Ліпокалін, асоційований з нейтрофільною желатиназою, демонструє сильнішу здатність пригнічувати збільшення кісти клітин ADPKD порівняно з несекретованою формою Ⅲ
Jun 25, 2024
3.4. Вплив mNGAL на утворення цист клітин 2L3 у 3D культурі
Проліферація клітинаномально збільшується у мишей 2L3 і призводить до утворення та збільшення кіст [17]. Базуючись на попередніх результатах, mNGAL інгібувавПроліферація клітин 2L3 у 2D культурі(Малюнок 3), ми припустили, що mNGAL може додатково пригнічувати утворення кіст у клітинах 2L3. Щоб дослідити, чи може mNGAL пригнічувати утворення кіст у клітинах 2L3, ми створили платформу 3D-культури, яка забезпечила відповідне середовище з Matrigel для утворення кіст (рис. 6). Клітини висівали в 96-лункові планшети (1000 клітин/лунку) поверх попередньо сформованого Матригелю протягом ночі. Після того, як клітини були прикріплені до гелю, до клітин було додано більше Matrigel для формування сендвіч-подібного візерунка (Рис. 6A). Клітини витримували в 3D-культурі при 37 ◦C і 5% CO2 протягом щонайменше 5 днів для утворення цист. Кісти в 3D-культурі збільшувалися з тривалим часом культивування (рис. 6B). Щоб підтвердити, що сферичні конструкції, які спостерігалися в 3D-культурі, були кістами з просвітом, ми зафіксували та пофарбували їх DAPI та антитілами до Е-кадгерину та актину для ідентифікації клітинних ядер, клітинно-клітинної адгезії та апікальної мембрани відповідно. Різні оптичні зрізи кісти 2L3 у 3D-культурі від верху (шар 1) до середини (шар 5) спостерігали за допомогою конфокальної мікроскопії, і просвіт було підтверджено всередині сферичної кісти (рис. 6C, додатковий матеріал).
НОВІ ТРАВИ ДЛЯ ADPKD(ПОЛІКІСТОЗ НИРОК)
Щоб дослідити вплив mNGAL на утворення кіст клітин 2L3 у 3D-культурі, клітини в 3D-культурі обробляли форсколіном з 1 по 3-й день, щоб індукувати утворення кісти. Потім клітини обробляли mNGAL або без нього з 4-го по 8-й день, і кожен день вимірювали діаметри кіст (Рис. 6D). Кісти в 3D-культурі зростали пропорційно кількості днів культивування, з діаметром від 40 до 120 мкм (Рис. 6E–G), тоді як mNGAL значно зменшував діаметр (Рис. 6F) і площу кіст (Рис. 6G) до 8-го дня. , не було значної різниці у збільшенні кількості кіст між контрольною групою та групами, які отримували mNGAL, з 4 по 8 день (рис. 6H). Ми додатково проаналізували кількість великих кіст (діаметр > 100 мкм) між двома групами та виявили, що mNGAL значно знизив відсоток великих кіст порівняно з контрольною групою на 8 день (рис. 6I).
3.5. Вплив трансфекції pN + LS і pN − LS на експресію NGAL і проліферацію клітин у клітинах 2L3
Щоб з’ясувати, чи потреба у більш високій концентрації mNGAL (2 мг/мл) у 3D-культурі для пригнічення росту цист клітин 2L3 (рис. 6) була пов’язана з відсутністю посттрансляційної модифікації mNGAL, ми розробили конструкцію для надекспресії mNGAL. в клітинах 2L3. Крім того, було продемонстровано, що NGAL може взаємодіяти з NGAL-R і додатково індукувати апоптоз [29]. Отже, щоб зрозуміти, чи взаємодіяв NGAL з NGAL-R для індукування апоптозу та даліпригнічують життєздатність клітин(Малюнок 3) і зростання кісти (Малюнок 6), конструкція для надекспресії несекретованого NGAL (без лідерної послідовності) також була трансфікована в клітини 2L3.
NGAL миші (NP_032517.1) і NGAL людини (NP_005555.2) є білками 200-aa і 198-aa відповідно, і обидва мають {{6 }}aa сигнальний пептид для секреції, розташований на N-кінці білка NGAL (рис. 7A). Порівняння послідовностей показало 62% ідентичності та 80% позитивності між NGAL миші та NGAL людини. Було показано, що мишачий NGAL має два N-зв’язаних сайти глікозилювання на аспарагіні (Asn, N) на аа 81 і 85, тоді як людський NGAL мав один сайт на аа 85 (Рис. 7A), виявляючи різницю між ними в посттрансляційній модифікації.
Рисунок 7. Вплив трансфекції pN + LS і pN − LS на експресію NGAL і проліферацію клітин у клітинах 2L3. (A) Вирівнювання білків NGAL миші (NP_032517.1) і NGAL людини (NP_005555.2). Сигнальні пептиди 20-aa показані синім кольором. Два зареєстрованих N-пов’язаних сайти глікозилювання на Asn (N) на 81 і 85 аа NGAL миші та один на 85 аа NGAL людини позначені зірочкою (*). Тотожності: суцільна лінія; плюси: парні точки. Інформація про послідовність вище взята з програми BLASTP на веб-сайті Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI). (B) Побудуйте діаграму mNGAL з (pN + LS) або без (pN − LS) секретованої лідерної послідовності Igκ на векторі pLAS2.1w.PeGFP-I2-Bsd. (C) Результат гель-електрофорезу підтвердив конструкцію pN + LS (647 bp) і pN − LS (587 bp), розщеплених NheI і NotI. (D) Хронологія зараження та відбір клітин 2L3 з pN + LSта pN − LS відповідно. Клітини 2L3 були інфіковані pN + LS або pN - LS у планшеті з лунками 6a на 1-й день. Відбір бластицидином починався на 2-й день, а середовище змінювалося кожні 3 дні. Після відбору протягом тижня клітини збирали для аналізу за допомогою RT-QPCR, вестерн-блоттингу та ELISA. (E) Виявлення експресії репортерного eGFP для вивчення ефективності трансфекції pN + LS і pN - LS на 2-й день. Близько 10% клітин були інфіковані конструкцією GFP. Шкала: 50 мкм. Результати RT–qPCR показали, що pN + LS і pN − LS мають вищу експресію Lcn2 (представлений загальний рівень NGAL) (F) і c-myc (представлений трансфікований екзогенний рівень NGAL) (G) порівняно з контрольною групою. (H) Не було істотної різниці в Slc22a17 (NGAL-R) між групами. RQ: відносна квантифікація=2−∆∆Ct; Gapdh використовували як внутрішній контроль кожного зразка. Значення були нормалізовані до контрольної групи. (I) Результати Вестерн-блоттингу показали, що pN + LS і pN − LS мали вищу експресію NGAL, ніж контрольна група. (J) ELISA показав, що клітини pN + LS і pN - LS обидвасекретували значно більше NGAL, ніж контрольна група, тоді як кількість секретованих NGAL клітин pN − LS була значно меншою, ніж клітини pN + LS. (K) Включення BrdU показало, що клітини pN + LS і pN - LS мали нижчий коефіцієнт проліферації клітин, ніж контрольна група, тоді як клітини pN - LS мали вищий, ніж клітини pN + LS. Для визначення значущості між двома групами було виконано t-критерій Стьюдента (n=3 у RT–qPCR та ELISA, n=4 у вестерн-блоттингу та включення BrdU). *p < 0.05; ** p < {{10}}.01; *** p < 0,001 проти 2L3 кожної групи; # p < 0,05; ### р < 0,001 порівняно з групою pN + LS; ns: істотної різниці немає.
У цьому дослідженні ми використовували лідерну послідовність (LS) мишачого Igκ-ланцюга [44] замість оригінального сигнального пептиду mNGAL, щоб забезпечити підвищену секрецію екзогенного білка mNGAL. Для надлишкової експресії секретованого або несекретованого NGAL використовували NGAL з або без LS у векторах pLAS2.1w.PeGFP-I2-Bsd, а саме pN + LS і pN − LS, які показані на малюнку 7B. Два промотори, pCMV і hPGK, були використані для стимулювання незалежної експресії двох білків, NGAL-c-myc-His6 і eGFP. Щоб гарантувати вбудовування конструкції, NheI та NotI використовували для розщеплення двох плазмід, а результати гель-електрофорезу показали 647-смугу bp від pN + LS і 587-смугу bp від pN − LS (через відсутність лідерної послідовності 60-bp) (Малюнок 7C).
Для інфікування pN + LS і pN-SP у клітини 2L3 полібрен і лентивірус додавали до клітин та інкубували при 37 ◦C протягом 24 годин з подальшим відбором бластицидином (рис. 7D). Виявлення експресії GFP проводили за допомогою флуоресцентної мікроскопії після інфікування (Фігура 7E). Інфіковані клітини збирали через тиждень після відбору бластицидином для RT–qPCR, вестерн-блоттингу та ELISA для аналізу рівня експресії NGAL (рис. 7F–J). Результати RT–qPCR показали, що інфікування клітин 2L3 pN + LS і pN − LS призвело до підвищення експресії Lcn2 (рис. 7F) і Lcn2-c-myc (рис. 7G), які представляють рівні загального та екзогенного NGAL, відповідно, тоді як не було відмінностей у рівнях експресії Slc22a17 (NGAL-R) (Фігура 7H). Результати вестерн-блоттингу показали, що клітини pN + LS і pN - LS мали вищі рівні внутрішньоклітинної експресії NGAL, ніж контрольні клітини 2L3 (Рисунок 7I). Результати ELISA для клітинного супернатанту показали, що клітини pN + LS і pN - LS мають значно вищі рівні секретованого NGAL, ніж контрольна група клітин 2L3 (Малюнок 7J). Крім того, кількість NGAL, що секретується клітинами pN - LS, була значно меншою, ніж кількість, що секретується клітинами pN + LS (Малюнок 7J), тоді як обидві групи мали однакові рівні експресії NGAL (Малюнок 7I). Це відкриття підтвердило наше передбачення, що надмірна експресія NGAL без сигнального пептиду (pN − LS) обмежує секрецію NGAL, незважаючи на наявність високого рівня внутрішньоклітинного NGAL. Щоб дослідити, чи секретований NGAL, а не несекретований NGAL інгібує проліферацію клітин, було проведено аналіз включення BrdU, який показав, що клітини pN + LS і pN − LS мають значно нижчу проліферацію, ніж контрольна група (рис. 7K). Крім того, клітини pN - LS мали значно вищу проліферацію, ніж клітини pN + LS (Фігура 7K). Ці результати свідчать про те, що секреція NGAL з клітин 2L3 потрібна для інгібування клітинної проліферації.
3.6. Вплив психічної надмірної експресії, що веде до сигнальних шляхів у клітинах 2L3
Базуючись на наших попередніх результатах, які показують, що mNGAL може інгібувати шляхи ERK і AKT у клітинах 2L3 (рис. 4) і додатково зменшувати проліферацію клітин (рис. 3) і збільшення кісти (рис. 6), ми використали вестерн-блоттинг, щоб проаналізувати, чи ERK і AKT шляхи були порушені в клітинах pN + LS і pN - LS (рис. 8). Результати вестерн-блоту показали, що групи pN + LS і pN − LS мали значно нижчий коефіцієнт p-ERK (T202/Y204)/ERK, ніж контрольна група, а група pN − LS мала більш високий коефіцієнт p-ERK (T202/Y204)/ERK, ніж група pN + LS (Рис. 8A). Співвідношення p-AKT (S473)/AKT було нижчим у групі pN + LS, ніж у контрольній групі, тоді як клітини pN − LS істотно не відрізнялися від клітин контрольної та pN + LS груп (Рисунок 8B). Співвідношення p-CREB (S133)/CREB було значно вищим у групі pN − LS, ніж у групі pN + LS, тоді як ні pN + LS, ні pN − LS не показали суттєвої різниці з контрольною групою (рис. 8C). Ці результати свідчать про те, що pN + LS і pN - LS мали статистично значущі відмінності у співвідношенні p-ERK/ERK (рис. 8A), тоді як група pN + LS не показала кращого ефекту в AKT (рис. 8B) і CREB (рис. 8A). Рисунок 8C) активація.
Відповідно до попередніх результатів, що застосування mNGAL може індукувати апоптоз (рис. 3) і аутофагію в клітинах 2L3 (рис. 5), а також зменшувати проліферацію клітин (рис. 3) і збільшення кісти (рис. 6), ми використали Вестерн-блот для дослідження впливу на апоптоз. і аутофагія в pN + LS і pN - LS клітинах (рис. 9). Результати вестерн-блоту показали, що клітини pN + LS мали значно вищий коефіцієнт розщепленої/про-каспази-3 (Рис. 9A) і розщепленої/про-PARP (Рис. 9B), ніж у контрольній групі; Клітини pN − LS не показали істотної різниці у співвідношенні розщепленої-/про-каспази-3 (Малюнок 9A) і розщепленої-/про-PARP (Малюнок 9B) порівняно з контрольною групою, а також співвідношення розщепленої- /pro-caspase-3 був значно нижчим, ніж у групі pN + LS (Малюнок 9B). Ці результати продемонстрували, що надмірна експресія секретованого NGAL, а не несекретованого NGAL індукує апоптоз у клітинах 2L3.
Більш високе співвідношення LC3B II/LC3B I (рис. 9C) і нижче співвідношення p62/GAPDH (рис. 9D) було виявлено в клітинах pN + LS порівняно з контрольною групою; Клітини pN − LS не мали істотної різниці у співвідношенні LC3B II/LC3B I (рис. 9C) і p62/GAPDH (рис. 9D) порівняно з контрольною групою, а співвідношення LC3B II/LC3B I було значно нижчим, ніж у Група pN + LS (Малюнок 9C). Цей результат показав, що надмірна експресія секретованого NGAL, а не несекретованого NGAL, індукувала аутофагію в клітинах 2L3.
3.7. Вплив надмірної експресії mNGAL на утворення цист клітин 2L3 у 3D-культурі
Ґрунтуючись на попередніх результатах, що mNGAL пригнічує проліферацію клітин 2L3 і збільшення кіст у 2D і 3D культурі відповідно (рис. 3 і 6), ми підозрювали, що надмірна експресія секретованого NGAL може додатково пригнічувати збільшення кісти клітин 2L3 через пригнічення проліферації клітин ( малюнок 7K).
Щоб дослідити вплив надекспресії NGAL у клітинах 2L3 на утворення кісти, контрольні клітини 2L3, клітини pN + LS і pN − LS обробляли форсколіном на дні 1–3, щоб індукувати утворення кісти. Діаметр, площа та кількість кіст вимірювали щодня після індукції форсколіну (Рис. 10A). Цисти контрольної групи 2L3, клітини pN + LS і pN − LS у 3D-культурі росли залежно від днів культивування (рис. 10B) і показали очевидні відмінності в розмірі кісти з 4 по 8 день. Група pN + LS мала значно менші діаметри кіст (Малюнок 10C) і площі (Малюнок 10D), ніж контрольна група з 4 по 8 день, тоді як група pN − LS мала значно менші діаметри кіст, ніж контрольна група на дні 6 і 8 (Малюнок 10C). Не було суттєвої різниці в площі кісти між контрольною та pN-LS групами. Крім того, група pN - LS мала значно більші діаметри та площі кіст, ніж група pN + LS на 8 день (рис. 10C, D). Хоча не було істотної різниці у швидкості збільшення кількості кіст серед контрольних, pN + LS і pN - LS клітин (рис. 10E), групи pN + LS і pN - LS мали значно нижчий відсоток великих (діаметр > 100 мкм) кіст, ніж у контрольній групі (Рис. 10F) з 4 по 8 день. Ці результати показали, що pN + LS і pN - LS обидва інгібували збільшення кісти, тоді як інгібуючий ефект pN - LS був слабшим, ніж ефект pN + LS . Це відкриття показало, що надмірна експресія секретованого mNGAL має кращу здатність інгібувати збільшення кісти клітин 2L3 у 3D-культурі, ніж несекретований mNGAL.
- Було проведено тест для визначення значущості між групами (n=3). * p < 0.05; *** p < 0.001 порівняно з контрольною групою; # p < 0,05 порівняно з групою pN + LS
каспази{{0}} (A) і розщепленого-/pro-PARP (B), ніж у контрольній групі, яка представляла індукцію апоптозу секретованим mNGAL. Клітини pN − LS не мали істотної різниці у співвідношенні розщепленої/про-каспази-3 та розщепленої/про-PARP порівняно з контрольною групою. Клітини pN + LS мали вище співвідношення LC3B II/LC3B I (C) і нижче співвідношення p62 (D) порівняно з контрольною групою. Клітини pN-LS не мали істотної різниці у співвідношенні LC3B II/LC3B I та p62 порівняно з контрольною групою. Тубулін, вінкулін і GAPDH використовували як внутрішній контроль кожного зразка. Значення були нормалізовані до контрольної групи. Для визначення значущості між групами (n=3) використовували t-критерій Стьюдента. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001 порівняно з контрольною групою; # p < 0,05; ## р <0,01 порівняно з групою pN + LS.
Рисунок 9. Вплив надмірної експресії білка mNGAL на апоптоз і аутофагію в клітинах 2L3. Результати Вестерн-блоттингу показали, що клітини pN + LS мали значно вищий коефіцієнт розщепленої-/про-каспази-3(A) і розщепленої-/про-PARP (B), ніж контрольна група, що вказувало на індукцію апоптозу секретованим mNGAL. Клітини pN-LS не мали істотної різниці у співвідношенні розщепленої/про-каспази-3 та розщепленої/про-PARP порівняно з контрольною групою. pN + LS-клітини мали більш високе співвідношення LC3BII/LC3B I (C) і нижче співвідношення p62 (D) порівняно з контрольною групою. Клітини pN − LS не мали істотної різниці в співвідношенні LC3B II/LC3B I та p62 порівняно з контрольною групою. Тубулін, вінкулін і GAPDH використовували як внутрішній контроль кожного зразка. Значення були нормалізовані до контрольної групи. Для визначення значущості між групами використовували t-критерій Стьюдента
(n {{0}}). * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001 порівняно з контрольною групою; # p < 0,05; ## р < 0,01 порівняно з групою pN + LS
4–8. Кількість кіст на 4 день у кожній групі використовували як контроль для розрахунку співвідношення кількості кіст. (F) Відсоток цист великого розміру в 3D-культурі контрольної групи, клітини pN + LS і pN − LS протягом днів 4–8. Для визначення значущості між групами (n=3) використовували t-критерій Стьюдента. * p < {{10}}.05; ** p < 0.01 порівняно з контрольною групою; # p < 0,05; ## р < 0,01 порівняно з групою pN + LS.
