Ліпокалін, асоційований з желатиназою нейтрофілів, демонструє сильнішу здатність пригнічувати збільшення кісти клітин ADPKD порівняно з несекретованою формою Ⅱ

3. Результати

3.1. Порівняння експресії NGAL і клітинної проліферації між клітинами M-1 дикого типу та 2L3 ADPKD

Лінія клітин 2L3 була створена шляхом трансдукції вірусом SV40 первинних ниркових епітеліальних клітин мишей Pkd1L3/L3 [17]. Клітини M-1 (лінія ниркових епітеліальних клітин миші дикого типу), придбані в BCRC (Сінчу, Тайвань), використовували як контроль. ПЛР-генотипування транскриптів Pkd1 клітин 2L3 і M-1 було проведено для перевірки генотипів за допомогою праймерів до та після першого сайту loxP в інтроні 30 цільового алеля (рис. 1A). Тканини миші Pkd1+/+, Pkd1L3/+ і Pkd1L3/L3 використовували як контроль генотипу. Продукти ПЛР з клітин M-1 показали одну смугу Pkd1+/+ дикого типу (WT) (473 bp), тоді як продукти ПЛР з клітин 2L3 показали одну смугу Pkd1L3/L3 (507 bp) завдяки додатковому сегменту loxP (34 bp) (рис. 1B).

Щоб визначити, чи походять клітини M-1 і 2L3ниркові канальці аналогічного походження, ми спочатку порівняли морфологію між 2 лініями клітин; Клітини M-1 і клітини 2L3 показали дуже схожу морфологію (рис. 1C). Крім того, було проведено фарбування лектину лектином Lotus tetragonolobus (LTL, маркером диференційованих проксимальних канальців, міченим флуоресцеїном) і агглютиніном Dolichos biflorus (DBA, маркером диференційованих дистальних канальців і збірних трубок, міченим родаміном), щоб перевірити їх походження. з ниркових канальців (рис. 1D). Результати фарбування показали, що клітини M-1 і 2L3 були як LTL- (переважно колокалізовані з DAPI), так і DBA-позитивними (локалізовані в цитоплазмі) (рис. 1D). Цей результат припустив, що клітини M-1 і 2L3 походять зниркових канальцівсхожого походження та можуть мати схожі характеристики. Результати ПЛР у реальному часі показали, що клітини 2L3 мали значно знижені рівні експресії мРНК Pkd1 порівняно з клітинами M-1 (рис. 1E), що узгоджується з даними мишей 2L3 з рівнями експресії білка Pkd1 лише на 25% у мишей дикого типу [17]. Було продемонстровано, що у мишей 2L3 рівень білка NGAL і рецептора NGAL (NGAL-R) у нирках вище, ніж у мишей дикого типу [31]. Результати ПЛР у реальному часі показали, що рівень експресії мРНК Lcn2 був у 1596-разів більшим у клітинах 2L3, ніж у клітинах M-1 (рис. 1F), що узгоджується з даними, наданими для мишей 2L3 [31], тоді як не було значної різниці в експресії мРНК Slc22a17 між двома групами (рис. 1G). Результати вестерн-блоттингу також показали, що клітини 2L3 мали вищий рівень експресії NGAL, ніж клітини M-1, тоді як не було значної різниці в рівні експресії NGAL-R між двома групами (рис. 1H). Клітини та супернатанти клітин M-1 і 2L3 збирали після культивування протягом 48 годин для кількісного визначення NGAL у клітинних лізатах і супернатантах (що представляють секретований NGAL) за допомогою ELISA. Відповідно до результатів вестерн-блоттингу, ELISA показав, що 2L3 мав значно вищі внутрішньоклітинні NGAL і секрецію NGAL у супернатанті, ніж M-1 (рис. 1I).

Було продемонстровано, що миші 2L3 демонструють вищу проліферацію клітин, ніж миші дикого типу [17]. Були проведені аналізи включення MTT і BrdU, щоб дослідити, чи клітинна лінія 2L3 також показала кращу життєздатність і проліферацію, ніж клітини дикого типу (Рис. 2A–C). Репрезентативні зображення показали більше злиття клітин 2L3, ніж клітин M-1 після культивування протягом 48 годин з однаковою початковою кількістю посівів (рис. 2A). Аналізи MTT показали, що клітини 2L3 мають значно кращу життєздатність, ніж клітини M-1, культивовані протягом 24 і 48 годин (рис. 2B). Щоб порівняти здатність до проліферації клітин M-1 і 2L3, клітини культивували протягом 24 годин після аналізу включення BrdU, який показав, що клітини 2L3 мають значно кращу проліферацію, ніж клітини M-1 (рис. 2C). .

НОВІ ТРАВИ ПРИ ХВОРОБАХ НИРОК

3.2. Вплив додавання mNGAL на життєздатність і проліферацію клітин 2L3

Було показано, що введення екзогенного NGAL зменшує ріст кіст in vitro [25]. Наше попереднє дослідження показало, що надмірна експресія NGAL у моделі миші з ADPKD (Pkd1L3/L3; миші NGALTg/Tg) зменшує прогресування кісти, що супроводжується змінами в ряді молекулярних шляхів, залучених допроліферація клітин, апоптоз, іфіброз[31]. Тому ми досліджували вплив рекомбінантного mNGAL на життєздатність клітин 2L3 за допомогою аналізу MTT (рис. 3). Чистоту рекомбінантного mNGAL (без сигнального пептиду), очищеного з E. coli, спочатку визначали за допомогою SDS-PAGE та фарбування кумасси синім, що виявило одну смугу 20-kD і дуже світлу смугу димера при високих концентраціях ( малюнок 3A). Крім того, стабільність mNGAL у культуральному середовищі клітин аналізували за допомогою вестерн-блоттингу, який продемонстрував стабільність mNGAL у середовищі протягом щонайменше 48 годин (Фігура 3B). Ми помітили, що mNGAL значно знизив життєздатність клітин 2L3 порівняно з контрольною групою після лікування протягом 8 годин (рис. 3C). Рапаміцин використовувався як позитивний контроль у цьому експерименті, який визнаний інгібітором mTOR і, як відомо, пригнічує проліферацію епітеліальних клітин і ріст кіст у мишачої моделі PKD [32]. Крім того, аналіз включення BrdU також показав, що лікування mNGAL протягом 24 годин значно пригнічувало проліферацію клітин 2L3 (рис. 3D). Клітинна проліферація є ключовою особливістю ADPKD, і виявлення того, що проліферацію клітин 2L3 можна зменшити за допомогою mNGAL, свідчить про те, що mNGAL може додатково пригнічувати утворення кіст у клітинах 2L3.

3.3. Сигнальні шляхи, на які впливає додавання mNGAL до клітин 2L3

Було показано, що зчеплення NGAL і NGAL-R секвеструє внутрішньоклітинне залізо та додатково індукує апоптоз [29]. Крім того, дослідження показали, що NGAL може індукувати апоптоз у моделі ADPKD in vitro та in vivo [25,31]. Щоб дослідити, чи може mNGAL індукувати апоптоз клітин 2L3, ми проаналізували апоптоз клітин 2L3 методом проточної цитометрії. Ґрунтуючись на висновках про те, що mNGAL пригнічує проліферацію клітин 2L3 після лікування mNGAL протягом 8 годин (рис. 3D), ми проаналізували вплив mNGAL на клітини 2L3 як на більш ранніх (4 год), так і на пізніх (12 год) точках часу.

Для аналізу проточною цитометрією були потрібні значно більші кількості клітин і менша тривалість культивування, ніж для попередніх аналізів МТТ; отже, клітини 2L3 висівали на 6-планшети з лунками, і до клітин застосовували вищу концентрацію mNGAL (600–1200 мкг/мл). Результати показали, що 1200 мкг/мл mNGAL значно пригнічує життєздатність клітин через 4 та 12 годин лікування, тоді як 600 мкг/мл mNGAL пригнічує життєздатність клітин лише через 4 години лікування (рис. 3E). Аналіз апоптозу проводили за допомогою проточної цитометрії для виявлення клітин, пофарбованих аннексином V-FITC і PI. Анексин V має високу спорідненість до фосфатидилсерину (ФС) і використовується для ідентифікації апоптотичних клітин із відкритим ФС [33]. За результатами фарбування клітини можна класифікувати як нормальні (AV−/PI−), ранній апоптоз (AV+/PI−), пізній апоптоз (AV+/PI+) і некроз (AV−/PI+) і показані на квадратичні діаграми (рис. 3F). Клітини на стадії раннього апоптозу зберігають інтактні мембрани, що відрізняється від клітин на стадії пізнього апоптозу з дезінтегрованими мембранами [34]. Результати показали, що швидкість апоптозу клітин 2L3 (включаючи ранній AV+/PI- та пізній AV+/PI+ апоптоз) була значно збільшена порівняно з показниками контрольної групи після 12 годин лікування mNGAL (1200 мкг/мл; рис. 3F, G). ).

малюнок 1. Порівняння експресії NGAL між клітинами M-1 дикого типу та 2L3 ADPKD. (А) Структура алелів дикого типу та L3 гена Pkd1. ПЛР-генотипування проводили з використанням праймерів до і після першого loxP в інтроні 30 Pkd1. Зафарбовані трикутники: loxP; керований промотором mc1 ген стійкості до неоміцину (mc1-neo), фланкований двома сайтами loxP, був вставлений в інтрон 34 Pkd1. (B) ПЛР-генотипування транскриптів Pkd1 клітин M-1 (473 bp) і клітини 2L3 (507 bp). Транскрипти Pkd1 мишей дикого типу (+/+), гетерозиготних (L3/+) і гомозиготних (L3/L3) мишей використовували як контроль. RT–qPCR показала, що 2L3 має значно нижчий Pkd1 (C) M-1, а клітини 2L3 мають подібну морфологію. Шкала: 100 мкм. (D) Клітини M-1 і 2L3 пофарбували лектином Lotus Tetragonolobus (LTL, позначений флуоресцеїном, зелений) і агглютиніном Dolichos biflorus (DBA, позначений Rhoda mine, червоний) і DAPI (синій) і спостерігали за допомогою конфокальний мікроскоп. Шкала: 50 мкм. RT–qPCR показала, що 2L3 має значно нижчі рівні експресії Pkd1 (E) і вищі Lcn2 (NGAL) (F), ніж клітини дикого типу M-1. (G) Немає істотної різниці в рівнях експресії Slc22a17 (NGAL-R) між клітинами M-1 і 2L3. RQ: відносна кількісна оцінка=2 −ΔΔCt; Gapdh використовували як внутрішній контроль кожного зразка. Значення були нормалізовані до M-1. (H) Результати Вестерн-блоттингу показали, що 2L3