Секвенування одноклітинної РНК клітин сечі виявляє чітку клітинну різноманітність при COVID{1}}-асоційованому ГПН Ⅱ

Результати

Ми провели scRNAseq на осаді сечі восьми госпіталізованих пацієнтів зCOVID-19, п'ять сAKIі три без АКІ. Чотири додаткові зразки сечі згоспіталізовані пацієнти без COVID-19і з ГПН також були зібрані, щоб порівняти потенційні відмінності в ГПН у контексті COVID{{0}}. Середній sCr у пацієнтів із ГПН, пов’язаним із COVID-19, становив 2,4 мг/дл порівняно з 0,83 мг/дл у контрольних пацієнтів на момент збору. Зокрема, двоє пацієнтів сCOVID 19-пов'язаніAKIмав ранішедіагнози ХХН, який було показанопогіршити результати від COVID-19(39,40). Супутні захворювання та інші змінні дещо відрізнялися між контрольною популяцією з ГПН і без ГПН (табл. 1).

Відповідно до попередніх звітів (29), кількість клітин була дуже неоднорідною між пацієнтами (додатковий малюнок 1, A і B). Загалом було секвеновано 65 234 клітини, а 30 076 клітин збережено за допомогою контролю якості. Інтегрована апроксимація рівномірного колектора та проекції всіх 12 зразків пацієнтів виявили різноманітний масив ниркових, уротеліальних та імунних клітин (рис. 1, A, E та F). Нам вдалося виявити більшість клітин нирок, включаючи подоцити та клітини нирок VCAM11, демонструючи здатність неінвазивного дослідження нирок за допомогою аналізу сечі. Існує явна гетерогенність популяції уротеліальних клітин, що виходить за рамки цього дослідження, але потребує подальшого дослідження. Захоплені типи клітин були різнимиГрупи AKI та не-AKI(Малюнок 1, B–D), а також між кожним пацієнтом (додатковий малюнок 1C). Як і очікувалося, у зразках ГПН, пов’язаних із COVID-19, було виявлено більшу кількість імунних клітин.

ТРАДИЦІЙНІ КИТАЙСЬКІ ТРАВИ ЯК НИРКОВА ДІЄТА

GSEA виявив підвищення регуляціїапоптотичні гени, елементи відповіді на IFN та різні інші сигнальні шляхи в контрольних зразках як пов’язаного з COVID-19, так і не-COVID-19 ГПН і без ГПН (Малюнок 2C, Додатковий малюнок 2). Через високі енергетичні потреби та вміст мітохондрій проксимальний каналець є однією з найбільш чутливих структур до ураження під час ГПН (41), а тяжкість ураження пов’язана із загальними наслідками (42). Аналіз шляхів клітин проксимальних канальців у пацієнтів з ГПН виявив збагачення шляхів, пов’язаних з апоптозом, відновленням ДНК і клітинними реакціями на активні форми кисню та стрес на відміну від пацієнтів без ГПН (рис. 2, A і B). Подібний шлях регуляції був виявлений в інших канальцевих клітинах нирок. Шляхи, пов’язані з пошкодженням, регулювалися під час ГПН, але збагачення активних форм кисню, пошкодження ДНК і шляхи апоптозу в проксимальних канальцях, петлі Генле та збірній протоці були більш очевидними при COVID-19-пов’язаних ГПН порівняно зі зразками не-COVID-19 ГПН. Ми підозрюємо, що існує багато шляхів, що збігаються в ГПН, через комбінацію механізмів ушкодження, включаючи ішемію, запалення або токсичність ліків. Додаткове збагачення шляхів, пов’язаних із пошкодженням, при ГПН, пов’язаному з COVID–19, може бути спричинено іншими запальними процесами, що виникають у процесі захворювання COVID-19. Це може пояснити метаболічні відмінності, які спостерігаються в сечі пацієнтів з ГПН, асоційованим із COVID-19 (43)

Рецептор входу вірусу, ACE2, у великій кількості присутній у різноманітних тканинах, включаючи нирки. Транскрипти ACE2 і TMPRSS2 були виявлені на різних епітеліальних клітинах нирок і були особливо поширені в уротеліальних клітинах (рис. 3A). Оскільки SARS-CoV-2 — це РНК-вірус із хвостом полі-А (44), ми створили налаштований геном для вирівнювання, у якому геном SARS-CoV-2 було додано як екзон до hg38 людини геном. Цікаво, що хоча ми не виявили будь-яких транскриптів вірусу SARS-CoV-2 у клітинах нирок у пацієнтів з ГПН, ми виявили сліди транскриптів в уротеліальних клітинах пацієнта 7 (який мав COVID-19 без ГПН ), що свідчить про пряме інфікування цих клітин сечового міхура (рис. 3A). Індивідуальний аналіз пацієнта 7 виявив мало клітин ниркового походження. Більшість виділених клітин були імунними та уротеліальними клітинами. Вірусна РНК була виявлена ​​виключно в уротеліальних клітинах з високою експресією ACE2 (рис. 3B, додаткова рис. 3). Аналіз сечі цього пацієнта показав лейкоцитурію без ознак бактеріальної інфекції (негативна лейкоцитарна естераза та нітрит) (рис. 3C). Аналіз шляхів уротеліальних клітин виявив збагачення шляхів, залучених до передачі сигналу IFN типу 1, гострої запальної відповіді та відповіді лейкоцитів (рис. 3D, додаткова рис. 2B), що узгоджується з вірусною інфекцією цих клітин.

Малюнок 2.|Збагачення шляхів, пов’язаних із пошкодженням, у клітинах пацієнтів із ГПН. Аналіз збагачення набору генів кожного кластера клітин із інтегрованого UMAP для шляхів, включаючи (A) характерні шляхи активних форм кисню, (B) характерні шляхи апоптозу та (C) характерні шляхи відновлення ДНК у пацієнтів із COVID-19 ГПН (ліві панелі), Елементи керування COVID-19 без ГПН (центральні панелі) та пацієнти з не-COVID-19 ГПП (праві панелі). Ідентифікація кластерів така: 1, уротеліальний; 2 — уротеліальний; 3 — уротеліальний; 4 — макрофаг; 5, MHC клас 2–позитивний нейтрофіл; 6 — петля Генле; 7 — нейтрофіл; 8 — збірна трубка; 9 — уротеліальний; 10 — парасолька; 11 — нейтрофіл; 12 — збірна трубка; 13 — нирковий резидентний макрофаг; 14 — нейтрофіл; 15 — уротеліальний; 16, їзда на велосипеді; 17 — проксимальний каналець; 18 — проксимальний каналець; 19 — гладком’язова клітина; 20 — інтеркальована клітина; 21 — уротеліальний; 22, Т-клітина; 23 — подоцит; 24 — еритроцити; 25 — макрофаг; 26, Б клітина; 27 — макрофаг; 28, еритроцити.доказів прямого зараження не було. Механіканізм входу буде з базальної сторони уротеліюклітини, якщо з крові, або з боку просвіту, якщо з сечі.

Попереднє дослідження показало, що ACE2 експресується як на базальній, так і на просвітній поверхнях сечового міхура (23). Виявлення вірусного циститу за допомогою scRNAseq узгоджується з клінічними характеристиками пацієнта 7 (Малюнок 3C). Незважаючи на те, що вірус було виявлено лише в невеликій кількості клітин, ми підозрюємо, що більшість інфікованих вірусом клітин могли бути відфільтровані під час обробки сечі та етапів контролю якості аналізу даних, під час яких ми видаляли мертві та гинуть клітини.