Рапаміцин альтернативно змінює мітохондріальну динаміку в дендритних клітинах, щоб зменшити ішемічне реперфузійне пошкодження нирок
Feb 22, 2022
Анотація:Дендритні клітини (ДК) є унікальними імунними клітинами, які можуть зв’язувати вроджену та адаптовану імунні відповіді, і імунометаболізм сильно впливає на їхній фенотип. Рапаміцин є макролідною сполукою, яка має імунодепресивні функції та використовується для запобігання втрати трансплантата при трансплантації нирки. Поточне дослідження оцінювало терапевтичний потенціал DC, оброблених ex-vivo рапаміцином, для захистуниркиу мишачій моделі акутураження нирок (AKI). Для одноразової (S) обробки рапаміцином (Rapa-S-DC) Veh-DC обробляли рапаміцином (10 нг/мл) протягом 1 години перед LPS. Навпаки, багаторазове лікування рапаміцином (M) (Rapa-M-DC) було піддано 3 процедурам протягом 7 днів. Тільки багаторазове лікування DC рапаміцином ex-vivo викликало стійке перепрограмування мітохондріального метаболізму. Ці ДК мали 18-раз більше мітохондрій, мали майже 4-рази вищі показники споживання кисню та виробляли більше АТФ порівняно з Veh-DC (контрольні ДК, оброблені Veh). Аналіз шляху показав, що передача сигналу IL10 є основним шляхом, що сприяє зміні імунофенотипу після лікування рапаміцином порівняно з носієм зі значно нижчими цитокінами Tnfa, Il1b та Il6, тоді як регулятори мітохондріального вмісту Pgc1a, Tfam і Ho1 залишалися підвищеними. Важливо, що адоптивна передача DC, оброблених рапаміцином, реципієнтам WT за 24 години до двосторонньогониркаішемії значною мірою захищеніниркивід травми зі значним 3-кратним покращеннямфункції нирок. Нарешті, інфузія ДК, що містять більшу кількість мітохондрій (оброблених ex vivo здоровими ізольованими мітохондріями (10 мкг/мл) за день до цього), також частково захистиланиркивід IRI. Ці дослідження демонструють, що превентивна інфузія ex-vivo перепрограмованих ДК, які мають більший вміст мітохондрій, має терапевтичну здатність індукувати протизапальний регуляторний фенотип для захистуниркивід травми.
Ключові слова:дендритна клітина; рапаміцин; мітохондрії; гостре ураження нирок; ішемічне реперфузійне пошкодження
вступПатобіологія гострогоураження нирокє багатофакторним і включає складні взаємодії міжнирковийпаренхіматозні клітини та імунні клітини [1,2]. Внирка,звичайні дендритні клітини (DC) є основною підмножиною імунних клітин і знаходяться в інтерстиціальному просторі по всьомунирка[3–5]. DC є одним із основних типів клітин, залучених до вродженого імунітету, і є важливими для забезпечення захисту від патогенів. Наша раніше опублікована робота з використанням ДК кісткового мозку продемонструвала, що терапія ДК може регулювати різні вроджені та адаптивні імунні відповіді, пов’язані з ГПН [6,7].
DC розташовані широко в усіх тканинах, з підгрупою DC (CD11c плюс DC), що знаходяться внирковийпаренхіми. Однак ці CD11c плюс DC також відіграють патогенну роль у погіршенніураження нирокпісля ішемічно-реперфузійного ушкодження (ІРІ) [8]. IRI визначається як пошкодження в результаті повторного введення збагаченої киснем крові в орган після періоду ішемії та часто спостерігається при інфаркті міокарда, інсульті та трансплантації твердих органів. У відповідь на IRI CD11c плюс DC складають значну частину інфільтрату запальних клітин унирковийтканина.
DC здатні розпізнавати пов’язані з патогеном молекулярні патерни (PAMP) через різні рецептори розпізнавання патернів, розташовані на поверхні DC, такі як tolllike рецептори (TLR) і NOD-подібні рецептори. Зв’язування рецепторів розпізнавання образів (PRR) з їх специфічними PAMP призводить до активації кількох шляхів, які включають прозапальні відповіді, синтез антимікробних пептидів та індукцію опосередкованого лімфоцитами адаптивного імунітету [9]. Значні дослідження були присвячені вивченню змін у клітинній біоенергетиці ДК після активації PAMP. Було встановлено, що активація ДК ліпополісахаридом (LPS; PAMP, відмінний від грамнегативних бактерій), через зв’язування з його специфічним рецептором TLR4 призводить до метаболічної зміни від високоефективного окисного фосфорилювання до процесу, дуже подібного до метаболізму Варбурга або аеробного гліколізу. . Метаболізм Варбурга характеризується перенаправленням пірувату, що утворюється в результаті гліколізу, на перетворення в лактат для виробництва енергії та від транспортування в мітохондрії для проходження катаболізму через цикл ТСА, незважаючи на достатню доступність кисню. Одне з пояснень цього явища полягає в одному з багатьох наступних ефектів активації TLR4, який полягає в підвищеній активності серин/треонін кінази, мішені рапаміцину у ссавців (mTOR). Інгібування mTOR рапаміцином зберігає мітохондріальну функцію в активованих ДК шляхом зниження регуляції iNOS, при цьому ДК, оброблені рапаміцином, стимульовані в присутності ЛПС, демонструють знижені рівні аеробного гліколізу [10]. Інгібітори mTORC1, такі як рапаміцин, в даний час використовуються при трансплантації твердих органів як можлива альтернатива інгібіторам кальциневрину, щоб уникнути хронічнихнирковийпошкодження алотрансплантата, оскільки він також має потенціал для розширення CD4 плюс CD25 плюс регуляторних Т-клітин [11,12]. Однак застосування рапаміцину при трансплантації може призвести до запальних ускладнень, які включають периферичний набряк, підвищення рівня креатиніну та тромбоцитопенію. Попередні дослідження продемонстрували, що несприятливі ефекти гіпоксичних подразників посилюються під впливом ЛПС і послаблюються рапаміцином [8,13].
Мета полягає в тому, щоб розробити методи використання схвалених FDA препаратів клінічного класу, таких як Рапаміцин, для індукції регуляторних DC, які можуть контролювати небажані вроджені та адаптивні імунні реакції. Метою цього дослідження було визначити потенційний(і) захисний(і) механізм(и) BMDCs, стимульованих рапаміцином, у доклінічній мишачій моделіниркаIRI. Лікування BMDC ex vivo рапаміцином дозволяє уникнути будь-яких несприятливих нецільових ефектів і запальних ускладнень, пов’язаних із системними ін’єкціями ліків. Оптимальна доза та час застосування більшості фармакологічних сполук або препаратів залежать від різних параметрів. У ракових клітинах низькі дози рапаміцину порівняно з високими дозами по-різному пригнічують mTORC1 і mTORC2, що призводить до часткового або повного пригнічення прогресування клітинного циклу [14]. Для всіх наших досліджень кондиціонування ex-vivo BMDCs у поточному рукописі ми обрали низьку дозу 10 нг/мл рапаміцину на основі раніше повідомлених досліджень з толерогенними BMDCs [15,16]. Розрахунок кількості доз (три або одна) ґрунтувався на нашій раніше опублікованій роботі з розмноженням BMDC миші та додаванням GMCSF [17,18]. Наші поточні дані демонструють, що як одноразове, так і багаторазове лікування DC рапаміцином індукує менш стійкі імуногенні відповіді (нижчі цитокіни та костимулюючі молекули) після стимуляції LPS. Передача одного або декількох DC, оброблених рапаміцином, однаково захищаєниркивід IRI в сингенних (C57BL/6 BMDC→C57BL/6 мишей) або алогенних (BALB/c BMDC→C57BL/6 мишей) моделях IRI. Однак багаторазове лікування рапаміцином ex vivo (3 процедури протягом 7 днів), окрім зниження імуногенних відповідей, також збільшило кількість і функцію мітохондрій (аналізатор Seahorse Analyzer) порівняно з DC, обробленими носієм. Ці експериментальні спостереження показують, що ДК з більшою кількістю мітохондрій мають потенціал стати регуляторними, і передача цих ДК може захиститиниркивід ішемічного ураження. Як показало наше нещодавнє дослідження з використанням DC, оброблених FTY720 [18], фармакологічні або мітохондріальні трансплантати, які індукують більшу кількість мітохондрій в імунних клітинах (DC або макрофагах), також викликають у цих клітин протизапальний фенотип, ефект, можливо, через підтримку мітохондрій. окисного фосфорилювання (OXPHOS) і зі зниженим перемиканням на гліколіз для отримання енергії після стимуляції. Для цих ефектів ми екзогенно збільшили кількість мітохондрій у DC, щоб перевірити, чи може більша кількість мітохондрій індукувати регуляторний фенотип за допомогою мітохондріальних трансплантатів. Передача цих Mito-DC захищенаниркивід IRI; однак, на відміну від Rapa-DC, ці Mito-DC не мають знижених імуногенних відповідей (MHCII, костимулюючі молекули та цитокіни) після стимуляції LPS, можливо, вказуючи на те, що збільшення кількості копій мітохондрій може перекрити функціональні зміни, індуковані екзогенною стимуляцією LPS. У цьому дослідженні та як було продемонстровано раніше [6,7,18], системно введені ДК (оброблені транспортним засобом, рапаміцином або мітохондріями) у дозі півмільйона в основному виявляються лише в селезінці, і не виявляється сигналу практично без нього. внирки. У селезінці, як-от FTY720-DC, рапаміцин і багаті мітохондріями DC можуть індукувати протизапальну реакцію, що призводить до захисту відниркаIRI. Ці насіннєві відкриття надають нові докази того, що збільшення кількості мітохондрій (екзогенно за допомогою трансплантації мітохондрій або за допомогою фармакологічного втручання (FTY720 або рапаміцин)) в імунних клітинах може бути новим терапевтичним способом остаточного регулювання їхніх імунологічних відповідей для профілактики та/або раннього лікуванняураження нирок.
Матеріали та методи
мишіУсі процедури та поводження з тваринами виконувались відповідно до Керівництва Національного інституту охорони здоров’я щодо догляду та використання лабораторних тварин, а номер протоколу Bajwa UTHSC, 18-080, дата схвалення 28.09.2018, було схвалено Університетом Інституційні комітети з догляду та використання тварин Центру охорони здоров’я Теннессі (UTHSC). Політика догляду за лабораторними тваринами відповідає Політиці служби охорони здоров’я щодо гуманного догляду та використання лабораторних тварин. Усі результати представлені відповідно до рекомендацій ARRIVE [19]. Для всіх досліджень перенесення мишей C57BL/6J і BALB/c придбали в лабораторії Джексона (Бар-Харбор, Мен, США). Мишей утримували у стандартному віварії з 12--годинним циклом світла/темряви на харчовій дієті, а вода була у вільному доступі.
Ниркова ішемія-реперфузійне пошкодження Дотримувались усіх детальних хірургічних процедур, як повідомлялося раніше [18]. Мишей-самців C57BL/6 (віком 8–12 тижнів) піддавали 26-хвилинній двосторонній ішемії з наступною 20–24-годинною реперфузією. Коротко кажучи, усіх мишей-самців анестезували за допомогою внутрішньочеревної (ip) ін’єкції суміші кетаміну та ксилазину з підшкірною ін’єкцією бупренорфіну та поклали на теплу прокладку для підтримки температури тіла на рівні 34,5–36 ◦C. Потім мишей рандомізували на фіктивну або IRI операцію. Виконано двосторонній розріз на боці. Температуру тіла контролювали та підтримували протягом усього ішемічного періоду. Шамооперовані миші пройшли таку ж процедуру, за винятком перетискання судини та закриття хірургічних ран. Миші, які мали одинниркабез реперфузії через 24 години після ішемії були виключені з усіх аналізів.
Оцінка функції нирок і гістологіяКров відбирали під анестезією з ретроорбітального синуса та визначали креатинін плазми (мг/дл) за допомогою ферментативного методу з незначними модифікаціями протоколу виробника (Diazyme Laboratories, Poway, CA, США) і азоту крові в сечі (BUN ) і вимірювання креатиніну проводили за допомогою набору QuantiChrom Urea Assay Kit (DIUR-100, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA), як описано раніше [18,20]. Для гістології,ниркифіксували протягом ночі в 4% PLP або 10% формаліні та заливали в парафін.ниркибули підготовлені для фарбування H&E, як описано раніше [18], а фотографії були зроблені з регулюванням яскравості/контрастності за допомогою мікроскопа EVOS (Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, США). Для кількісної оцінки балів ушкодження канальців зрізи оцінювали шляхом підрахунку відсотка канальців, у яких спостерігався некроз клітин, втрата щіткової облямівки, утворення пов’язки та розширення канальців таким чином: 0=нормально; 1=Менше або дорівнює 10 відсоткам; 2=10 до 25 відсотків; 3=26 до 50 відсотків; 4=51 до 75 відсотків; 5=Більше або дорівнює 75 відсоткам. Від 5 до 10 полів кожного зовнішнього мозкового шару оцінювали та оцінювали сліпим способом. Гістологічна зміна була виражена як гострий тубулярний некроз (ГТН), оцінений як описано раніше [7, 21]. Апоптозні клітини виявляли за допомогою аналізу TUNEL (набір In Situ Cell Death Detection, TMR Red; Roche, Basel, Швейцарія) відповідно до інструкцій виробника.
Культура дендритних клітин (ДК) кісткового мозку (КМ) та адоптивна передачаСамців мишей C57BL/6J або BALB/c WT віком 8–1{12}} тижнів використовували для генерації ДК із цілих попередників BM [22]. Багатий GMCSF супернатант був отриманий з клітин J558L, стабільно трансфікованих мишачим GMCSF. Лінія клітин була щедрим подарунком від доктора Айри Меллман (факультет біології Єльського університету, Нью-Гейвен, Коннектикут, США). Коротко кажучи, щойно виділений BM культивували з 6 нг/мл рекомбінантного мишачого GMCSF (загалом 3 обробки) протягом 8 днів у RPMI 1640 (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США). Оптимальна доза 10 нг/мл рапаміцину була визначена після тестування різних доз (0,1–10 нг/мл). BMDC обробляли 10 нг/мл рапаміцину (Sigma, Сент-Луїс, Міссурі, США) загалом три процедури або 1-лікування протягом ночі). BMDC обробляли ліпополісахаридом-агоністом TLR4 (LPS; Escherichia coli серотип 0111:B4: 100 нг/мл; Sigma-Aldrich); або носій (1 × PBS) протягом 24 годин у культуральному середовищі для сингенних досліджень (C57BL/6J BMDCs→C57BL/6J миші) і залишити без лікування для алогенних досліджень (BALB/c BMDCs→C57BL/6J миші). Клітини промивали і 0,5 × 106 клітин на мишу внутрішньовенно (в/в) вводили неактивним мишам за 1 день до двосторонньогониркаIRI. BMDC мічали MitoTracker CMXRos Red або MitoTracker Deep Red (100 нМ, 30 хв при 37 ◦C, Invitrogen) або Mitosox (5 мкМ; 10 хв при 37 ◦C; Invitrogen).
Кількісна ПЛР в реальному часіВідносний рівень експресії мітохондріальної ДНК (мтДНК) вимірювали, як описано раніше [23]. Коротко, була виділена загальна геномна ДНК і однакові кількості (5 нг) використовувалися для RTPCR з використанням ND1 як сурогатних праймерів для мтДНК і праймерів HK2 для ядерної ДНК (нДНК) для миші та ND6 для мтДНК людини, як описано раніше [23,24]. Тотальну РНК виділяли та зворотно транскрибували до кДНК, а ПЛР-ЗВ проводили, як описано раніше [7,25,26].
Виділення та кількісна оцінка мітохондрійМітохондрії були виділені з клітин HEK293, як описано раніше [18]. Коротко кажучи, 60 см планшети з клітинами HEK293 збирали шляхом додавання 5 мл гомогенізаційного буфера (300 ммоль/л сахарози, 10 ммоль/л HEPES-KOH, 1 ммоль/л EGTA-KOH, рН 7,4) з 1 мг протеази субтилізину А з Bacillus licheniformis (Sigma-Aldrich). Детальний протокол для ізоляції мітохондрій можна знайти в нашому попередньому опублікованому рукописі [18].
2Біоаналізатор Seahorse FluxСемиденні BMDC були перенесені в пластини для культуральних тканин з ямками Seahorse 24-, і була виміряна швидкість споживання кисню (OCR), а параметри були розраховані, як описано раніше [25] з наступною модифікацією. Після вимірювання базальної частоти дихання олігоміцин (Sigma; 2 мкМ), FCCP (Sigma; 1,5 мкМ; карбонілціанід 4- (трифторметокси)-фенілгідразон (FCCP)) та інгібітори транспортного ланцюга електронів (комплекс I і III) ротенон (Sigma; 0.5 мкМ) і антиміцин А (Sigma; 0.5 мкМ)) вводили послідовно під час аналізу. Базальне мітохондріальне дихання, АТФ-пов’язане дихання, витік протонів (споживання кисню, не пов’язане з АТФ), максимальне дихання, немітохондріальне дихання, резервна дихальна ємність, коефіцієнт контролю дихання та ефективність зв’язку визначали в цілих клітинах відповідно до Brand et al. . [27]; Для кожної експериментальної групи використовували N=4–5 лунок і експерименти повторювали мінімум 3 рази.
Проточний цитометричний аналіз, Вестерн-блот та ІФАЗбір даних проточної цитометрії проводився на FACS Calibur (Becton Dickinson, Сан-Хосе, Каліфорнія, США) з оновленою кольоровою проточною цитометрією Cytek {{0}} (Cytek Development, Inc., Фремонт, Каліфорнія, США). Дані були проаналізовані програмним забезпеченням FlowJo 9.0 (Tree Star, Ashland, OR, USA), як описано раніше [6,7,28]. Для ELISA середовища збирали з BMDC через 24 години після обробки 100 нг/мл LPS. Рівні TNF, IL6 або IL10 вимірювали за допомогою наборів ELISA для мишей (Invitrogen), дотримуючись протоколу виробника та як описано раніше [18]. Veh- або Mito-DC, оброблені LPS або без нього протягом 6 або 24 годин, використовували для виділення загального білка за допомогою буфера для лізису RIPA, доповненого сумішшю інгібіторів протеази та фосфатази (Thermo Fisher Scientifific, Vernon Hills, IL, США). Для GAPDH супернатант лізату кип’ятили (10 хв при 100 ◦C) і лізати залишали при кімнатній температурі на 10 хв для коктейлю OXPHOS для гризунів (Abcam, Cambridge, MA, USA) [18]. Більш детальні методи були описані раніше [18].
Дані та статистичний аналізДля аналізу та представлення даних використовувався GraphPad Prism 8 (GraphPad Inc., Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Дані були проаналізовані після перетворення, якщо це було необхідно для створення нормального розподілу, за 2-тестом із хвостом t або 1-way ANOVA з допоміжним аналізом відповідно. Двосторонній непарний t-тест використовувався для аналізу двох груп. p Менше або дорівнює 0.05 використовувалося для позначення значущості.
Результати
Багаторазове лікування рапаміцином (Rapa-M) індукує більшу кількість мітохондрій і менший імуногенний DCC57BL/6 WT DC виділяли та розмножували протягом 8 днів у присутності GMCSF і носія (1X PBS) або рапаміцину (10 нг/мл), всього три обробки. DC обробляли 100 нг/мл LPS протягом ночі. DC, оброблені LPS, використовували для RNASeq або мічили різними мітохондріальними барвниками. Дані RNASeq підтвердили попередні дані про те, що лікування рапаміцином індукує менш імуногенні ДК з нижчими прозапальними цитокінами, які регулюють вроджені та адаптивні імунні відповіді за допомогою IL10 як основного шляху змін (рис. S1A, B і таблиця S1 додаткового матеріалу). Порівняно з лікуванням наповнювачем, лікування рапаміцином збільшило вміст мітохондрій у BMDC (рис. 1A), як перевірено за допомогою MitoTracker CMXRos Red (50 нМ) з і без LPS. Подібним чином спостерігалося значно більше мічення за допомогою MitoTracker Deep Red (100 нМ) і значно нижче мічення за допомогою MitoSox (5 мкМ) і після нічної стимуляції LPS у Rapa-M-DC порівняно з Veh-DC (рис. 1B,C). Напівкількісна оцінка гістограм MFI для всіх мітохондріальних барвників (рис. 1D). Крім того, Veh- і Rapa-M-DC фарбували за допомогою JC-1, щоб перевірити, чи змінило лікування рапаміцином мембранний потенціал мітохондрій. Багаторазова обробка рапаміцином не змінює базовий мембранний потенціал мітохондрій порівняно з контрольними BMDCs, обробленими носієм, як показано за допомогою імунофлюоресценції (додатковий матеріал, малюнок S2A) і проточної цитометрії (додатковий матеріал, малюнок S2B, C).
(Veh) і позначено (A) MitoTracker CMXRos (50 нМ) або (B) MitoSox (5 мкМ) або (C) MitoTracker Deep Red (100 нМ) . (D) Напівкількісний аналіз MFI даних проточної цитометрії, мічених барвниками мітохондрій. (E) DC були висіяні в аналізатор Seahorse XF-24e, стимульований з LPS і без нього протягом 24 годин, і швидкість споживання кисню (OCR) була визначена під час послідовних обробок олігоміцином (1), FCCP (2) і антиміцин А/ротенон (3). (F) Кількісна оцінка базального OCR і виробництва АТФ. (G) рівні мРНК Pgc1a і Tfam у Veh-DC і Rapa-M-DC, оброблених 100 нг/мл LPS або залишених без стимуляції протягом 24 годин. (H) Проточний цитометричний аналіз MHC II, костимулюючих молекул (CD40/80/86) і експресії PDL1 визначали з і без стимуляції LPS. (I) ELISA IL10, IL6 і TNF з Veh-DC і Rapa-M-DC, оброблених 100 нг/мл LPS протягом 24 годин. (J–L) рівні мРНК Il10, Tnfa та Il6 у Veh-DC та Rapa-M-DC, оброблених 100 нг/мл LPS або залишених без стимуляції протягом 24 годин. * p Менше або дорівнює 0,05, ** p Менше або дорівнює 0,01 і *** p Менше або дорівнює 0,001, односторонній дисперсійний аналіз з наступним тестом Тьюкі. Дані являють собою середнє значення ± SEM трьох примірників.
Змінена функція мітохондрій, біоенергетичний аналіз оцінювався за допомогою Seahorse Bioanalyzer. Як повідомлялося раніше [18], LPS притупив споживання кисню порівняно з контролем Veh у Veh-DCs, як і очікувалося (рис. 1E, лінія від синього до чорного). Цікаво, що rapa-M DC з або без LPS мають вищий базальний OCR (малюнок 1E, лінія від зеленого до синього в нульовий час). Rapa-M-DC продемонстрував нездатність збільшити максимальну дихальну здатність після ін’єкції FCCP у нестимульовані клітини, яка підтримувалася за допомогою стимуляції LPS, демонструючи, що рапаміцин зменшує резервну дихальну здатність, як повідомлялося раніше в нашій роботі з FTY-DC [18]. DC, оброблені LPS, мали знижене виробництво АТФ, як виміряно OCR (від синього до чорного) порівняно з Veh-DC. Rapa-M-DC продемонстрував значно більшу продукцію АТФ порівняно з Veh-DC як у нестимульованих, так і в стимульованих LPS DC (рис. 1F). Rapa-M-DC показали підвищені рівні мРНК для активованого пероксисомним проліфератором рецептора гамма-коактиватора 1-альфа (Pgc1a) порівняно з Veh-DC (рис. 1G) і експресії генів для Pgc1a та мітохондріального фактора транскрипції A (Tfam ) підтримувалися в Rapa-M-DC після стимуляції LPS. Ці дані вказують на те, що розмноження BMDCs у присутності рапаміцину збільшує вміст мітохондрій, базальний OCR та виробництво АТФ.
Щоб перевірити, чи рапаміцин, окрім збільшення кількості та функції мітохондрій, також викликав зміни в костимулюючих молекулах DC після тестування LPS. Цікаво, що після лікування ЛПС Rapa-M-DC має значно нижчі рівні експресії костимулюючих молекул презентації антигену (CD80, CD86 і CD40), MHCII і PDL1 порівняно з Veh-DC (рис. 1H, синій проти червоного). Цікаво, що Rapa-M-DC мали подібні рівні експресії для PDL1 порівняно з Veh-DC, але мали значне збільшення співвідношення PDL1/CD86 після стимуляції LPS порівняно з Veh-DC, обробленими LPS, де PDL1/CD{{ 18}} зменшився (Veh/Veh 0.59 ± 0.03 проти Veh/LPS 0.43 ± 0.{{33 }}02, p < 0,001="" і="" rapa/veh="" 0,56="" ±="" 0,001="" проти="" rapa/lps="" 0,73="" ±="" 0,02,="" p="">< 0,05).="" не="" спостерігалося="" значних="" змін="" експресії="" cd11c="" між="" veh-="" і="" rapa-m-dc,="" хоча="" rapa-m-dc="" мав="" нижчий="" сигнал="" бічного="" розсіювання,="" що="" вказувало="" на="" менший="" розмір="" клітин="" після="" стимуляції="" lps="" (дані="" не="" показані).="" m-dc="" rapa="" мали="" вищі="" відносні="" рівні="" мтднк/нднк="" порівняно="" з="" veh-dc="" (105,7="" ±="" 8,7="" проти="" 196,8,9="" ±="" 49,3),="" демонструючи,="" що="" лікування="" рапаміцином="" збільшує="" кількість="" мітохондрій="" dc.="" рапаміцин="" суттєво="" знижував="" експресію="" генів="" lps-індукованих="" il6,="" il10="" і="" tnfa,="" а="" також="" концентрацію="" білка="" tnf="" та="" il6,="" але="" підтримував="" більш="" високі="" рівні="" il10="" порівняно="" з="" veh-dc,="" обробленим="" lps="" (рис.="" 1i–l).="" інші="" гени,="" які,="" як="" відомо,="" регулюються="" рапаміцином="" (аутофагія="" або="" запалення),="" перераховані="" в="" таблиці="" s2="" додаткового="" матеріалу.="" гени="" після="" lps,="" позначені="" зеленим,="" мали="" низьку="" регуляцію,="" а="" червоний="" –="" посилену="" регуляцію="" порівняно="" з="" відповідним="" лікуванням="">
Передача Rapa-M-DC захищає нирки від ішемічного пошкодженняУсі ДК були активовані 100 нг/мл LPS перед перенесенням у всіх сингенних дослідженнях (миші C57BL/6 BMDC→C57BL/6). Півмільйона DC було введено за 1 день до 26- хв двосторонньої ін’єкціїниркаIRI. Схема дизайну дослідження (рис. 2A). В якості контролю мишам вводили 1 × PBS як контролі без клітин (NC). Порівняно з мишами, які отримували NC та Veh-DC, миші, які отримували Rapa-M-DC, значно захищалиниркивід травми, креатинін плазми (рис. 2B); подібні зміни в BUN спостерігалися у цих мишей [Sham 41,30 ± 3,4 проти NC 159,75 ± 3,2 проти Veh-DC 151,82 ± 1,5 проти Rapa-M-DC 114,68 ± 16,3; p <0,05 nc="" або="" veh-dc="" порівняно="" з="" rapa-m-dc].="" морфологічні="" зміни="" (рис.="" 2c,="" d)="" відбувалися="" паралельно="" з="" функціональними="" дослідженнями.="" миші,="" які="" отримували="" rapa-m-dc,="" мають="" нижчий="">ниркаРівні мРНК Kim1 [Veh DC 0.016 ± 0.009 проти Rapa-M-DC {{2{{23} }}}.001 ± 0.002], Ngal [Veh-DC 2,14 ± 1,2 проти Rapa-M-DC 0,12 ± 0,09] і Tnfa [Veh-DC 0,19 ± 0,15 проти Rapa-M-DC 0,0005 ± 0,0002] порівняно з мишами, які отримували Veh-DC. У цих дослідженнях, як було продемонстровано раніше [6,7,17,18], миші, які отримували Veh-DC у дозі півмільйона, мали порівняльні зміни вфункції нирокіниркацитокіновий профіль. У дослідженнях сингенного переносу мишей, яким вводили Rapa-M-DC, спостерігався знижений апоптоз (кінцева дезоксинуклеотидилтрансфераза, опосередкована дигоксигенін-дезоксиуридиновим маркуванням кінця розриву [TUNEL]) порівняно з мишами, які отримували Veh-DC (Veh-DC 3,8 ± 1,4 проти Rapa- M-DC 1,1 ± 0.6; p < 0.05);="" репрезентативні="" зображення="" з="" аналізу="" tunel="" показані="" на="" рисунку="" s3="" додаткового="" матеріалу.="" цікаво,="" що="" не="" було="" значних="" змін="" у="" кількості="" інфільтрованих="" нейтрофілів="" у="" мишей,="" які="" отримували="" rapa-m-dc,="" порівняно="" з="" veh-dc="" (дані="" не="" показані),="" що="" свідчить="" про="" те,="" що="" миші,="" які="" отримували="" rapa-m-dc,="" можуть="" не="" мати="" жодних="" змін="" у="" хемокінах,="" хоча="" функція="" цих="" інфільтраційних="" вроджених="" імунних="" клітин="" може="" бути="">
Одноразове лікування рапаміцином (Rapa-S) індукує менш імуногенні ДК без зміни мітохондріальної динамікиДалі ми перевірили, чи достатньо одного лікування рапаміцином для індукції регуляторного фенотипу, що робить можливість індукції регуляторного фенотипу DC більш клінічно значущою. WT DC були виділені та розмножені протягом 8 днів у присутності GMCSF, загалом три обробки. Семиденних ДК обробляли рапаміцином (10 нг/мл) перед обробкою 100 нг/мл ЛПС для інкубації протягом ночі та мічили наступного дня за допомогою MitoTracker CMXRos Червоний (50 нМ). Порівняно з обробкою носієм, обробка Rapa-S не змінює мітохондріальний вміст у BMDCs (рис. 3A) з і без LPS. Подібним чином не було змін у маркуванні MitoTracker Deep Red (100 нМ) і MitoSox (5 мкМ) і після нічної стимуляції LPS у Rapa-S-DC порівняно з Veh-DC (Малюнок 3B,C). Напівкількісна оцінка гістограм MFI для всіх мітохондріальних барвників (рис. 3D). Подібно до аналізу багаторазової обробки Veh- і Rapa-S-DC фарбували за допомогою JC{{20}}, щоб перевірити, чи змінює одноразова обробка рапаміцином мембранний потенціал мітохондрій. Одноразова обробка рапаміцином не змінює базовий мембранний потенціал мітохондрій порівняно з контрольними BMDC, обробленими носієм, як показано за допомогою імунофлюоресценції (додатковий матеріал, малюнок S2A) і проточної цитометрії (додатковий матеріал, малюнок S2B, C). LPS зменшив споживання кисню порівняно з контролем Veh у Veh-DC, як і очікувалося (Малюнок 3E, лінія від синього до чорного). Rapa-S-DCs не мали змін у базальному OCR (рис. 3E, лінія від зеленого до синього в нульовий час). Коли виробництво АТФ було визначено кількісно, ЛПС зменшив виробництво АТФ, як виміряно OCR (від синього до чорного) у Veh-DC та Rapa-S-DC (рис. 3F). Однак Rapa-S-DC демонстрували підвищені рівні мРНК для Pgc1a порівняно з контролем Veh, і ці рівні підтримувалися в Rapa-S-DC після LPS (рис. 3G), не спостерігалося жодних змін у рівнях транскриптів Tfam. Далі ми перевірили, чи одноразове лікування рапаміцином викликало зміну костимулюючих молекул DC після LPS. Цікаво, що після обробки ЛПС Rapa-S-DC мають значно нижчі рівні експресії костимулюючих молекул презентації антигену (CD80, CD86 і CD40), MHCII, і PDL1 порівняно з Veh-DC (рис. 3H). Rapa-S-DC мали подібний рівень експресії для PDL1 порівняно з Veh-DC і мали подібне значне зниження співвідношення PDL1/CD86 після стимуляції LPS порівняно з Veh-DC (Veh/Veh 0. 59 ± 0,03 порівняно з Veh/LPS 0,43 ± 0,002, p < 0,001="" і="" rapa-s/veh="" 0,69="" ±="" 0,02="" проти="" rapa-s/lps="" 0,56="" ±="" 0,008,="" p="">< 0,05).="" одноразова="" обробка="" рапаміцином="" суттєво="" знижувала="" експресію="" генів="" lps-індукованих="" il6,="" il10="" і="" tnfa="" разом="" із="" нижчими="" концентраціями="" білка="" il10="" з="" незначною="" зміною="" tnf="" або="" без="" неї="" та="" після="" лікування="" lps="" (рисунок="" 3i–l).="" інші="" відомі="" гени,="" що="" регулюються="" рапаміцином="" (аутофагія="" [beclin,="" atg7,="" atg9,="" lc3b="" і="" lamp2]="" або="" запалення="" [il1b,="" il12p40,="" tlr4,="" nos2,="" hif1a="" і="" ho1])="" регулювалися="" лише="" частково="" порівняно="" з="" dc="" носія="" після="" стимуляції="" lps="" (додаткова="" таблиця="" матеріалів="">
Передача Rapa-S-DC захищає нирки від ішемічного пошкодженняУсі ДК були активовані 100 нг/мл LPS або оброблені рапаміцином (10 нг/мл) перед перенесенням у всіх сингенних дослідженнях (миші C57BL/6 BMDC→C57BL/6). Півмільйона ДК було введено за 1 день до двосторонньої ін’єкціїниркаIRI. Схема дизайну дослідження (рис. 4A). В якості контролю мишам вводили 1 × PBS як контролі без клітин (NC). Порівняно з мишами, які отримували Veh-DC, миші, які отримували Rapa-S-DC, значно захищалиниркивід пошкодження креатиніну плазми (рис. 4B); подібні зміни BUN спостерігалися у цих мишей [Veh-DC 151,82 ± 1,5 проти Rapa-S-DC 139,53 ± 3,8]. Морфологічні зміни (рис. 4C, D) відбувалися паралельно з функціональними дослідженнями. Миші, які отримували Rapa-S-DC, мають нижчий рівеньниркаРівні мРНК Kim1 [Veh-DC 0.016 ± 0.{{10}}{{20}}9 проти Rapa -S-DC 0.004 ± 0,002], Ngal [Veh DC 2,14 ± 1,2 проти Rapa-S-DC 0,14 ± 0,008] і Tnfa [Veh-DC 0,196 ± ± 0,15 проти Rapa-S-DC 0,0017 ± 0,001] порівняно з мишами, які отримували Veh-DC.
Алогенна передача BMDC Rapa-M-DC або Rapa-S-DC однаково захищає нирки від ішемічного пошкодженняПівмільйона ДК було введено за 1 день до двостороннього введенняниркаIRI для досліджень алогенного (BALB/C BMDC→C57BL/6) переносу. Схема дизайну дослідження (рис. 5A). В якості контролю мишам вводили 1x PBS як контролі без клітин (NC). Порівняно з мишами, які отримували Veh-DC, миші, які отримували Rapa-M-DC або Rapa-S-DC, значно захищалиниркивід травми (Малюнок 5B). Морфологічні зміни (рис. 5C, D) відбувалися паралельно з функціональними дослідженнями. У мишей, які отримували рапаміцин, ДК були нижчиминиркаРівні мРНК Kim1 [Veh-DC 0.04 ± 0.{{10}}2 проти Rapa-M-DC 0. 005 ± 0.0{{30}}2 проти Rapa-S-DC 0.{{37} }05 ± 0.0002], Ngal [Veh-DC 0,57 ± 0,3 проти RapaM-DC 0,19 ± 0,11 проти Rapa- S-DC 0,05 ± 0,01] і Tnfa [Veh-DC 0,037 ± 0,02 проти Rapa-M-DC 0,007 ± 0,003 проти Rapa-S-DC 0,008 ± 0,005] порівняно з мишами, які отримували Veh-DC. У дослідженнях алогенного перенесення мишей, які отримували Rapa-M-DC або Rapa-S-DC, було знижено апоптоз TUNEL порівняно з мишами, які отримували Veh-DC (Veh-DC 16,7 ± 8,2 проти Rapa-M-DC 7,2 ± 2,5 проти Rapa- S-DC 9,1 ± 0,1).
Екзогенні мітохондріально навантажені DC (Mito-DC) з вищою мітохондріальною динамікою та більшим імуногенним фенотипом після стимуляції LPSWT DC були виділені та розмножені протягом 8 днів у присутності GMCSF, загалом 3 обробки. Семиденні DC обробляли протягом ночі екзогенними мітохондріями людини (10 мкг/мл). Порівняно з обробкою транспортним засобом, DC Mito-DC, оброблені мітохондріями, мають більшу кількість мітохондрій. Мітохондрії були виділені з лінії клітин HEK293 людини. BMDC аналізували на наявність людських мітохондрій у WT DC миші з використанням праймерів мтДНК людини для NADH дегідрогенази (ND). Відносний вміст [мтДНК] людини у Veh-DC становив {{10}}.26 ± 0.10 проти 16,8 ± 0,59; p < 0,001,="" збільшення="" в="" 63-раз="" геномної="" днк,="" виділеної="" з="" bmdc.="" обмеженням="" поточного="" аналізу="" є="" те,="" що="" він="" вимірює="" мтднк="" людини="" або="" миші="" відносно="" ядерної="" днк,="" і="" невелика="" кількість="" мтднк="" людини,="" виявлена="" у="" veh-dc,="" може="" бути="" наслідком="" незначного="" перекриття="" послідовності="" nd="" в="" аналізі="" плр="" або="" можливістю,="" оскільки="" ми="" показує="" відносну="" експресію="" до="" ядерної="" днк="" миші.="" щоб="" визначити,="" чи="" більший="" вміст="" мітохондрій="" також="" змінив="" функцію="" мітохондрій,="" було="" проведено="" біоенергетичний="" аналіз="" за="" допомогою="" біоаналізатора="" seahorse.="" lps="" зменшив="" споживання="" кисню="" порівняно="" з="" контролем="" veh="" у="" veh-dcs,="" як="" і="" очікувалося="" (малюнок="" 6a,="" лінія="" від="" синього="" до="" чорного).="" міто-dc="" мають="" вищий="" базальний="" ocr="" (малюнок="" 6a,="" лінія="" від="" зеленого="" до="" синього="" в="" нульовий="" час).="" після="" лікування="" роз’єднувачем="" fccp="" mito-dc="" продемонстрував="" нездатність="" збільшити="" максимальну="" дихальну="" здатність="" у="" нестимульованих="" клітинах,="" яка="" підтримувалася="" стимуляцією="" lps,="" демонструючи,="" що="" лікування="" ізольованими="" мітохондріями="" зменшує="" резервну="" дихальну="" здатність="" (ймовірно,="" через="" те,="" що="" вже="" при="" максимальному="" ocr="" у="" базальному="" стані).="" коли="" виробництво="" атф="" було="" визначено="" кількісно,="" lps="" зменшив="" виробництво="" атф,="" як="" виміряно="" ocr="" (від="" синього="" до="" чорного)="" у="" veh-dc.="" mito-dc="" продемонстрував="" значно="" більшу="" базальну="" продукцію="" ocr="" і="" atp="" порівняно="" з="" veh-dc="" у="" lps-стимульованих="" dc="" (рис.="" 6b).="" міто-dc="" показали="" підвищені="" рівні="" мрнк="" для="" pgc1a="" і,="" що="" цікаво,="" значно="" нижчі="" tfam="" порівняно="" з="" контролем="" veh="" (рис.="" 6c).="" відмінності="" в="" pgc1a="" і="" tfam="" у="" цій="" серії="" експериментів="" після="" стимуляції="" lps="" порівняно="" з="" даними="" на="" малюнках="" 1="" і="" 3,="" можливо,="" пов’язані="" з="" використанням="" bmdc="" balb/c.="" порівняно="" з="" c57bl/6="" bmdc,="" dc="" з="" balb/c="" мають="" значні="" зміни="" в="" мітохондріях="" і="" виробленні="" цитокінів="" після="" стимуляції="" [29,30].="" можливість="" через="" ці="" зміни="" в="" dc,="" історично="" ми="" використовували="" вищий="" час="" ішемії="" у="" мишей="" balb/c="" порівняно="" з="" c57bl/6,="" щоб="" мати="">ниркатравми [6,18]. Ці дані вказують на те, що перенесення екзогенних здорових мітохондрій призводить до збільшення вмісту мітохондрій, базального OCR і виробництва АТФ. Це свідчить про потенціал протизапального фенотипу в ДК після лікування екзогенними мітохондріями, як показано в нашому попередньому дослідженні [18]. Далі ми перевіряємо, чи DC, оброблені екзогенними мітохондріями, що призводить до збільшення кількості та функції мітохондрій, також викликають зміни в костимулюючих молекулах DC після LPS. Примітно, що зі стимуляцією LPS і без неї Mito-DC має значно вищі рівні експресії костимулюючих молекул презентації антигену (CD80, CD86 і CD40), MHCII і PDL1 порівняно з Veh-DC (рис. 6D). Крім того, Mito-DC мали вищий рівень експресії PDL1 порівняно з Veh-DC; однак вони також мали збільшення співвідношення PDL1/CD86 після стимуляції LPS порівняно з Veh-DC, обробленими LPS (дані не показані). Mito-DC значно притупив експресію генів LPS-індукованого Tnfa, але вищу експресію генів Il6 та Il10 порівняно з Veh-DC і нижчі концентрації білка TNF та IL10, але підтримував вищі рівні IL6 порівняно з Veh-DC, обробленим LPS (рис. 6E). –H). Інші гени, які, як відомо, регулюються мітохондріями (аутофагія [Beclin, Atg7, Atg9, Lc3b і Lamp2] або запалення [Il1b, Il12p40, Tlr4, Nos2, Hif1a і Ho1]) частково регулюються після стимуляції LPS (таблиця S3 додаткового матеріалу). Veh-DC і Mito-DC обробляли LPS протягом 6 і 24 годин. Вимірювали відносні зміни мітохондріального комплексу. Mito-DC, оброблені LPS і без нього, мають значно вищі рівні білка мітохондріальних комплексів IV, II і I і значно нижчі рівні комплексів V і III порівняно з Veh-DC (рис. 6I). Напівкількісний аналіз відносної експресії білків мітохондріальних комплексів до GAPDH (рис. 6J). Помарки повної довжини надаються як додаткові фігури (рисунки додаткового матеріалу S4–S7).
Рисунок 6. Навантажені мітохондріями DC (Mito-DC) мають вищу мітохондріальну функцію та імуногенність після стимуляції LPS порівняно з Veh-DC. Семиденний вік Veh-DC і інкубували з 10 мкг/мл мітохондрій HEK293 за один день до обробки 100 нг/мл ЛПС протягом додаткових 24 годин або не стимулювали ( Вех). (A) Через 24 години після додавання мітохондрій DC були висіяні в аналізатор Seahorse XF-24e, стимульовані з LPS і без нього протягом 24 годин, і швидкість споживання кисню (OCR) була визначена під час послідовних обробок олігоміцином (1 ), FCCP (2) і антиміцин А/ротенон (3). (B) Кількісна оцінка базального OCR і виробництва АТФ. (C) рівні мРНК Pgc1a і Tfam у Veh-DC і Mito-DC, оброблених 100 нг/мл LPS або залишених без стимуляції протягом 24 годин. (D) Аналіз проточної цитометрії MHCII, костимулюючих молекул (CD40/80/86) і експресії PDL1 визначали з і без стимуляції LPS. (E) ELISA IL10, IL6 і TNF з Veh-DC і Mito-DC, оброблених 100 нг/мл LPS протягом 24 годин. (F–H) рівні мРНК Tnfa, IL6 та IL10 у Veh-DC та Mito-DC, оброблених 100 нг/мл LPS або залишених без стимуляції протягом 24 годин. Дані представляють середнє значення ± SEM, * p Менше або дорівнює 0,05, ** p Менше або дорівнює 0,01, і *** p Менше або дорівнює 0,001, односторонній дисперсійний аналіз з наступним тестом Тьюкі. Дані являють собою середнє значення ± SEM трьох примірників.
Алогенна BMDC передача Mito-DC Protectsниркивід ішемічної травми. Півмільйона ДК було введено за 1 день до двосторонньогониркаIRI для досліджень алогенного переносу Mito-DC (миші BALB/C BMDC→C57BL/6). Схема дизайну дослідження (рис. 7A). В якості контролю мишам вводили 1x PBS як контролі без клітин (NC). Порівняно з мишами, які отримували Veh-DC, миші, які отримували Mito-DC, значно захищалиниркивід травми (Малюнок 7B). Морфологічні зміни (рис. 7C, D) відбувалися паралельно з функціональними дослідженнями. Миші, які отримували Mito-DC, мають нижчий рівеньниркаРівні мРНК Kim1 [Veh-DC 0.04 ± 0.02 проти Mito-DC 0.02 ± 0.01], Нгал [Veh-DC 0.57 ± 0.3 проти Mito-DC 0.39 ± {{29} }.20] і Tnfa [Veh-DC 0,037 ± 0,02 проти Mito-DC 0,0028 ± 0,0013] порівняно з мишами, які отримували Veh-DC. У дослідженнях алогенного переносу миші, які отримували Mito-DC, мали знижений апоптоз TUNEL порівняно з мишами, які отримували Veh-DC (Veh-DC 16,7 ± 8,2 проти Mito-DC 3,0 ± 1,2).
Обговорення У поточному дослідженні ми продемонстрували захист відниркаIRI, індукований адоптивним перенесенням DC, оброблених рапаміцином (одноразово або багаторазово), альтернативно регулює функцію DC, яка залежить від відносних змін у динаміці мітохондрій. Як одноразове, так і багаторазове лікування рапаміцином індукує знижені імуногенні (нижчі цитокіни та костимулюючі молекули) ДК. Передача Rapa-M-DC або Rapa-S-DC захищаєниркивід ішемічного реперфузійного пошкодження, що вказує на знижений імуногенний стан модифікованих рапаміцином ДК індукує захист. Крім того, передача Veh-DC, яка мала тимчасове збільшення кількості мітохондрій, також захищаєниркивід IRI (Рис. 8A–D)). З цих досліджень ми можемо зробити висновок, що ін’єкція менш імуногенних ДК є центральною для індукції захисту від ІРІ, процесу, якого можна досягти за допомогою фармакологічного лікування (рапаміцин) або шляхом перенесення здорових екзогенних мітохондрій. Як повідомлялося раніше [31] і було підтверджено нашими дослідженнями RNAseq, загалом немає чіткої толерогенної ознаки, пов’язаної з модульованими рапаміцином DC. Хоча DC рапаміцину справді демонструють деякі значні зміни в генах після стимуляції LPS порівняно з DC носіями, вони були обмежені RapaM-DC, які мають нижчу опосередковану цитокінами передачу сигналів та продукцію цитокінів (сигнал TNF через NF-kB та продукцію IFN), що є критичним для обох вроджені та адаптивні імунні реакції. Як повідомлялося раніше та було підтверджено в нашому дослідженні, передача сигналів IL-10 була визначена як основний шлях, який відрізнявся в DC, оброблених рапаміцином, з FDR 5,87 × 10 4 (додатковий матеріал, малюнок S1), характерним цитокіном толерогенного підпису в DC.
Історично склалося так, що толерогенні ДК (Tol-DC) ідентифікуються як порушення дозрівання або напівнезрілі з низькою експресією костимуляції (CD80, CD86, CD40) із підвищеним виробництвом IL10, що супроводжується низькою секрецією IL12 та IFN , нижча здатність праймувати Т-клітини та потенціал індукувати Treg після прозапальної стимуляції [32,33]. Регуляторні або толерогенні ДК можна диференціювати in vitro за допомогою імунодепресантів або сполук, таких як FTY720 [18] або рапаміцин (поточне дослідження), або протизапальних цитокінів, таких як IL10 [34], або шляхом генетичної модифікації.
Роль дендритних клітин у гострому ураженні нирок (ГНН)Хоча були досягнуті значні фармакологічні досягнення для профілактики та лікування різних травм, жоден з них не доступний для ГПН, тому він залишається основним тягарем для здоров’я [35]. Крім того, для запобігання або зменшення адаптивних імунних реакцій, опосередкованих відторгненням алотрансплантата або аутоімунним захворюванням, використання неспецифічних імуносупресивних препаратів пов’язане з несприятливими побічними ефектами. Таким чином, використання типу імунних клітин, таких як DC, які можуть націлюватися на вроджені та адаптивні імунні відповіді, є перевагою. Крім того, ДК є важливими клітинами для імунітету або толерантності, і досліджується ідея використання ex-vivo регуляторних або толерованих ДК у клітинній терапії раку, аутоімунних захворювань і трансплантації [36]. Фармакологічні (FTY720 [18]) або біологічні стратегії (генетично модифіковані) індукують регуляторні або толерогенні DC (Tol-DC) [37], які або стійкі до дозрівання, або мають нижчі рівні дозрівання, або альтернативно активуються, що в кінцевому підсумку експресує низькі рівні MHC I або MHC II і костимулюючі молекули, такі як CD40, CD80 і CD86. Використовуючи трансгенних мишей CD11c-DTR, ми раніше опублікували дослідження, які продемонстрували, що виснаження ДК дифтерійним токсином значно захищає мишуниркивід ішемічного реперфузійного пошкодження (IRI) [7,38], і навпаки, дозозалежне збільшення чисел DC посилюєтьсяураження нирок[7], припускаючи, що ДК можуть відігравати важливу роль у регулюванні ГПН. Варто зазначити, що при ГПН модель ГПН, яка використовується (хіміотерапія з використанням цисплатину або ішемія), визначає роль ДК у зміні імунологічних реакцій. При ГПН, спричиненому цисплатином, абляція ДК або за допомогою трансгенних мишей, або через ін’єкцію ліпосомального хлордронату призводить до більшої травми, оскільки IL-10, що виробляється з ДК у цій моделі, врешті-решт необхідний для послаблення нефротоксичного пошкодження [39,40].
Рапаміцин: запалення, імунні клітини, ішемічне реперфузійне пошкодження (IRI)Раніше опубліковані дослідження продемонстрували захисну роль рапаміцину в моделях ГПН за допомогою досліджень IRI, які включали регуляцію інфільтрації та функції NKT-клітин, таким чином покращуючиураження нирок[41], у цьому дослідженні мишам тричі перорально вводили рапаміцин за 24 години, за 1 годину до ішемії та через 12 годин після ішемії. Хронічне пероральне введення мишам за день до цьогониркаIRI та кожен наступний день (до 7 днів) призвели до підвищенняураження нироквнаслідок інгібуваннянирковийпроліферація тубулярних клітин на 1 і 3 добу після ішемії [42]. Це було очевидно, як у моделі миші з односторонньою обструкцією сечоводу (UUO), де лікування рапаміцином покращувалониркафіброз шляхом прямого інгібування передачі сигналу mTOR у міофіфібробластах та інтерстиціальних макрофагах [43]. Ці дослідження показують, що рапаміцин може мати протилежні ефекти при різних гострих і хронічних захворюванняхниркамоделі. Проте різні дослідження повідомляли про шкідливу роль рапаміцину в тваринних моделях IRI. Пероральний прийом рапаміцину (4 мг/день) протягом 7 днів у йоркширських свиней порушував ендотеліально-залежну вазорелаксацію та посилював некроз міокарда на моделі оклюзії коронарної артерії [44]. Однак у мишей гостра терапія рапаміцином (за годину до ішемії, внутрішньоочеревинна ін’єкція) індукувала кардіозахист шляхом регулювання сигналізації JAK2-STAT3 для захисту від інфаркту міокарда [45]. Залежно від шляху (зонд, підшкірний або внутрішньоочеревинний), дозування (0.1–6 мг/кг/день), часу (ранній або відстрочений) [46] і типу використовуваної моделі (серце [47] , печінка [48] абонирка[41,49]), було показано, що рапаміцин є захисним [47] або не має захисного ефекту [50].
Клітинна терапія та рапаміцинРозмноження мишачих BMDC або людських CD14 плюс моноцитів, які ми вважаємо хронічними, викликало альтернативний захисний або регуляторний фенотип у DC, який регулював як вроджені, так і адаптивні імунні відповіді. У смертельній реакції «трансплантат проти хазяїна» ДК, створені за допомогою рапаміцину, мали знижений рівень MHC II і костимулюючих молекул, але мали більшу популяцію IL12, що продукує після стимуляції LPS. Ці IL12, що продукують Rapa-M-DC, посилюють алореактивний Т-клітинний апоптоз, механізм, який включає IFN [51]. Подібним чином CD14 плюс моноцити, розмножені в присутності рапаміцину, також продукували більш високі рівні IL12p70 разом з IL27, які регулювали функцію NK-клітин, таким чином змінюючи відповіді алогенних Т-клітин через IFN [52]. внирка,перенесення Tregs, оброблених рапаміцином, помітно пригнічувало відповіді Т-клітин, мієлоїдних клітин і міофібробластів, що призвело до покращення гострих і хронічниххвороба печінкипорівняно з прямим лікуванням мишей рапаміцином [53]. Подібним чином покращилася адоптивна передача оброблених рапаміцином мієлоїдних супресорних клітин (MDSC) мишамфункції нирокзі зменшеними гістологічними пошкодженнями та інфільтрацією імунних клітин [54]. Ці дослідження надають докази того, що клітинна терапія, яка передбачає обробку клітин рапаміцином перед ін’єкцією, дозволяє уникнути несприятливих побічних ефектів, які можуть бути пов’язані із системним лікуванням рапаміцином. Крім того, ми перевірили використання метформіну або таких сполук, як 5-аміноімідазол-4-карбоксамід-1- -4- рибофуранозид (AICAR), щоб індукувати регуляторний фенотип у мишачих DC, щоб перевірити їх роль у змініниркаIRI. Подібно до стратегії дозування, яка використовувалася для рапаміцину (Rapa-S-DC), ми лікували BMDC низькими дозами метформіну (1 мМ) або AICAR (1 мМ) на 7-й день разом із ЛПС. За день до цього ми системно ввели 0.5 x 106 метформіну-DC або AICAR-DCниркаIRI. Миші, які отримували або метформін-DC, або AICAR-DC, були значно захищені порівняно з мишами, які отримували NC або Veh-DC (неопубліковані спостереження, лабораторія Bajwa). Таким чином, кілька препаратів або сполук, які індукують метаболічні зміни або активують шлях AMPK, можуть бути заслуговуючими на тестування окремо або в комбінації. Варто зазначити, що використання кількох комбінацій препаратів або сполук (метформін або AICAR), які потенційно могли б доповнити захисні ефекти рапаміцину, ще належить дослідити під час оцінки їх використання в BMDCs. У ракових клітинах поєднання AICAR з рапаміцином підвищує ефективність рапаміцину для подальшого пригнічення mTORC2 для індукування апоптозу [55]. У Т-клітинах комбіноване використання метформіну та рапаміцину також було протестовано як потенційний метаболічний регулятор контрольної точки для впливу на функцію Т-клітин [56]. Таким чином, ці комбіновані терапевтичні модальності повинні бути перевірені в майбутньому з толерогенними або регуляторними BMDC як потенційними прямими або непрямими регуляторами метаболічних контрольних точок.
Рапаміцин: роль мітохондрій у дендритних клітинах і макрофагахФункції ДК і макрофагів регулюються мітохондріальним метаболізмом. Макрофаги типу 1 [57,58] та імуногенні DC (активація, опосередкована TLR) мають метаболічний перехід, у якому мітохондріальне окисне фосфорилювання інгібується ендогенно синтезованим оксидом азоту (NO) і прихильністю до високих аеробних гліколітичних показників [59]. Активація DC або макрофагів декількома агоністами TLR (LPS або CpG) призводить до швидкого посилення гліколізу з подальшим зниженням OXPHOS і потенціалу мітохондріальної мембрани [59–61]. Певна роль мітохондрій була продемонстрована за допомогою ДК, оброблених in vitro вітаміном D; ці ДК збільшують OXPHOS, мітохондріальну масу та виробництво mROS [62], наше нещодавнє дослідження з використанням FTY720 [18] показало подібні зміни в DC (вищий OXPHOS та менша імуногенність), було показано, що гостре лікування рапаміцином подовжує тривалість життя клітин ДК, який залежав від збереження мітохондріальної функції [10] через інгібування NO. На відміну від збільшення тривалості життя ДК, ті ж групи також повідомили, що гостре або короткочасне вплив рапаміцину на ДК також робить їх потужними активаторами антигенспецифічних CD8 плюс Т-клітин, таким чином посилюючи контроль меланоми B16 як вакцинація у мишей [63]. Гостра обробка (90 хв) ДК, отриманих з моноцитів людини, рапаміцином пригнічує імуностимулюючі молекули, індуковані ЛПС, і алостимулюючий потенціал, який включав нездатність обробленого ДКС посилювати передачу сигналів NF-kB [64]. У макрофагах рапаміцин пригнічує вироблення IL1 та IL-18після стимуляції LPS, процес, який також включає зниження мітохондріальних ROS (mtROS) шляхом прямого інгібування шляхів NLRP3 inflammasome-p38 MAPK-NF-kB [65]. Кондиціоновані рапаміцином DC (Rapa-DC) мишей і людей поводяться по-різному порівняно з мишачими Rapa-DC, людські Rapa-DC виявилися частково стійкими до дозрівання після проінфламаторних цитокінів і демонструють гетерогенність у регуляції ефекторної експансії Т-клітин і функція [66]. Значна частина імунорегуляторних властивостей кондиціонованих рапаміцином DC, отриманих з моноцитів, і їхня роль у трансплантації була елегантно розглянута Macedo та ін. [67].
Наші поточні результати вказують на те, що один або кілька DC, оброблених рапаміцином, мають знижений імуногенний та імуностимулюючий фенотип після стимуляції LPS. Передача цих DC захищаєниркивід IRI. Рапаміцин альтернативно регулює динаміку мітохондрій; тільки багаторазова обробка індукує більшу кількість мітохондрій. Ці дані свідчать про те, що мітохондріальна динаміка DC (вищий вміст мітохондрій), а також менший імуногенний фенотип, індукований рапаміцином, спільно захищаютьниркивід хімічного ураження. Хоча більш цікаво те, що наші дані з ДК, обробленими екзогенними мітохондріями, вказують на те, що більша кількість мітохондрій може подолати більш імуногенний стан ДК після стимуляції ЛПС, щоб також захиститиниркивід IRI. Буде цікаво підтвердити, чи більша кількість мітохондрій у ДК змінює відповіді Т-клітин, ДК справді мають здатність змінювати імунну відповідь, як показало наше попереднє дослідження. Наші попередні дані показують, що в дослідженнях проліферації алогенних Т-клітин ДК з більшою кількістю мітохондрій дійсно пригнічують проліферацію CD4 Т-клітин у змішаних лімфоцитних реакціях (MLR, дані не показані). Наразі незрозуміло, чи можуть ДК з більшою кількістю мітохондрій викликати відповідь Treg, яка могла б позитивно сприяти захистуниркивід IRI. Це буде фокусом наших наступних досліджень.
Висновки Таким чином, ми продемонстрували, що BMDC можуть регулюватиураження нирокза допомогою механізму, який включає біогенез мітохондрій або шляхом багаторазового лікування рапаміцином, або екзогенного збільшення кількості мітохондрій за допомогою екзогенних мітохондрій. Ми робимо висновок, що регуляторні DC (DC з більшою кількістю мітохондрій) можуть бути корисними дляниркаIRI, а також при інших запальних станах, таких як трансплантація та аутоімунні розлади для запобігання або лікування травм.