Ліпокалін, асоційований з нейтрофільною желатиназою, демонструє сильнішу здатність пригнічувати збільшення кісти клітин ADPKD порівняно з несекретованою формою Ⅳ

4. Обговорення

У цьому дослідженні ми продемонстрували, що додавання та/або надмірна експресія секретується mNGALбілок зменшив проліферацію клітин 2L3іінгібував ріст кісти in vitro шляхом посилення апоптозуі аутофагія ізниження регуляції сигнальних шляхів, пов'язаних з проліферацією. Щоб визначити, чи можна використовувати клітини M-1, отримані з подібних локусів ниркових канальців миші, як клітини 2L3, як контрольні клітини дикого типу для клітин 2L3, фарбування M-1 і 2L3 клітин LTL лектином і було виконано DBA (рис. 1D). LTL і DBA використовувалися для ідентифікації диференційованих проксимальних канальців і збірних проток нирок миші відповідно [45,46]. Результати показують, що клітини M-1 мають подібну морфологію (рис. 1C) і початок ниркових канальців (рис. 1D) з клітинами 2L3; отже, лінію клітин M-1 було обрано як контроль дикого типу для клітин 2L3.

НОВІ ТРАВИ ДЛЯADPKD(ПОЛІКІСТОЗ НИРОК)

У більшості клінічних випадків пацієнти з ADPKD демонструють вищі рівні NGAL у сечі, ніж нормальні люди [19,47–49]. Мишача модель ADPKD, використана в цьому дослідженні, також має вищі рівні експресії NGAL і NGAL-R [31]. Результати як RT–qPCR, так і вестерн-блоттингу показали, що клітини 2L3 експресували вищі рівні NGAL, ніж лінія клітин дикого типу M-1 (рис. 1F, H), тоді як не було виявлено істотної різниці в рівні експресії NGAL-R між дві клітинні лінії (рис. 1G, H), що не узгоджується з результатами in vivo [31]. Ця різниця може бути пов’язана зі складною взаємодією в тканинах миші, яка не відбувається в набагато простішій клітинній системі.

Результати вестерн-блоттингу показали, що пряме введення та/або генетична надмірна експресія mNGAL у 2L3 пригнічує шлях ERK. Як показано на малюнках 4A та 8A, сигнал p-ERK1 (44 кДа) був слабшим, ніж p-ERK2 (42 кДа), тоді як ERK1 (44 кДа) був інтенсивнішим, ніж ERK2 (42 кДа), викликаючи помітне збільшення p-ERK2/ERK2 порівняно з p-ERK1/ERK1 у всіх експериментальних групах. ERK1 і ERK2 є двома ізоформами ERK, які, як припускають, мають різний вплив на проліферацію клітин [50]. Встановлено, що ERK1 індукує виживання та ріст клітин; однак ERK2 сприяє диференціації клітин і блокує ріст клітин [51]. У нашому дослідженні співвідношення p-ERK2/ERK2 було помітно вищим, ніж p-ERK1/ERK1 у всіх групах, що вказувало на те, що клітини мали тенденцію до диференціації та зниження росту. Однак як додавання, так і надмірна експресія mNGAL різко знизили співвідношення як p-ERK1/ERK1, так і p-ERK2/ERK2 порівняно з контрольною групою та призвели до значно нижчого співвідношення p-ERK/ERK, що вказує на ефект mNGAL у пригніченні проліферації клітин.

Щоб створити тривимірну культуральну платформу для характеристики та оцінки лікування утворення кісти в клітинах 2L3, було використано кілька умов. Було продемонстровано, що концентрація Matrigel для 3D-культури впливає на відсоток структурних кіст і канальців, утворених in vitro [25,52,53]. У нашому дослідженні ми виявили, що 40% Matrigel є найкращою формулою для демонстрації оптимального формування кістової структури клітин 2L3. Було кілька умов, включаючи вбудовані шаблони та шаблони на вершині для 3D-культур [54]. Ми обрали метод «нагорі» (схема типу сендвіча) для кращого та легшого способу аналізу кіст (рис. 6). Проте наш досвід показав, що кісти клітин 2L3 не були достатньо великими, якщо їх культивували без будь-якого індуктора в 3D-культурі до 14-го дня. Форсколін зазвичай використовується для індукції утворення кісти шляхом активації аденілілциклази (AC) для збільшення циклічного аденозинмонофосфату (cAMP). [11,55]. Тому в нашому дослідженні ми використовували форсколін (20 мкМ), щоб викликати утворення кісти в клітинах 2L3 перед психічним лікуванням.

Наше попереднє дослідження показало, що надмірна експресія нирково-специфічного NGAL у мишей 2L3 може уповільнити прогресування ADPKD шляхом зменшення розміру кісти, але не кількості кіст у мишей 2L3 [31]. У цьому дослідженні додавання психіки істотно пригнічувало збільшення кісти клітин 2L3 шляхом пригнічення діаметра кісти, площі та відсотка великих кіст (рис. 6F, G, I), тоді як не було істотної різниці в зростанні загальної кількості кіст. номер кісти (рис. 6H). Результати прогресування кісти 2L3 у 3D культурі узгоджувалися з результатами in vivo. Однак лікування mNGAL пригнічувало ріст кісти клітин 2L3 у 3D-культурі, тоді як ми використовували вищу концентрацію mNGAL (2 мг/мл) (рис. 6), ніж у попередніх 2D-експериментах (600 мкг/мл) для аналізу MTT для дослідження вплив mNGAL на життєздатність клітин (рис. 3). Ми припустили, що рекомбінантний mNGAL, очищений з E. coli, не мав посттрансляційної модифікації [56,57], що призвело до низької біоактивності рекомбінантного mNGAL. Надмірна експресія NGAL у клітинах 2L3 шляхом трансфекції конструкцій pN + LS і pN − LS може допомогти з’ясувати це питання.

Щоб визначити, чи була вища концентрація mNGAL (2 мг/мл), що використовується в 3D-культурі для придушення збільшення кісти клітин 2L3 (рис. 6), результатом відсутності посттрансляційної модифікації mNGAL, і перевірити, чи повинен NGAL секретуватися та взаємодіяти з NGAL-R для індукування апоптозу та подальшого пригнічення прогресування кісти конструкції pN + LS і pN − LS трансфікували в клітини 2L3 для надмірної експресії секретованих і несекретованих білків NGAL (рис. 7). Об’єднані трансфіковані клітини збирали через тиждень після селекції бластицидином, і трансфекція pN + LS і pN − LS значно підвищувала рівні експресії мРНК Lcn2 (загальний, включаючи як ендогенний, так і екзогенний NGAL) і Lcn2-c-myc (екзогенний NGAL) порівняно з контрольною групою (Малюнок 7F, G), і не було значної різниці в Lcn2 і Lcn2-c-myc між групами pN + LS і pN − LS (Малюнок 7F, G). Експресія Lcn{{20}}myc у групах pN + LS і pN − LS була приблизно в 8500-разів більшою, ніж у клітинах 2L3 (рис. 7G); однак експресія Lcn2 у pN + LS і pN − LS була приблизно в 1.5-раз більше, ніж у клітинах 2L3 (рис. 7F). Теоретично Lcn2-myc не був присутній у клітинах 2L3, що призвело до низьких рівнів експресії (фонового) за RT-QPCR. У результаті відносне співвідношення Lcn2-myc у клітинах pN + LS і pN − LS було помітно вищим (приблизно в 8500 разів), ніж у контрольній групі 2L3, що призводить до великої різниці між відносним співвідношенням Lcn2 і Lcn2-myc. Крім того, співвідношення експресії Lcn2 у клітинах pN + LS і pN − LS (pN + LS становило 0.91-кратніше, ніж у pN − LS) було подібним до співвідношення Lcn2-c-myc (pN + LS становив 1.01-збільшення pN − LS у рази) (Рис. 7F, G). Експресія внутрішньоклітинного білка NGAL у клітинах pN + LS і pN − LS була збільшена порівняно з такою в контрольній групі (рис. 7I), і не було істотної різниці між групами pN + LS і pN − LS. Результати Вестерн-блоттингу для загальної експресії білка NGAL у групах pN + LS і pN − LS (pN + LS було 0.92-кратніше, ніж у pN − LS) (рис. 7I) узгоджувалися з результатами RT–qPCR (pN + LS дорівнює 0.91-збільште значення pN − LS) (Малюнок 7F). Згідно з цими результатами, рівні білків NGAL (як загальних, так і екзогенних) у клітинах pN + LS і pN − LS були подібними, що вказувало на те, що дві групи слід порівнювати в подальших експериментах.

Ми передбачили, що надмірна експресія NGAL без сигнального пептиду не збільшить секрецію NGAL, незважаючи на високий рівень внутрішньоклітинної експресії NGAL. Однак результати ELISA з використанням супернатанту з культури показали, що клітини pN + LS і pN − LS мали значно вищі рівні секретованого NGAL, ніж контрольні клітини 2L3 (рис. 7J), тоді як кількість NGAL, секретованого клітинами pN − LS був значно нижчим, ніж у клітин pN + LS (Фігура 7J). Ці результати показали, що надмірна експресія NGAL без сигнального пептиду (pN - LS) дійсно обмежувала секрецію NGAL, хоча в клітинах були виявлені високі рівні внутрішньоклітинної мРНК і білка NGAL (Рис. 7F, I). Результати включення BrdU показали значно вищу проліферацію клітин pN - LS, ніж клітин pN + LS (рис. 7K).

Внутрішньоклітинні та секреційні кількості NGAL були приблизно в 16-рази та 2.2-рази вище в pN + LS, ніж у клітинах 2L3 відповідно (рис. 7I, J), що могло призвести до інгібування pN + LS порівняно з проліферацією клітин 2L3 (Малюнок 7K). Однак внутрішньоклітинні та секретовані кількості NGAL у клітинах 2L3 були приблизно в 4-рази та 5.3-разів вище, ніж у клітинах M-1 відповідно (рис. 1H, I), тоді як вищі проліферація клітин спостерігалася в клітинах 2L3, ніж у клітинах M-1 (рис. 2C). Ми підозрюємо, що підвищена експресія та секреція NGAL, які відіграють захисну роль у клітинах 2L3, недостатня для інгібування клітинної проліферації в результаті нокауту Pkd1, але підвищена експресія та секреція NGAL у pN + LS забезпечує додатковий NGAL для досягнення придушення проліферації. У нашому попередньому дослідженні миші Pkd1L3/L3 мали значно вищі ниркові рівні білка NGAL і ядерного антигену проліферуючих клітин (PCNA), ніж миші Pkd1+/+ [31]. Незважаючи на це, нирковий рівень протеїну NGAL у мишей Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg був приблизно в 2-рази більшим ніж у мишей Pkd1L3/L3 × NGAL+/+, а надмірна експресія NGAL призвела до помітно нижчих рівнів PCNA у Pkd1L3 /L3 × NGALTg/Tg, ніж у Pkd1L3/L3 × NGAL+/+ мишей, і додатково пригнічував ріст кісти та подовжував дні виживання [31]. Здається, NGAL відіграє захисну роль у пригніченні підвищеної проліферації в моделях ADPKD, тоді як ендогенна експресія NGAL є недостатньою, і додатковий екзогенний NGAL може допомогти.

Відповідно до результатів 3D-культивування (рис. 10), групи pN + LS і pN − LS пригнічували ріст кісти шляхом зменшення діаметра (рис. 10C), площі (рис. 10D) і відсотка великих кіст (діаметр > 100 мкм) (Малюнок 10F), але не цифри (Малюнок 10E). Цей висновок суперечить нашій підозрі, що тільки pN + LS, але не pN - LS, пригнічує збільшення кісти, оскільки секреція mNGAL з клітин 2L3 необхідна для інгібування проліферації клітин. Однак інгібування збільшення кісти за допомогою pN − LS було слабшим, ніж pN + LS (рис. 10B–D), що показало, що надмірна експресія секретованого mNGAL має кращу здатність інгібувати збільшення кісти клітин 2L3 у 3D-культурі, ніж несекретований mNGAL . Хоча ми бачимо сильніше пригнічення збільшення кісти в групі pN + LS порівняно з групою pN − LS у 3D культурі, важко побачити кращий ефект pN + LS, ніж pN − LS у p-AKT/AKT (рис. 8B). ), p-CREB/CREB (Малюнок 8C) і p62 (Малюнок 9D). Було продемонстровано, що зчеплення NGAL і NGAL-R може секвеструвати внутрішньоклітинне залізо та додатково індукувати апоптоз [29], який пов’язаний зі стратегією виснаження заліза вродженої імунної системи проти бактеріальної інфекції [30]. Ми припустили, що секретований mNGAL індукує апоптоз у клітинах 2L3 через взаємодію з NGAL-R, тоді як несекретований mNGAL не може взаємодіяти з NGAL-R, щоб індукувати апоптоз (Рис. 9A, B). Було продемонстровано, що шляхи Ras/B-Raf/MEK/ERK [10,11] і AKT/mTOR [38] активізуються в клітинах ADPKD, що призводить до збільшення проліферації клітин і збільшення кісти. Наші результати показали, що секретований mNGAL інгібує шляхи ERK (рис. 8A) і AKT (рис. 8B), а несекретований mNGAL інактивує шлях ERK (рис. 8A). Це припускає, що розумова інактивація шляху ERK може не бути необхідною через NGAL-R. Для дослідження питання буде проведено нокаут NGAL-R у клітинах 2L3

Крім того, надмірна експресія mNGAL у клітинах 2L3 пригнічувала збільшення клітинної кісти (рис. 10) і відбувалася з відносно нижчою секрецією NGAL (2,27 нг/мл) (рис. 7J) порівняно з ефектом високої концентрації mNGAL (2 мг/мл). мл), застосовані в попередніх експериментах з 3D культурою (рис. 6). Цей результат може бути пов’язаний з відсутністю посттрансляційної модифікації mNGAL з E. coli, яка використовувалася в попередніх експериментах, які вимагали високої дози mNGAL для інгібування збільшення кісти (рис. 6). Для подальшого вивчення того, чи є посттрансляційна модифікація mNGAL фактором, відповідальним за потребу в більшій кількості рекомбінантних mNGAL з E. coli, у подальших дослідженнях буде використано кондиціоноване середовище, що містить mNGAL, виділене з клітинної лінії миші.

У цьому дослідженні клітини pN + LS і pN - LS, використані для RT–qPCR, вестерн-блоттингу, ELISA, включення BrdU та 3D-культури, були отримані зі змішаного поліклонального пулу, який мав різні рівні експресії трансгенів у змішаній популяції. Ідентифікація механізму mNGAL у клітинах ADPKD 2L3 за допомогою описаних вище методів з використанням клональних клітин повинна допомогти у пошуку стратегій для майбутнього клінічного лікування ADPKD.

5. Висновки

У цьому дослідженні ми досліджували основний механізм уповільненого прогресування кісти за присутності NGAL, використовуючи безсмертну лінію клітин ADPKD. Додавання рекомбінантного mNGAL пригнічувало проліферацію клітин ADPKD. Патологічний аналіз показав, що mNGAL зменшує проліферацію та індукує шляхи апоптозу та аутофагії в клітинах ADPKD. Крім того, була створена тривимірна платформа клітинної культури для ідентифікації прогресування кісти та показала, що додавання рекомбінантного mNGAL пригнічує збільшення кісти. Крім того, надмірна експресія секретованого mNGAL (pN + LS) мала сильніший ефект на інгібування збільшення кісти клітин ADPKD, ніж надекспресія несекретованого mNGAL (pN − LS), хоча обидві форми зменшували діаметр кісти, площу та відсоток кіст великих розмірів, а також їх вплив на проліферацію, апоптоз і аутофагію. Ми робимо висновок, що секретований mNGAL має більш виражену та стійку здатність інгібувати збільшення кісти, ніж несекретований mNGAL у клітинах ADPKD. Наша робота може допомогти визначити стратегії майбутнього клінічного лікування ADPKD.

Додаткові матеріали: Додаткові відео до цієї статті можна знайти в Інтернеті (1) Відео S1: Конструкція кісти в 3D-культурі: https://reurl.cc/Kjy8rq (дата доступу: 26 листопада 2021 р.); (2) Відео S2: Z-подібні зрізи кісти в 3D-культурі: https://reurl.cc/VXGY5y (дата доступу: 26 листопада 2021 р.). Додатковий графік: негативні контролі для рис. 1D (за винятком фарбування LTL і DBA) можна знайти в Інтернеті за адресою https://reurl.cc/LpMmje (дата доступу: 26 листопада 2021 р.). Авторські внески: Концептуалізація, W.-YJ, HMH-L. та Y.-YC; курація даних, H.-YC; формальний аналіз, H.-YC; придбання фінансування, HMH-L. та Y.-YC; методологія, H.-YC, W.-YJ, EW, C.-MH, HMH-L. та Y.-YC; адміністрування проекту, H.-YC і HMH-L.; ресурси, W.-YJ, S.-TJ та Y.-YC; нагляд, HMH-L.; візуалізація, H.-YC; письмово-оригінал чернетки, H.-YC і HMH-L.; написання-рецензування та редагування, H.-YC і HMH-L. Усі автори прочитали та погодилися з опублікованою версією рукопису. Фінансування: це дослідження було профінансовано грантами 107-2622-B-006-005-CC2 і 108-2622-B-006-002- CC2 від Міністерства науки і технологій (MOST) і штаб-квартири університетського розвитку з Національного університету Ченг Кунг, Тайнань, Тайвань (Юань-Йо Чіоу). Заява інституційної ревізійної ради: не застосовується. Заява про інформовану згоду: не застосовується. Заява про доступність даних: дані, отримані під час дослідження, доступні у відповідного автора за запитом. Подяка: автори вдячні за допомогу Центру молекулярних зображень Національного педагогічного університету Тайваню під егідою MOST. Ми дякуємо Національному основному центру RNAi в Academia Sinica на Тайвані за надання вірусних частинок, плазмід і пов’язаних послуг. Ми дякуємо Shu-Wen Lo за допомогу в графічному редагуванні. Конфлікт інтересів: автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів.

Список літератури

1. Bergmann, C.; Guay-Woodford, LM; Харріс, ПК; Хорі, С.; Пітерс, ді-джей; Torres, VE Полікістоз нирок. Нац. Рев. дис. Primers 2018, 4, 50. [CrossRef] [PubMed]

2. Грантам Дж. Дж. Клінічна практика. Аутосомно-домінантний полікістоз нирок. Н. англ. J. Med. 2008, 359, 1477–1485. [CrossRef] [PubMed]

3. Чепмен А.Б.; Девуйст О.; Екардт К.-У.; Gansevoort, RT; Харріс, Т.; Хорі, С.; Касіське, Б.Л.; Одланд, Д.; Пей, Ю.; Перроне, Р.Д.; та ін. Аутосомно-домінантна полікістозна хвороба нирок (ADPKD): Резюме з конференції протиріч «Захворювання нирок: покращення глобальних результатів» (KDIGO). Kidney Int. 2015, 88, 17–27. [CrossRef] [PubMed]

4. Грантам, Дж. Дж.; Муламалла, С.; Swenson-Fields, KI Чому нирки відмовляють при аутосомно-домінантному полікістозі нирок. Нац. Нефрол преподобний. 2011, 7, 556–566. [CrossRef] [PubMed]

5. Харріс, ПК; Torres, VE Генетичні механізми та сигнальні шляхи при аутосомно-домінантному полікістозі нирок. Дж. Клін. Розслідувати. 2014, 124, 2315–2324. [CrossRef] [PubMed]

6. Онг, AC; Harris, PC. Поліцистиноцентричний погляд на утворення кісти та захворювання: перегляд поліцистину. Kidney Int. 2015, 88, 699–710. [CrossRef]

7. Weimbs, T. Third-Hit Signaling in Renal Cyst Formation. J. Am. Соц. Нефрол. 2011, 22, 793–795. [CrossRef]

8. Ханаока, К.; Guggino, WB цАМФ регулює клітинну проліферацію та утворення кіст у клітинах аутосомного полікістозу нирок. J. Am. Соц. Нефрол. 2000, 11, 1179–1187. [CrossRef]

9. Старреманс, П.; Лі, X.; Фіннерті, П.; Го, Л.; Такакура, А.; Нейлсон, Е.; Zhou, J. Мишача модель полікістозу нирок через соматичну делецію в кадрі в 5'-кінці Pkd1. Kidney Int. 2008, 73, 1394–1405. [CrossRef]

10. Ямагучі, Т.; Нагао, С.; Уоллес, ДП; Белібі, Ф.А.; Cowley, BD; Пеллінг, JC; Grantham, JJ Cyclic AMP активує B-Raf і ERK в епітеліальних клітинах кіст аутосомно-домінантного полікістозу нирок. Kidney Int. 2003, 63, 1983–1994. [CrossRef]

11. Ямагучі Джил, Т.; Пеллінг, JC; Рамасвамі, NT; Епплер, JW; Уоллес, ДП; Нагао, С.; Рим, Луїзіана; Салліван, Л.П.; Grantham, JJ cAMP стимулює проліферацію in vitro епітеліальних клітин ниркової кісти шляхом активації позаклітинного сигнально-регульованого кіназного шляху. Kidney Int. 2000, 57, 1460–1471. [CrossRef] [PubMed]

12. Чжу, П.; Зібен, CJ; Сюй, X.; Харріс, ПК; Лін, X. Активатори аутофагії пригнічують цистогенез у моделі аутосомно-домінантного полікістозу нирок. гудіння мол. Жене. 2016, 26, 158–172. [CrossRef] [PubMed]

13. Белібі, Ф.; Зафар, І.; Равічандран, К.; Segvic, AB; Яні, А.; Любанович, Д.Г.; Едельштейн, К. Л. Фактор, індукований гіпоксією-1 (HIF-1 ) і аутофагія при полікістозі нирок (PKD). Am. J. Physiol.-Ren. фізіол. 2011, 300, F1235–F1243. [CrossRef] [PubMed]

14. Чун, Ю.; Кім, Дж. Аутофагія: важлива програма деградації клітинного гомеостазу та життя. Клітини 2018, 7, 278. [CrossRef]

15. Рубінштейн, DC; Шпилька Т.; Елазар, З. Механізми аутофагосомного біогенезу. Curr. Biol. 2012, 22, R29–R34. [CrossRef]

16. Мухопадхяй, С.; Панда, ПК; Синха, Н.; Дас, Д.Н.; Бхутіа, С. К. Аутофагія та апоптоз: де вони зустрічаються? Апоптоз 2014, 19, 555–566. [CrossRef]