Складання транскриптома De Novo на основі РНК-Seq і виявлення гена м’ясистого стебла Cistanche Deserticola-Ⅱ

Функціональна класифікація всіх експресованих транскриптів на основі генної онтології та баз даних KEGG

Анотацію генної онтології (GO) було отримано з файлу асоціації анотацій UniProt та ідентичностей. Загалом 20 907 транскриптів, що становить 32,69% від загальної кількості виражених послідовностей, було віднесено до 1 745 функціональних термінів. Із загальної кількості функціональних термінів GO приписування до біологічного процесу становило більшість (1116, 63,95%), потім клітинний компонент (329, 18,85%) і молекулярна функція (300, 17,20%). Призначені функції експресованих транскриптів охоплювали широкий діапазон категорій GO, а 10 найкращих термінів GO з найбільшою кількістю анотованих транскриптів були перераховані в таблиці 3. Ми надаємо розподіл усіх експресованих транскриптів у трьох категоріях онтології генів (молекулярна функція, клітинний компонент і біологічний процес) у додатковому файлі (набір даних S3). Терміни GO, пов'язані з функціями зв'язування та активністю трансферази, були переважно представлені в категорії молекулярних функцій. Щодо функцій зв’язування, зв’язування катіонів (4394 транскриптів) було найпоширенішим, за ним йдуть зв’язування нуклеотидів/нуклеозидів (в середньому 3404 транскриптів) і зв’язування з білками (2422 транскриптів). Тоді як у групі трансферазної активності найбільше тих, що мають перенесення фосфорвмісних груп (2256 транскриптів, 65,77%). Серед категорії клітинних компонентів транскрипти були більш розташовані внутрішньоклітинно (в середньому 10 581 транскриптів), тоді як серед категорії біологічних процесів транскрипти були більш залучені в метаболічний процес біополімерів (в середньому 6683 транскриптів), за якими йшла регуляція клітинного процесу (4841 транскриптів). ), експресія генів (4678 транскриптів) і транспорт (3512 транскриптів).

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИ ХВОРОБИ АЛЬЦГЕЙМЕРА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Для визначення генів, які беруть участь у біосинтезі лігніну та PhG, було проведено пошук 21 358 ненадлишкових потенційних білкових послідовностей у порівнянні з генними послідовностями 13 рослинних організмів у базі даних KEGG, і вони були призначені 275 шляхами KEGG із принаймні 5 збігами. Перші 10 шляхів із найбільш вирівняними послідовностями наведені в таблиці 4. Більшість шляхів брали участь у первинних метаболічних процесах, таких як амінокислотний або білковий метаболізм (ko01230, ko04141 і ko04120), вуглеводний метаболізм (ko01200 і ko00500) і нуклеотидний або метаболізм нуклеозидів (ko03018, ko00230 і ko00240). Крім того, існує 27 вторинних шляхів, пов’язаних з метаболізмом (рис. 2), таких як біосинтез терпеноїдного остова, біосинтез фенілпропаноїдів, біосинтез каротиноїдів, біосинтез ізохінолінових алкалоїдів та біосинтез алкалоїдів тропану, піперидину та піридину. Ці результати ще більше вказують на те, що в організмі відбувалися активні метаболічні процесиC. deserticolaстовбурові тканини. Усі експресовані стенограми, пов’язані з шляхами KEGG, були перераховані в додатковому файлі (набір даних S4). Хоча існують деякі суттєво змінені шляхи між C. deserticola та іншими рослинами, такими як рис (набір даних S5), наша головна мета в цьому дослідженні полягає в тому, щоб виявити весь профіль транскриптома стебла C. deserticola та відобразити пов’язані шляхи біосинтезу PhGs. які можуть бути корисними для керівництва вирощуванням.

Гени-кандидати, що кодують ферменти, що беруть участь у біосинтезі лігніну

Лігнін є другим за поширеністю природним земним полімером у царстві рослин, що становить до однієї третини матеріалу, що міститься в клітинних стінках рослин. Будучи важливим компонентом клітинних стінок, лігніни допомагають транспортувати воду, забезпечують механічну підтримку та структурну цілісність, а також захищають від патогенів і травоїдних тварин. Ці ролі лігніну є дуже цінними для підтримки підземного ерекційного росту C. deserticola в пустелі. У цьому дослідженні ми представили повну картину шляхів біосинтезу лігніну в C. deserticola (рис. 3), у якому мономери лігніну біосинтезуються з фенілаланіну через низку ферментативних реакцій, включаючи гідроксилювання, метилювання, відновлення та процес окисної полімеризації. Ферменти, пов’язані з біосинтезом лігніну, були виявлені для трьох головним чином синтезованих форм у судинній тканині (п-гідроксил-феніл (H), гваяцил (G) і сирингіл (S) лігнін) і 5-гідроксил-гваяцил лігнін, який був ідентифікований лише у рослинах з дефіцитом COMT (кавової кислоти 3-O-метилтрансферази, EC 2.1.1.68), таких як нокдаун.

Фенілаланін-аміак-ліаза (PAL, EC 4.3.1.24) є першим ключовим ферментом у шляху біосинтезу лігніну (рис. 3), який перетворює фенілаланін у коричну кислоту шляхом неокислювального дезамінування. Загалом у C. deserticola було секвеновано 6297 зчитувань PAL і зібрано 7 транскриптів PAL (Таблиця 5). Шляхом порівняння подібності послідовностей ми виявили, що 4 з них (comp28550_c1_seq1/2/3/5) мають понад 95% подібності з відомою послідовністю мРНК C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), тоді як comp28550_c1_seq4 і comp25940_c0_seq1 мали 77% і 82% подібності відповідно. Прогноз ORF виявив, що 5 транскриптів мали потенціал кодування білків і переносилися з ліазним доменом ароматичних амінокислот (PF00221.14). Серед них лише транскрипт comp28550_c1_seq4 міг кодувати повну білкову послідовність із 718 амінокислотних залишків. Повідомлялося, що PAL кодувався невеликою мультигенною родиною у більшості видів рослин, таких як 4 у Arabidopsis thaliana, 5 у Populus trichocarpa, 3 у Scutellaria baicalensis та 7 у Cucumis sativus тощо. Наш філогенетичний аналіз показав, що було 4 Гени, що кодують PAL, у C.

deserticola, і ми назвали їх CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 і CdPAL4 відповідно (S2 рис.). 4-кумарат-КоА-лігаза (4CL, EC 6.2.1.12) і транс-циннамат 4-монооксигеназа (CYP73A, EC 1.14.13.11) є двома ферментами, відповідальними за перетворення коричної кислоти в дикумарол-КоА двома зворотними шляхами замовлення. Вони також є в хребтах, і їх експресія FPKM становить 39,57 і 51,93 відповідно.

Чотири типи лігнінів були біосинтезовані різними шляхами, які контролювалися трьома ключовими ферментами: циннамоїл-КоА-редуктазою (CCR, EC 1.2.1.44), шикімат-о-гідроксициннамоїлтрансферазою (HCT, EC 2.3.1.133) і ферулатом{{1{ {56}}}}гідроксилаза (F5H, EC 1.14.-.-). Повідомлялося, що CCR є контрольною точкою шляху лігнінів [50, 51], який каталізує X-CoA (X, включаючи дикумарол, кофеоїл, ферулоїл, 5-гідроксил-ферулоїл і синапоїл) у Y-альдегід (Y, включаючи p -кугар, кофеоїл, коніферил, 5-гідроксил-коніферил і снап), тоді як HCT каталізує p-кумароїл-CoA до p-кумароїл шикімової кислоти/p-кумароїл хінні кислоти. Два ферменти, як перемикач, регулюють біосинтез P-гідроксил-феніллігнінів або інших трьох типів лігнінів. F5H був іншим перемикачем гілок, який регулював сирингіллігнін і 5-гідроксил-гваяциллігнін. Інші важливі ферменти, зокрема 3-O-метилтрансфераза кавової кислоти (COMT, EC 2.1.1.68), кофеоїл-CoA O-метилтрансфераза (CCoAOMT, EC 2.1.1.104) і дегідрогеназа цинамілового алкоголю (CAD, EC 1.1.1.195) ) також були виявлені виражені. Детальна інформація про експресію наведена в таблиці 6. Ці гени ферментів, виявлені в цьому дослідженні, стануть цінним ресурсом для функціональних геномних досліджень цієї важливої ​​лікарської рослини. 10 генів, пов’язаних із шляхом біосинтезу лігнінів у таблиці 6, були відібрані для верифікації RT-qPCR, щоб підтвердити наші результати RNAseq (рис. 4), і їхні високі кореляції (коефіцієнт кореляції Пірсона: 0,90343) вказують на високу точність і відтворюваність нашого аналізу транскриптомів. Набір даних S1 містить перелік послідовностей праймерів, використаних у цьому аналізі.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ СТАТЕВОЇ ФУНКЦІЇ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Гени-кандидати, що кодують ферменти, що беруть участь у біосинтезі PhG

Відомо, що фенілетаноїдні глікозиди (PhGs) є основними активними інгредієнтами C. deserticola, які покращують сексуальну потенцію, поглинають вільні радикали та запобігають старінню. Три хімічні компоненти PhGs: органічна кислота, сахарид і фенілетанол-аглікон (рис. 3). Органічні кислоти, включаючи кавову кислоту, ферулову кислоту та кумалову кислоту, є продуктами шляху біосинтезу фенілпропаноїдів. Компоненти сахариду, включаючи глюкозу та рамнозу, є продуктами метаболізму вуглеводів, таких як метаболізм крохмалю та сахарози, метаболізм аміноцукру та нуклеотидного цукру, метаболізм фруктози та манози тощо. Однак шлях біосинтезу фенілетанолової частини ще не ясний. Тут ми запропонували два можливих шляхи біосинтезу фенілетанолу на основі наших даних послідовності. Одним з них є шлях кавової кислоти або ферулової кислоти, також відомий як шлях коричної кислоти, який подібний до магістрального шляху біосинтезу лігніну. Інший заснований на метаболічному шляху фенілаланіну (рис. 3), у якому фенілаланін перетворювався на фенілетанол за допомогою відомого «шляху Енріха», який вперше був виявлений у дріжджах сто років тому та підтверджений у квітах петунії, помідорів і троянд. Чотири гени ферменту, що кодують аспартат/тирозин амінотрансферазу, гістидин-фосфат амінотрансферазу та первинну аміноксидазу, які відповідають за перетворення фенілаланіну на фенілетанол, були виявлені в стеблі C. deserticola. Продукт фенілетанолу може бути додатково окислений монооксигеназою або метильований метилтрансферазою в його похідні (фенілэтанол-аглікон), які беруть участь у біосинтезі PhG. Підводячи підсумок, було запропоновано два передбачуваних шляхи біосинтезу аглікону фенілетанолу дляC. deserticolaале все ще потребує додаткового вивчення в подальшому.

дискусії

В останні роки геноміка рослин стрімко розвивалася із застосуванням технології секвенування наступного покоління, тоді як мало досліджень було зосереджено на геноміці пустельних лікарських рослин. Терміново необхідно виконати геномне або транскриптомне дослідження, щоб зрозуміти його адаптацію до посухи та засолення середовища та шлях біосинтезу основних біоактивних компонентів. Відкриття транскриптомів de novo для деяких лікарських рослин,

такі як Panax ginseng, Ginkgo biloba та Glycyrrhiza uralensis були вперше використані за допомогою платформи Roche 454 через її тривалість читання. Завдяки ефективній здатності збирання з короткими зчитуваннями, особливо сприятливим зчитуванням парних кінців, секвенування та збирання транскриптомів на основі Illumina також широко використовувалися для модельних і немодельних організмів. У цьому дослідженні ми згенерували близько 8G з 101 bp зчитування парних кінців і створили довші одногенні послідовності із середньою довжиною 725 bp. Широкомасштабні стебло-специфічні транскриптомні дані можуть надати корисні довідкові дані та використовуватися для визначення вторинного метаболізму біоактивних компонентів C. deserticola. 81,62% із загальної кількості необроблених зчитувань пройшли суворі фільтри якості (включно з обрізанням адаптера та відкиданням зчитувань низької якості) перед складанням, що свідчить про високу якість наших даних секвенування, а 82,08% високоякісних зчитувань були корисними для складання. Інші зчитування, які не вдалося використати для складання, можуть походити від помилок послідовності, параметрів складання тощо. Ці невикористані високоякісні зчитування залишалися корисними для вдосконалення складання de novo в поєднанні з довшими зчитуваннями з іншої платформи (наприклад, Roche 454) у майбутньому.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ СТАТЕВОЇ ФУНКЦІЇ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Велика кількість зібраних транскриптів (30 098) продемонструвала високу схожість послідовностей з відомими генами в публічних базах даних, що свідчить про те, що наші дані парних кінців на основі Illumina охоплюють значну частину транскриптів C. deserticola. Транскрипти без збігів BLAST можуть бути пов’язані з 3' або 5' нетрансльованими ділянками, некодуючою РНК або новими генними послідовностями C. deserticola. Експресовані стенограми були анотовані до широкого діапазону категорій GO та шляхів KEGG (таблиці 3 та 4), у яких багато транскриптів були віднесені до вторинних шляхів, пов’язаних з метаболізмом. Як ми знаємо, фенілпропаноїд може функціонувати як індукована антимікробна сполука з великою користю для підземного способу життя [1], а також діяти як сигнальна молекула у взаємодіях між рослинами та мікробами, окрім своєї медичної користі [68, 69]. Терпеноїд використовується для біосинтезу біоактивних компонентів (таких як 6- дезоксикатальпол) [70]. Ми виявили, що гени, задіяні в шляху біосинтезу фенілпропаноїдів і терпеноїдів, були дуже поширені в C. deserticola. Що більш важливо, відкриття добре представлених шляхів біосинтезу лігніну (рис. 3) вказує на активний метаболічний процес лігніну в стеблі C. deserticola. Було виявлено експресію всіх відомих генів ферментів, які беруть участь у біосинтезі лігніну (рис. 3), і чотири ключові ферменти, включаючи PAL, CCR, HCT і F5H, мали нижчу експресію (FPKM 26,47, 3,89, 3,4 і 3,83 відповідно) порівняно з інші гени ферментів (табл. 6). Чи може зміна експресії цих трьох генів впливати на виробництво лігніну в C. deserticola, заслуговує на подальше вивчення. PAL є ключовим ферментом у біосинтезі лігніну, а також бере участь у біосинтезі фенілпропаноїду, ресвератролу, флавоноїду та кумарину [71–74]. Ми виявили чотири різні гени PAL у геномі C. deserticola (S2, рис.), що збігалося з тим, що PAL кодувався невеликою родиною мультигенів [39, 43, 45–49], і додатково довели, що він може відігравати важливу роль у метаболічному потоці вуглецю. .

PhG є основним активним інгредієнтом C. deserticola. Гени, які беруть участь у біосинтезі фенілетанолу, важливі для якості C. deserticola. Ми вивели два різні шляхи біосинтезу фенілетанолу та 17 генів ферментів, залучених до біосинтезу PhG у стеблі C. deserticola. Можливі процеси після кавової/ферулової кислоти (рис. 3) також були вперше виведені на основі структурної формули проміжних продуктів і каталітичних властивостей відповідних ферментів, у яких кавова/ферулова кислота спочатку окислюється до похідного фенілпірувату; потім карбоксильна група була позбавлена ​​декарбоксилазами; нарешті, альдегідна група була перетворена назад у спиртову групу дегідрогеназою. Це перше застосування технології парного секвенування Illumina для дослідження всього транскриптома C. deserticola та збирання зчитувань РНК-seq без еталонного геному. Це дослідження надасть корисні ресурси та послідовності генів для дослідження функціональної геноміки та протеоміки C. deserticola в майбутньому.

Висновки

У цьому дослідженні ми профілювали транскриптом стебла C. deserticola на основі даних високопродуктивного секвенування, визначили гени, залучені в шляхи біосинтезу лігніну, а також вперше зробили висновок про потенційний шлях біосинтезу PhG, що, безумовно, прискорить розуміння неоднозначних фізіологічних процесів і великої медичної цінності на молекулярному рівні. На даний момент це перша спроба de novo зібрати весь транскриптом стебла C. deserticola та виявити шлях біосинтезу лікарських компонентів за допомогою наборів даних секвенування на основі Illumina. Наше дослідження може сприяти розробці природних ліків і відбору культурних сортів з лікувальними властивостями.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ СТАТЕВОЇ ФУНКЦІЇ PHGS75% ECH 30% ACT 12%