім того, рівні СОД у тонкій кишці щурів із групи мукозиту були значно нижчими, ніж рівні СОД у групі АЛК (p <0,05). Однак рівні СОД у шлунку та товстому кишечнику тварин у групах Мукозит і Мукозит плюс АЛК істотно відрізнялися (p <0,05–0,0001).

3.4. Лікування АЛК підвищує рівні тканинних ММП і ТІМП-1

Активність MMP{{0}}, MMP-2, MMP-8 і TIMP-1 (табл. 2) у сироватці крові, шлунку, тонкому та товстому кишечнику була значною вище в групі мукозиту порівняно з контрольною групою та групами ALA (p < 0.05–0.0001). Підвищення рівнів MMP-1, MMP-2, MMP-8 і TIMP-1 у сироватці крові щурів із захворюванням мукозиту, а також у шлунку, тонкій і товстій кишках було значно пригнічене в Мукозит плюс АЛК у щурів (p <0,05–0,0001), хоча істотної різниці в рівнях MMP-8 у сироватці між групами Мукозит плюс АЛК і Мукозит не було.