Полісахариди зизифуса пом'якшили анемію у щурів із хронічною хворобою нирок

Контакт: emily.li@wecistanche.com

Shiying Huang та ін

Анотація

Полісахариди зизифуса (JP) є одним з активних харчових гліканів у дієтичних плодах Ziziphus jujuba, який розглядається як засіб для лікування дефіциту крові. У цьому дослідженні ахронічнийнирказахворюванняМодель щурів (CKD) використовувалася для оцінки впливу JP та його механізму на анемію, пов’язану з ХХН. У щурів із ХХН лікування JP значно покращилосяниркафункція, ниркапатологічнийтравма, і гематологічні параметри, включаючи підвищення еритроцитів, гемоглобіну, гематокриту та кількості тромбоцитів. Крім того, результати цільової метаболоміки LC-MS/MS показали, що JP сприяє вивільненню коротколанцюгових жирних кислот (SCFA) у щурів із ХХН. Крім того, JP змінював рівень еритропоетину сироватки (ЕРО), мРНК ЕПО нирок іниркаБілок EPO через передачу сигналу HIF. Разом ці результати свідчать про те, що вплив JP на анемію, пов’язану з ХХН, може бути залучений до регуляції вивільнення SCFAs і виробництва еритропоетину, що підтримує подальший розвиток JP як харчових добавок для лікування анемії, пов’язаної з ХХН.

Ключові слова: полісахариди зизифусаХронічнийнирка захворюванняАнемія Еритропоетин Гіпоксія-індукований фактор - Коротколанцюгові жирні кислоти

Натисніть тут, щоб отримати більше інформації про Cistanche

1. Введення

Хронічнийнирка захворювання(ХХН) визначається як клінічний синдром структурних аномалій або функціональних порушень нирок і стає все більшим тягарем для охорони здоров’я в усьому світі (Webster, Nagler, Morton, & Masson, 2017). Ниркова анемія є одним з найпоширеніших ускладнень ХХН, які сприяють підвищеному ризику смерті (Locatelli et al., 2019). Недостатність виробництва еритропоетину (ЕРО) є визнаним головним рушійним фактором анемії при ХХН (Pappa, Dounousi, Duni, & Katopodis, 2015). ЕПО виробляється в печінці інирка, який необхідний для виробництва еритроцитів (Lappin & Lee, 2019). В умовах гіпоксії фактор, індукований гіпоксією (HIF), може активувати експресію EPO (Sch¨odel & Ratcliffe, 2019). Таким чином, націлювання на HIF для індукції виробництва EPO вважається новою терапевтичною стратегією лікування анемії, пов’язаної з ХХН.

Зизифус - це плоди Ziziphus jujuba Mill. (Rhamnaceae), також відомий як китайський фінік. Зизифус має давнє традиційне використання, що охоплює тисячі років, як лікарська рослина та харчова добавка. Зизифус використовують як оздоровчу добавку для людей, які страждають гематогенним або хронічним недоїданням. Полісахариди зизифуса (JP), водорозчинний компонент, що складається з різних пропорцій моносахаридів і уронової кислоти (Ji, Hou, Yan, Shi, & Liu, 2020), є одним із активних інгредієнтів у зизифусе (Ji et al., 2017). ), який, як було прийнято, демонструє гепатопротекторну та імуномодулюючу дію та покращує кишкову бар’єрну функцію (Liu et al., 2015, Yue et al., 2015). Дійсно, також зазвичай вважають, що JP потенційно впливає на анемію. Однак молекулярний механізм JP у лікуванні анемії все ще менш відомий.

В останні роки метаболоміка широко використовується для розуміння потенційних факторів, які сприяють прогресуванню захворювання. Цільова метаболоміка широко використовується для ідентифікації молекулярних маркерів складних захворювань людини, таких як ХХН. Індоксилсульфат (IS) і p-крезилсульфат (PCS) були підтверджені як біомаркери прогресування ХХН (Meijers & Evenepoel, 2011), а підвищений рівень триметиламін-N-оксиду (TMAO) міг безпосередньо призвести до тубулоінтерстиціального фіброзу та дисфункції нирок. (Tang et al., 2015). Коротколанцюгові жирні кислоти (КЖК), залежні від кишкових мікробів метаболіти, є енергетичними субстратами зі здатністю впливати на різні фізіологічні процеси (LeBlanc та ін., 2017), і, як повідомляється, зниження рівня КЦЖК сприяє прогресуванню ХХН. (Koh, De Vader, Kovatcheva-Datchary, & B¨ ackhed, 2016, Wang et al., 2019). Крім того, SCFA були здатні захистити структуру нирок від пошкодження через інгібування окисного стресу (Li, Ma, & Fu, 2017). Одночасно було виявлено, що SCFAs сприятливо впливають на всмоктування заліза та посилюють експресію ембріонального/фетального глобінового гена, що індукує еритропоез і коригує анемію (Tako, Glahn, Knez, & Stangoulis, 2014). Однак механізм дії SCFA при нирковій анемії все ще потребує з’ясування.

У цьому дослідженні ми припускаємо, що JP може регулювати вивільнення SCFAs і стимулювати HIF-опосередковане виробництво EPO, результатом якого є корекція ниркової анемії. Тут ми досліджуватимемо вплив JP на полегшення ниркової анемії у 5/6 щурів ХХН, викликаних нефректомією, включаючи функції нирок і гематологічні параметри. Цільовий метаболомічний підхід із використанням РХ-МС/МС розроблено для визначення восьми SCFA, включаючи оцтову кислоту, пропанову кислоту, ізомасляну кислоту, масляну кислоту, 2-метилмасляну кислоту, ізовалеріанову кислоту, валеріанову кислоту та гексанову кислоту у фекаліях та зразки нирок, і рівні цільових SCFAs оцінюють у здорових щурів і щурів із ХХН. Крім того, також виявлено участь сигналізації HIF у щурів, які отримували JP.

Рис. 1. Типова ГХ–МС хроматографія JP. (A) Структурні формули моносахаридів після дериватізації альдононітрилу ацетату; (B) Репрезентативні профілі GC-MS змішаної іонної хроматографії (MIC) стандартної суміші моносахаридів і гідролізованих моносахаридів JP. Піки в хроматографічних профілях відповідали хімічному маркеру, показаному на (A): 1. рамноза, 2. арабіноза, 3. фукоза, 4. ксилоза, 5. маноза, 6. глюкоза, 7. галактоза, 8. інозит (ISTD). ).

2. Матеріали та методи

2.1. Приготування полісахариду зизифуса

Плоди Z. jujuba були придбані у Shenzhen Huahui Pharmaceutical Co., Ltd. Матеріали були засвідчені доктором Jianping Chen відповідно до Фармакопеї Китайської Народної Республіки 2015 року. Зразки ваучерів зберігалися в лікарні традиційної китайської медицини Шеньчженя під номером 18100601.

Неочищений JP був витягнутий з зизифуса, як описано раніше, з незначними модифікаціями (Ji et al., 2020). Коротко, зизифус інкубували з 10 об’ємами води (об’єм/маса) на водяній бані при 80 ◦C протягом 3 годин і екстрагували 3 рази. Після фільтрації об’єднайте фільтрати та конденсуйте цю суміш у роторному випарнику під контрольованим вакуумом. Розчин концентрату далі осаджували додаванням чотирикратного етанолу (об./об.) при 4 ◦C протягом 12 годин. Осад збирали центрифугуванням і сушили при зниженому тиску насухо з отриманням неочищеного JP. За допомогою калориметрії було визначено, що чистота JP становить 80 відсотків.

2.2. Характеристика моносахаридного складу полісахариду зизифуса

Система Shimadzu GC–MS (Shimadzu GC–MS TQ8040 інтерфейс із Shimadzu GC 2010 plus), оснащена джерелом ЕІ, капілярною колонкою SH-Rxi-5Sil MS (30 м × 0,25 мм ID, 0,25 мкм товщина плівки, Shimadzu) використовували для визначення дериватизованих гідролізованих моносахаридів із співвідношенням розподілу 10:1. Температура інжекції, джерела іонів і межі розділу були 250 ◦C, 200 ◦C і 250 ◦C. Початкову температуру колонки підтримували на рівні 120 ◦C протягом 1 хвилини, потім підвищували на 15 ◦C/хв до 160 ◦C і підтримували протягом 4 хвилин, від 2 ◦C/хв до 165 ◦C і витримували 2 хвилини, 20 ◦C /

до 195 ◦C, 5 ◦C/хв до 250 ◦C і витримували 3 хв. Швидкість потоку газу-носія гелію підтримували на рівні 46 см/с, і 2 мкл кожного зразка вводили в прилад. Аналіти кількісно визначали в режимі моніторингу вибраних іонів (SIM), цільовий іон: рамноза (m/z 129.00), арабіноза (m/z 115.00), фукоза (m/ z 103.00), ксилоза (m/z 115.00), маноза (m/z 115.00), глюкоза (m/z 115.00 ), галактоза (m/z 115.00), інозит (m/z 126.00). Стандарти моносахаридів були перераховані таким чином: L (плюс)-арабіноза (1506–200202), фукоза (112014–201902), D-ксилоза (111508–201605), D-глюкоза (110833–201908), рамноза (111683–201502). ), галактоза (100226–201807), D-маноза (140651–201805) були придбані в Національних інститутах контролю за харчовими продуктами та ліками. Інозит був отриманий від Sigma (I7508-50 г).

Екстрагований JP (10 мг) гідролізували до моносахаридів за допомогою 10 мл 2 моль/л трифтороцтової кислоти (TFA) при 105 ◦C протягом 3 годин, а гідролізовані моносахариди з JP концентрували та промивали при зниженому тиску при 60 ◦C до видаляють TFA, і залишки розчиняють 2 мл води. Додавали 250 мкл 20 мг/мл розчину гідрохлориду гідроксиламіну/піридину в 100 мкл розчину гідролізованих моносахаридів і витримували на водяній бані при 90 ◦C протягом 45 хвилин. Потім додають 250 мкл оцтового ангідриду і витримують на водяній бані при 90 ◦C ще 45 хвилин. Наприкінці реакції суміш екстрагували 1 мл циклогексану 5 разів і циклогексановий шар концентрували до 1 мл. Ввели 1 мкл супернатанту в ГХ-МС для аналізу (Li & Shi, 2013).

2.3. Тварини

Усі експерименти проводили згідно з протоколами, схваленими Інституційним комітетом з догляду за тваринами Університету китайської медицини Гуанчжоу. Щури Sprague–Dawley, самці та самки, вагою 180–220 г, були отримані з Гуандунського медичного лабораторного центру тварин (Фошань, Китай, дозвіл № SCXK (Yue) 2008–0002) і утримувались у спеціальному вільному від патогенів (SPF) ) тваринницьке приміщення з 12-годинним циклом світло-темрява, без їжі та води.

Для індукованої ниркової недостатності була виконана 5/6 нефректомія згідно з попереднім описом (Chen et al., 2019). Всі хірургічні операції проводилися під наркозом 10% хлоралгідратом. Група фіктивної операції (n=6) зробила ті самі дії, щоб відкрити черевну порожнину та оголити нирку. Щурів із нефректомією 5/6 випадковим чином розділили на дві групи. Щури без лікування (група CKD, n=6) і щури, які отримували JP (група CKD плюс JP, n=6) ​​перорально через зонд у дозі 1,2 г/кг/день. Після 90 днів роботи почалося 90 днів адміністрування. 90-й день був останнім часом введення JP щурам, і через 24 години тварин умертвляли, беручи кров із черевної аорти, і відбирали зразки сечі, фекалій, сироватки та нирок у кожного щура. Усі зразки зберігали при -80 ◦C перед подальшим аналізом.

2.4. Біохімічний аналіз

Дотримуючись інструкцій виробника, азот сечовини крові (BUN) і креатинін сироватки (Scr) вимірювали набором для визначення креатиніну в сироватці крові та набором для виявлення BUN (WAKO, Ginza, Японія), а білок у сечі вимірювали набором Elisa (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institution, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institution, Japan). Нанкін, Китай). Еритроцити (RBC), гемоглобін (Hb), гематокрит (HCT) і кількість тромбоцитів (PLT) були проаналізовані за допомогою Hematology Systems (Siemens 2021i, Ерланген, Німеччина) відповідно до інструкцій виробника.

2.5. Гістологічне дослідження

Для оцінки патологічного ураження нирок використовували фарбування періодичною кислотою-Шиффом (PAS) і Массоном, серед яких фарбування PAS використовували для виявлення атрофії ниркових канальців і клубочкової зони, а фарбування Массона використовували для виявлення інтерстиціального фіброзу нирок (Xie et al. , 2020). Метод кількісного аналізу проводився відповідно до попередніх досліджень (Chen et al., 2019). Коротко кажучи, оцінка атрофії канальців при фарбуванні PAS була визначена таким чином: 1. рідкісні одиничні атрофічні канальці; 2. кілька скупчень атрофічних канальців; 3. масивна атрофія. Площу клубочків вимірювали за допомогою програмного забезпечення ZEN 3.1 (Axio Scope A1, ZEISS, Єна, Німеччина). Фіброзну ділянку при фарбуванні за Массоном вимірювали за допомогою програмного забезпечення Image J (NIH, Bethesda, MD, США). Принаймні десять мікроскопічних полів (200×) по 6 щурів на групу були захоплені випадковим чином для вимірювання оцінки атрофії, клубочкової області та фіброзної області, принаймні з одним клубочком у кожному мікроскопічному полі.

2.6. Імуногістохімічний аналіз

Нирковий парафіновий зріз (4 мкм) з кожного зразка поступово дегідратували ксилолом двічі та градієнтним етанолом (100–95–90–80–70 відсотків), антиген витягували за допомогою буфера лимонної кислоти (pH 6,0). ) протягом 30 хвилин, блокували 3% перекисом водню протягом 10 хвилин і козячою сироваткою протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Зрізи тканини інкубували окремо з первинним антитілом HIF-1 (Bioss, bs-0737R, 1: 500, партія: BA01279129), HIF-2 (Bioss, bs-1447 R, 1: 500, лот: BJ2044786) при 4 ◦C протягом 10 годин і HRP-кон’юговане козяче антикроляче вторинне антитіло (Abcam, ab6712, 1:1000) при кімнатній температурі протягом 30 хвилин, DAB (діамінобезид в) використовували для Для виявлення активності HRP ядро ​​контрафарбували гематоксиліном. в. Імуногістохімію аналізували під мікроскопічними полями 400× для кожної групи та фіксували шкалу=20 мкм Axio Scope A1, ZEISS, Єна, Німеччина. Ядро було забарвлене гематоксиліном у блакитний колір, а імунопозитивність DAB була коричневою; глибше фарбування DAB означає сильніший імуногістохімічний позитивний результат.

2.7. Виявлення EPO

Вміст EPO в сироватці виявляли за допомогою набору ELISA (Abcam, ab274398), а експеримент проводився за протоколом набору ELISA. Як підсумовано, до зразка додали коктейль антитіл EPO та інкубували протягом 1 години. після інкубації промивали кожну лунку промивним буфером 3 рази, до другої інкубували протягом 15 хвилин ТМВ і зупиняли реакцію.

Тотальну мРНК нирок екстрагували із замороженої ниркової тканини за допомогою Тризолу та транслювали мРНК у кДНК. ПЛР у реальному часі проводили за допомогою Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA, K0223) згідно з протоколом виробника. Зелений сигнал SYBR був отриманий і виміряний за допомогою ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Праймерами були: 5′-CCG TCC CAG ATA CCA AAG TC-3′ і 5′-ACC CGA AGC AGT GAA GTG-3′ для EPO щурів (214 bps, NM_017001). 2); 5′- GTC GGT GTG AAC GGA TTT G-3′ і 5′-TCC CAT TCT CAG CCT TGA C- 3′ для GAPDH (181 біт/с, NM_017008.3), housekeeping gens як внутрішній контроль у всіх випадках. А відносну кількісну оцінку експресії генів розраховували методом нормалізованої експресії генів (2− ΔΔCT).

Рівну кількість білка лізату кори нирок завантажували та розділяли 10-відсотковим SDS-гелем, а потім переносили на нітроцелюлозні мембрани. Після блокування в 5-відсотковому знежиреному молоці протягом 2 годин при кімнатній температурі мембрани інкубували з первинним антитілом при 4 ◦C протягом ночі. Потім мембрани інкубували з антимишачими IgG (Life Technologies), кон’югованими з HRP (пероксидазою хрону) при кімнатній температурі протягом 45 хв. Активність HRP візуалізували за допомогою Clarity Western ECL Substrate та аналізували за допомогою системи візуалізації Tanon. У цьому дослідженні використовували такі первинні антитіла: моноклональний EPO (B- 4) від мишей (Santa Cruz Biotechnology, sc-5290, розведення 1/500), моноклональний -актин від мишей (технологія передачі сигналів клітинами, 8H10D10, розведення 1/1000).

2.8. Аналіз коротколанцюгових жирних кислот

Система Shimadzu UHPLC-LCMS/MS (Shimadzu LC-MS 8045 інтерфейс із Shimadzu LC-20AD), оснащена джерелом ESI.

Хроматографічне розділення проводили на колонці Shim-pack GIST C18 (2,1 × 100 мм, 2 мкм), використовуючи {{10}}.1% мурашиної кислоти у воді ( розчинник A) і ацетонітрил (розчинник B) зі швидкістю потоку 0,3 мл/хв шляхом градієнтного елюювання: 0–9 хв, 25–30 відсотків B; 9–11 хв, 30–40 відсотків B; 11–20 хв, 40–50 відсотків B; 20–20,1 хв, 50–100 відсотків B; 20,1–23 хв, 100 відсотків B; 23,1 хв–25 відсотків В для повторного врівноваження. Температура колонки становила 35 ◦C, а автосамплер підтримували при 4 ◦C під час аналізу, 1 мкл кожного зразка вводили в прилад. Виявлення аналіту проводили в режимі моніторингу множинних реакцій (MRM), який працював у режимі позитивних іонів. Параметри МС: потік розпилюючого газу: 3,0 л/хв; Потік сушильного газу: 10 л/хв; Опалення Газ потік: 10 л/хв; Температура DL: 250 ◦C; температура розділу: 300 ◦C; Блок нагріву: 400 ◦C. Переходи MRM і енергія зіткнення (CE) були обрані та оптимізовані прямим введенням кожної стандартної похідної. Переходи MRM кількості аналітів були підсумовані в таблиці S1.

Фекальні SCFAs: Додано 100 мкл 50% ацетонітрилу в 3 мг ліофілізованих фекалій і перемішано протягом 2 хвилин. Потім суміш центрифугували при 12000 об/хв протягом 10 хв при 4 ◦C і піпетували супернатант.

Ниркові SCFA: зважили 100 мг ниркової тканини та перемішали на льоду з 4-кратним фізіологічним розчином (100 мг/400 мкл) для приготування тканинного гомогенату. Додавали 3 рази холодний метанол у 300 мкл тканинного гомогенату та перемішували протягом 2 хвилин, потім суміш центрифугували при 12000 об/хв протягом 10 хвилин при 4 ◦C і піпеткою внесли супернатант. Супернатант сушили N2 і відновлювали 100 мкл 50% ацетонітрилу.

Додано 500 ммоль/л гідрохлориду N-(3-диметиламінопропіл)-Ń-етилкарбодиіміду (EDC, Aladdin, Шанхай, Китай), 50 ммоль/л 3H-[1,2,3]-триазоло[4, 5-b] піридин-3-ол (HOAT, Aladdin, Шанхай, Китай) і 50 мг/мл 12C-дансилгідразину (12C-DnsHz, J&K, Пекін, Китай) у 20 мкл екстракції зразка в послідовності з однаковим обсягом. EDC і HOAT готували зі свіжою 500 ммоль/л 2-(N-морфоліно) етансульфонової кислоти (MES, Маклін, Шанхай, Китай). Після інкубації при 20 ◦C протягом 90 хвилин до суміші додавали 20 мкл 50 ммоль/л CuCl2 (Macklin, Шанхай, Китай), щоб погасити реакцію дериватизації при 40 ◦C протягом 30 хвилин (Zhao & Li, 2018). Наприкінці дериватізації суміш розбавляли 25% ацетонітрилом у 10 разів. Перед аналізом 100 мкл супернатанту змішували зі 100 мкл розчину внутрішнього стандарту. Мітку 13C-DnsHz використовували як внутрішні стандарти (ISTD1-8) відповідно до тієї ж реакції дериватізації. Стандарт SCFA: оцтова кислота (AA, A116173), пропанова кислота (PA, P110446), ізомасляна кислота (IBA, I103524), масляна кислота (BA, B110438), 2-метилмасляна кислота (2- BA, M107377), ізовалеріанова кислота (IVA, I108280), валеріанова кислота (VA, V108271), гексанова кислота (HA, H103632) були поставлені з Aladdin (Шанхай, Китай).

2.9. Статистичний аналіз

Дані кожної групи виражали як середнє ± стандартне відхилення (SD). Статистичну значущість серед груп проводили за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу та ретроспективного аналізу за допомогою тесту Стьюдента-Ньюмана-Кеулса (SNK) або тесту T3 Даннетта. Значення P < 0.05="" вважалося="" статистично="" значущим.="" усі="" дані="" були="" отримані="" за="" допомогою="" програмного="" забезпечення="" для="" статистики="" spss="" (версія="" 22.0,="" spss="" inc.,="" чикаго,="" іллінойс,="">

3. Результати

3.1. JP покращив функцію нирок щурів із ХХН

Моносахарид JP був охарактеризований перед лікуванням на тваринах. JP, використаний у цьому дослідженні, складався з семи моносахаридів, тобто рамнози (1,62 відсотка), арабінози (15,79 відсотка), фукози (0.21 відсотка), ксилози (4,56 відсотка), манози (3. 00 відсотка), глюкози (73,44 відсотка) і галактози (4,99 відсотка) (рис. 1). Наш метод аналізу підтверджено лінійністю, точністю, повторюваністю, стабільністю та відновленням (таблиці S2–S3). Було підтверджено, що аналіти стабільні при кімнатній температурі протягом 24 годин. Вихід JP має бути вищим за 8,63 відсотка, а чистота – не менше 77,16 відсотка. Вищезазначений хімічний аналіз JP служив підходом до контролю якості для забезпечення відтворюваності наведених нижче досліджень на тваринах.

Scr, BUN і білок сечі були найбільш характерними для функцій нирок. Рівні Scr, BUN і білка в сечі у щурів із ХХН були значно вищими, ніж у фіктивної групи (P < {{0}},01).="" після="" 90="" днів="" лікування="" jp="" рівні="" scr,="" bun="" і="" білка="" в="" сечі="" знизилися="" порівняно="" з="" групою="" ххн="" (p="">< 0,01)="" (рис.="">

3.2. JP полегшив патологічне ураження нирок у щурів із ХХН

Для оцінки морфології нирки за допомогою маси нирки (KW) і маси нирки/маси тіла (KW/BW) використовували вагу цілої правої нирки для фіктивної групи та залишкової правої нирки для ХХН та групи ХХН плюс JP. Наприкінці експериментів KW і KW/BW у групі ХХН були збільшені порівняно з групою імітації (всі P < {{0}}.05).="" у="" моделі="" ххн,="" викликаної="" нефректомією="" 5/6,="" зниження="" активності="" ниркової="" протеїнази="" викликало="" компенсаторний="" ріст="" нирок,="" компанії="" з="" гіпертрофією="" нирок="" (morton="" &="" griffiths,="" 1985),="" і="" ми="" підтвердили="" це="" твердження.="" після="" лікування="" jp="" kw="" значно="" знизився="" (p="">< 0.05)="" і="" був="" закритий="" для="" фіктивної="" групи="" (p="" ˃="" 0.05);="" тоді="" як="" kw/bw="" дещо="" знизився="" (p="" ˃="" 0,05).="" (рис.="">

Рис. 2. JP захистив функцію нирок у щурів із ХХН. Рівень Scr (A), BUN (B) і білка в сечі (C) в різних групах. (D) вага нирки, (E) кВт/мт. Дані були представлені як середнє значення ± SD, n=6 на групу (**P < 0.01="" порівняно="" з="" фіктивною="" групою;="" #p="">< 0).05="" ,="" ##p="">< 0,01="" порівняно="" з="" групою="">

У групі ХХН спостерігалася масивна атрофія ниркових канальців порівняно з групою плацебо (P < {{0}}.01),="" а="" область="" клубочка="" та="" нирковий="" інтерстиціальний="" фіброз="" були="" майже="" вдвічі="" більшими,="" ніж="" у="" кількісному="" аналізі="" фіктивної="" групи="" (p="">< 0.01).="" після="" лікування="" jp="" оцінка="" канальцевої="" атрофії="" знизилася="" майже="" вдвічі="" (p="">< 0,01),="" площа="" клубочка="" майже="" відновилася="" до="" фіктивної="" групи="" (p="">< 0,01),="" а="" нирковий="" інтерстиціальний="" фіброз="" зменшився="" на="" третину="" (p="">< 0,01),="" як="" порівняно="" з="" групою="" ххн="" (рис.="">

Рис. 3. JP захистив структуру нирок у щурів із ХХН. (A) Фарбування PAS. (B) Фарбування за Массоном. (C) Оцінка тубулярної атрофії. (D) Гломерулярна зона (E) Фіброзна зона. Усі зображення представлені з однаковим збільшенням, 200×, масштабна шкала=100 мкм. Дані були представлені як середнє значення ± стандартне відхилення, n=6 на групу (**P < 0.01="" порівняно="" з="" фіктивною="" групою;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" порівняно="" з="" групою="" ххн="">

3.3. JP модулював гематологічні параметри у щурів із ХХН

Для гематологічних показників вимірювали біохімічний аналіз еритроцитів, Hb, HCT і PLT. У щурів із ХХН рівень еритроцитів знизився з 906 до 7,20 × 1012/л, Hb з 15,28 до 13,22 г/дл, HCT з 47,1 до 40,4 відсотка, а PLT підвищився. від 1012 до 1526 × 109 /л порівняно з фіктивною групою (P <0,01), що="" вказує="" на="" те,="" що="" ознаки="" анемії="" спостерігалися="" у="" щурів="" із="" ххн.="" знижені="" рівні="" еритроцитів,="" гемоглобіну,="" hct="" і="" plt="" у="" щурів="" із="" ххн,="" які="" отримували="" jps,="" відновилися="" (p=""><0,01) (рис.="">

Рис. 4. JP відновив гематологічні параметри у щурів із ХХН. Рівень PLT (A), RBC (B), Hb (C), HCT (D). Дані були представлені як середнє значення ± SD, n=6 на групу (**P < 0.01="" порівняно="" з="" фіктивною="" групою;="" #p="">< 0).05="" ,="" ##p="">< 0,01="" порівняно="" з="" групою="">

3.4. JP стимулював експресію EPO

Порівняно з фіктивною групою рівень ЕПО в сироватці крові та кількість мРНК ЕПО в нирках були значно знижені у щурів із ХХН-анемією (P < 0.01).="" аналіз="" вестерн-блоттингу="" виявив,="" що="" рівень="" білка="" epo="" дещо="" знижується="" в="" групі="" ххн="" без="" істотної="" різниці.="" після="" лікування="" jp="" рівень="" epo="" в="" сироватці="" крові,="" мрнк="" epo="" нирок="" і="" білок="" були="" значно="" підвищені="" порівняно="" з="" групою="" ххн="" (p="">< 0.01="" або="" p="">< 0.05)="" (рис.="">

У корі нирки HIF-1 в основному продукувався епітеліальними клітинами ниркових канальців, HIF-2 в основному експресувався в ендотеліальних клітинах та ниркових інтерстиціальних фібробластах (Sch¨odel & Ratcliffe, 2019). Імуногістохімічний аналіз показав, що, як і для HIF-1, у щурів із ХХН канальці були сильніше забарвлені, ніж у фіктивній групі. Після лікування JP ниркові канальці мали сильніше та більше фарбування порівняно з групою ХХН, як показано червоною стрілкою на рис. 5E. HIF-2 показав відносно слабкий імуногістохімічний позитивний результат на нирковий інтерстиціальний у групі Sham. У групі ХХН HIF-2 показала позитивний імуногістохімічний результат. Після лікування JP HIF-2 продемонстрував сильніші імуногістохімічні показники порівняно з групою ХХН (рис. 5F).

Рис. 5. JP стимулював експресію EPO. (A) Вміст EPO в сироватці крові. (Б)ниркаEPO відносна мРНК. GAPDH вважався геном домашнього господарства. (C) Репрезентативні вестерн-блот зображення експресії білка EPO. (D) Денситометричний аналіз EPO. (E) Імуногістохімія HIF{{0}}. (F) Імуногістохімія HIF- 2, нормалізована до вмісту -актину. Імуногістохімічні зображення представлені з однаковим збільшенням, 400×, шкала=20 мкм. Ядро було забарвлене гематоксиліном у блакитний колір, а імунопозитивність DAB була коричневою; глибше фарбування DAB означає сильніший імуногістохімічний позитивний результат. Червона стрілка вказує на позитивний імуногістохімічний результат. Дані були представлені як середнє значення ± стандартне відхилення, n=6 на групу (*P <0,05 порівняно="" з="" групою="" фіктивного="" лікування;="" #p=""><0,05, ##p=""><0,01 порівняно="" з="" групою="">

3.5. JP викликав вивільнення SCFA

Для кількісного визначення вивільнення восьми SCFA у зразках фекалій було розроблено цільовий метаболомічний підхід на основі РХ-МС. Встановлений метод перевірено шляхом оцінки лінійності, чутливості, прецизійності, ефекту матриці, точності та стабільності. Зразки контролю якості з низькою, середньою та високою концентрацією (LQC, QMC, HQC) для перевірки чутливості, прецизійності, точності та стабільності були відібрані відповідно до точок найнижчої, середньої та найвищої концентрації стандартної кривої матриці, а результати були показані в таблицях S4–S6. Було підтверджено, що аналіти стабільні при 4 ◦C протягом 48 годин. LC-MS/MS хроматограма SCFAs була показана на рис. 6.

Рис. 6. УВЕРХ-МС/МС хроматографія SCFA. (A) Верхнє було хімічним рівнянням дериватізації SCFA; нижче була структурна формула SCFA після дериватізації дансилгідразину; (B) Хроматограма UHPLC/MRM-MS стандартів суміші та фекального зразка, хроматографічні піки в (B) відповідали хімічному маркеру, показаному в (A):1. 12C-оцтова кислота; 2. 13C-оцтова кислота (ISTD1); 3. 12С-пропанова кислота; 4. 13C-пропанова кислота (ISTD2); 5. 12C-ізомасляна кислота; 6. 12С-масляна кислота; 7. 13C-ізомасляна кислота (ISTD3); 8. 13C-масляна кислота (ISTD4); 9. 12C-2-метилмасляна кислота; 10. 12С-ізовалеріанова кислота; 11. 12C валеріанова кислота; 12. 13C-2-метилмасляна кислота (ISTD5); 13. 13C-ізовалеріанова кислота (ISTD6); 14. 13C-валеріанова кислота (ISTD7); 15. 12С-гексанова кислота; 16. 13C-гексанова кислота (ISTD8).

Що стосується зразків фекалій, у групі ХХН рівні AA та PA були помітно знижені майже в 4 та 5 разів порівняно з групою фіктивних (P < 0.01);="" у="" той="" час="" як="" після="" лікування="" jp,="" кількість="" aa="" та="" pa="" була="" відновлена="" ​​до="" 4/5="" фіктивної="" групи="" (p="">< {{10}}.01).="" подібним="" чином="" рівні="" ба="" та="" ва="" були="" суттєво="" знижені="" майже="" в="" 30="" рази="" та="" 4="" рази="" в="" групі="" ххн="" порівняно="" з="" фіктивною="" групою="" (p="">< 0,01).="" лікування="" jp="" продемонструвало="" тенденцію="" до="" зростання,="" але="" не="" суттєвого="" покращення.="" вміст="" iba,="" iva="" та="" 2-ba="" не="" показав="" помітних="" змін="" між="" ххн="" та="" фіктивною="" групою.="" після="" лікування="" jp="" рівень="" iba,="" iva="" та="" 2-ba="" був="" підвищений="" (p="">< 0,01).="" однак="" ha="" не="" виявив="" очевидних="" змін="" серед="" трьох="" груп="" (рис.="" 7a).="" більше="" того,="" що="" стосується="" ниркової="" тканини,="" у="" групі="" ххн="" кількість="" усіх="" восьми="" scfas="" була="" значно="" знижена="" (p="">< 0,01),="" тоді="" як="" після="" лікування="" jp="" рівні="" scfas="" були="" підвищені,="" за="" винятком="" ba="" та="" ha="" (p="">< 0,01="" або="" p="">< 0,5).="" ба="" трохи="" збільшувалася="" без="" значного,="" а="" га="" не="" показала="" змін="" після="" лікування="" jp="" (рис.="">

Рис. 7. Вміст SCFAs в різних групах. (A) Фекальні SCFA. (B) SCFA нирок. Дані були представлені як середнє значення ± стандартне відхилення, n=6 на групу (**P < 0.01="" порівняно="" з="" фіктивною="" групою;="" ##p="">< 0).="" 01,="" #p=""><0,05 порівняно="" з="" групою="">

4. Обговорення

У даній моделі щурів із ХХН після 5/6 нефректомії,ниркафункціязначно підвищилися показники (Scr, BUN, білок сечі), виникла залишкова гіпертрофія нирки та патологічне ураження нирок, що супроводжувалося зміною гематологічних показників. Ці дані узгоджувалися з попередніми дослідженнями (Garrido et al., 2015, Morton & Griffiths, 1985). Вищевказані показники показали, що анемія ХХН у щурів, спричинена нефректомією 5/6, була успішно встановлена ​​та може бути підтверджена на сприятливий ефект JP при лікуванні анемії щурів ХХН. Зниркафункціяподальшого погіршення, анемія була визнана відомим опортуністичним ускладненням ХХН, яке негативно впливало на якість життя пацієнтів (Locatelli, Fishbane, Block, & Macdougall, 2017). Розуміння факторів ризику, пов’язаних із прогресуванням ниркової анемії, допоможе розробити терапевтичні підходи. Сьогодні все більше уваги привертає зв’язок між хворобою та метаболізмом кишкової мікробіоти, тоді як зв’язок між SCFA та нирковою анемією все ще менш відомий. SCFA, які в основному метаболізуються Clostridium, Coprococcus і Bacteroides (Koh et al., 2016), націлені на специфічні мембранні рецептори, які відіграють важливу роль у підтримці балансу кишкового середовища та здоров’я всього тіла. Вже доведено, що SCFA мають нерозривний зв’язок із ХХН, і рівні оцтової кислоти, пропіонової кислоти та масляної кислоти були знижені при ХХН (Wang et al., 2019). У щурів із ХХН, спричиненою аденіном, кількість і різноманітність кишкової мікробіоти значно змінилися, компанії знизили рівень пропанової кислоти, масляної кислоти та валеріанової кислоти (Lakshmanan, Al, Ali, & Terranegra, 2021). Ґрунтуючись на нашому попередньому дослідженні, секвенування 16S рДНК показало, що дисбактеріоз кишкової мікробіоти спостерігався у 5/6 щурів із ХХН, індукованим нефректомією, порівняно з групою фіктивного лікування. Деякі види SCFAs, що продукують масляну кислоту з Clostridium, Coprococcus, показали відмінності у щурів із ХХН (Zheng et al., 2020). Згідно з цим, наші результати показали, що кількість оцтової кислоти, пропіонової кислоти, масляної кислоти, валеріанової кислоти була знижена приблизно на 60 відсотків, 80 відсотків, 85 відсотків і 60 відсотків у щурів із ХХН, що вказує на те, що зниження SCFAs відповідало з дисбалансом кишкового середовища. Слід зазначити, що спричинений ХХН розлад кишкового середовища викликав аномальний метаболізм кишкової мікробіоти (Feng та ін., 2019). Крім того, ми виявили, що у щурів із ХХН-анемією було знижено вісім типів SCFA. Наприклад, аномалія метаболічних кінцевих продуктів, тобто SCFA, може бути результатом прогресування ХХН.

Полісахариди, один з активних інгредієнтів, були знайдені в різних травах, таких як Dioscoreae Rhizoma, Schisandra Chinensis, Astragali Radix і Jujubae Fructus. Полісахариди можуть бути ферментовані та розщеплені кишковою мікробіотою. У результаті полісахариди представлені як субстрат для кишкової мікробіоти для метаболізму в SCFAs або вважаються такими, що володіють пребіотикоподібним ефектом для поліпшення складу кишкової мікробіоти для полегшення виробництва SCFAs (Cai et al., 2019). У цьому дослідженні наші результати показали, що полісахариди з зизифуса стимулюють вивільнення кишковою мікробіотою SCFAs, таких як оцтова кислота, пропанова кислота, ізомасляна кислота, 2-метилмасляна кислота у щурів із ХХН. Крім того, після лікування JP рівень SCFAs у нирках щурів із ХХН-анемією покращився, і тенденція зміни відповідала зразку фекалій. Ґрунтуючись на існуючих дослідженнях, взаємозв’язок між SCFAs і ХХН поступово став ясним. Наприклад, повідомлялося, що оцтова кислота модулює імунну систему та полегшує гострі захворюванняниркатравмашляхом інгібування передачі сигналів НАДФН-оксидази в Т-клітинах (Al-Harbi et al., 2018). Доведено, що пропанова кислота запобігає прогресуванню ХХН, спричиненої аденіном, через рецептор 2 вільної жирної кислоти (FFA2) і FFA3 (Mikami et al., 2020). Таким чином, ми зробили висновок, що відновлений рівень SCFA у нирках був корисним для хворої нирки. Повідомлялося, що JP збільшив різноманітність мікробіоти кишечника та збільшив відносну кількість SCFAs активної мікробіоти (Bacteroides) у мишей колоректального раку (Ji та ін., 2020). Крім того, JP збільшив концентрацію загальних SCFAs у зразках фекалій (Ji et al., 2019). Таким чином, ми прийшли до висновку, що JP може стимулювати виробництво SCFA для досягнення мети уповільнення прогресування ХХН. JP також може бути субстратом метаболізму для домінантної мікробіоти SCFAs для стимулювання виробництва SCFAs у ХХН, або пребіотикоподібного компонента для відновлення кишкового середовища, особливо різноманітності домінантної мікробіоти SCFAs, і подальшого сприяння вивільненню SCFAs, щоб запобігання прогресуванню ХХН.

Загалом, SCFA (без вуглецю, ніж 6) з малою молекулярною масою та високою хімічною полярністю важко проаналізувати безпосередньо за допомогою хроматографічних підходів. Стратегія міченої ізотопами хімічної дериватизації SCFA може покращити чутливість приладу та зменшити помилки аналізу, що забезпечить корисну стратегію визначення SCFA в аналізі LC-MS/MS (Higashi & Ogawa, 2016). Нещодавно підходи, мічені дансилгідразином, були успішно використані для виявлення цільових метаболітів плазми людини, що містять карбонову кислоту (Chen & Zhang, 2020). На підтримку цього в цьому дослідженні ми розробили хімічну дериватізацію на основі підходу LC-MS/MS для визначення 8 SCFA у фекаліях щурів. SCFA виробляються кишковою мікробіотою, і майже 10 відсотків SCFA виводиться з калом (Boets et al., 2015). Таким чином, аналіз фекальних зразків SCFAs може безпосередньо відображати зміни в середовищі кишківника та має більшу референцію в мультиомічному спільному аналізі SCFAs та кишкової мікробіоти. Примітно, що під час перевірки нестабільності ми виявили, що SCFA, мічені дансилгідразином, були нестабільними при кімнатній температурі, а їх інтенсивність у мас-спектрі мала тенденцію до зниження з часом, але вона могла залишатися стабільною протягом 48 годин при 4 ◦C. Таким чином, після дериватізації SCFA аналіти слід зберігати при 4 ◦C перед аналізом.

На пізніх стадіях ХХН 4–5 дефіцит виробництва ЕПО обмежує еритропоез, що сприяє найважливішому фактору розвитку ниркової анемії (Sakashita, Tanaka, & Nangaku, 2019). Звичайне лікування анемії препаратами, що стимулюють еритропоез (ESA), пропонується клінічними рекомендаціями. Однак слід потурбуватися про безпеку ЕСА, яка пов’язана з підвищеним ризиком смерті та серцево-судинних подій (Thavarajah & Choi, 2019). У пацієнтів з нирковою анемією експресія EPO повинна була бути постійною або помітно підвищеною порівняно зі здоровими тілами (Babitt & Lin, 2012). На ранній стадії рівень EPO продемонстрував тенденцію підвищення, тоді як на пізній стадії рівень EPO продемонстрував тенденцію до зниження порівняно з ранньою стадією, навіть нижчу за норму (Panjeta, Tahirovi´c, Sofi, ´ Cori та Derviˇsevi). ´c, 2017). Відповідно до попередніх експериментів (Chen та ін., 2019; Wang та ін., 2020), наші результати показали, що рівень ЕПО в сироватці був знижений у щурів із ХХН та анемією. Відповідно, ми виявили мРНК ниркового EPO та рівень білка у щурів із ХХН, і рівень білка ниркового EPO дещо знизився порівняно з фіктивною групою, тоді як кількість мРНК ниркового EPO була знижена, а її ступінь був більшим, ніж рівень EPO в сироватці. Нирки є основним джерелом синтезу ЕПО у дорослих і хворих на ХВЗР.ниркивсе ще зберігає здатність виробляти еритропоетин (Bernhardt et al., 2010). Для корекції ендогенних рівнів EPO в сироватці та адаптації до ниркової анемії було активовано вироблення EPO нирками, хочаниркатравмазнижена експресія мРНК EPO (Sch¨odel & Ratcliffe, 2019). Після лікування JP рівень EPO в сироватці крові був підвищений, а також рівні мРНК EPO нирок і білка були підвищені. У нашому попередньому дослідженні JP міг стимулювати транскрипційну активність HRE та посилювати ген EPO (Chen та ін., 2014). Таким чином, ми припустили, що JP може відновити рівень EPO в сироватці щурів із ХХН до регульованої ниркової анемії, чому може сприяти стимульована експресія гена EPO нирок на рівні мРНК.

У кірковій речовині HIF-1 знаходили переважно в канальцях, а HIF-2 — в інтерстиції нирок. Оскільки EPO в основному виробляється фібробластами, в яких HIF-2 розміщений разом, це підтверджує те, що HIF-2 може регулювати виробництво EPO (Maxwell, 2003). У нашому дослідженні ми виявили, що HIF-1 і HIF-2 можуть активуватися ХХН, а лікування JP може стимулювати активність HIF-1 і HIF-2 порівняно з щурами ХХН . Було доведено, що HIF-2 відіграє важливу роль у регуляції виробництва EPO (Kapitsinou et al., 2010), тоді як посилення HIF-1 може відігравати захисний ефект нирок (Jiang et al. al., 2020), що опосередковано покращує виробництво EPO. Виробництво EPO нирками спочатку регулювалося на рівні мРНК, при анемії або гіпоксії експресія мРНК EPO могла бути збільшена стимуляцією білка HIF. Раніше фармакологічні дослідження показали, що зизифус стимулював експресію EPO через регуляцію рівня HIF-білка в клітинній моделі (Chen та ін., 2014, Lam та ін., 2016). Таким чином, ми зробили висновок, що JP може посилити експресію мРНК EPO через білок HIF для досягнення мети полегшення ниркової анемії.

Крім того, виходячи з поточних результатів, ми припускаємо, що зниження SCFA може відігравати вирішальну роль у HIF-опосередкованій експресії EPO, яка сприяє ХХН-анемії. Усупереч цьому було показано, що підвищений рівень оцтової кислоти сприяв ацетилюванню HIF-2 і генеруванню комплексу CREB-зв’язуючий білок-HIF 2 і додатково індукував експресію EPO (Xu et al., 2014). Пропіонова кислота послабила руйнування мітохондрій, апоптоз гіпокампа та неврологічний дефіцит за допомогою шляху HIF-1 /ERK (Cheng et al., 2019). Крім того, було виявлено, що масляна кислота стабілізує HIF-1, активні цільові гени HIF на клітинах товстої кишки та пом’якшує запальну реакцію товстої кишки (Kelly et al., 2015). У нашому дослідженні ми виявили, що рівні оцтової кислоти, пропанової кислоти та масляної кислоти були значно знижені, що супроводжувалося аномальною експресією білка HIF у щурів із ХХН, що вказувало на те, що стабільність HIF- могла бути пов’язана зі зниженням SCFA, і SCFA могли мати ефект стабілізації HIF для регулювання експресії EPO.

5. Висновки

На завершення ми довели, що JP покращує ХХН та асоційовану з нею анемію, механізм якої бере участь у регуляції вивільнення SCFA та продукції EPO. І JP може бути біоактивним інгредієнтом зизифуса для лікування анемії. Ці результати можуть свідчити про подальший розвиток JP як харчових добавок для лікування анемії, пов’язаної з ХХН.

Етичне твердження

Усі експерименти на тваринах у нашому дослідженні проводилися згідно з протоколами, схваленими Комітетом з етики Університету китайської медицини Гуанчжоу, і відповідно до рекомендацій Національного інституту охорони здоров’я щодо догляду та використання лабораторних тварин (публікації NIH № 80-23, переглянуто 1996 р.). У нашому дослідженні немає жодного порушення наведених вище вказівок.

Подяки

Ця робота виконана за підтримки Фонду природничих наук провінції Гуандун (2018A030313305), Фонду природничих наук Китаю (81804052, 81973577 та 82004248), Проекту науково-технологічного плану Шеньчженя (JSGG20191129102216637 та ZDSYS201606081515458), Провінції традиційної китайської медицини Гудонанг 20201320).

Список літератури

Аль-Харбі, NO, Надім, A., Ахмад, SF, Alotaibi, MR, AlAsmari, AF, Alanazi, WA, … Ібрагім, KE (2018). Коротколанцюгова жирна кислота, ацетат, полегшує гострий сепсисниркатравмашляхом інгібування передачі сигналу НАДФН-оксидази в Т-клітинах. Міжнародна імунофармакологія, 58, 24–31.
Babitt, JL, & Lin, HY (2012). Механізми анемії при ХХН. Журнал Американського товариства нефрології, 23 (10), 1631–1634.
Бернхардт, В.М., Візенер, М.С., Скігалла, П., Чоу, Дж., Шмідер, Р.Е., Гюнцлер, В., …Еккардт, KU (2010). Інгібування пролілгідроксилаз збільшує вироблення еритропоетину при ESRD. Журнал Американського товариства нефрології, 21(12),
2151–2156.
Боетс, Е., Дерувер, Л., Губен, Е., Вермеулен, К., Гоманд, С.В., Делкур, Я., … Вербеке, К. (2015). Кількісне визначення виробництва коротколанцюгових жирних кислот товстої кишки з інуліну in vivo. Поживні речовини, 7 (11), 8916–8929.

Цай, Ю., Лю, В., Лінь, Ю., Чжан, С., Цзоу, Б., Сяо, Д., … Се, З. (2019). Складні полісахариди полегшують експериментальний коліт шляхом модуляції складу та функції кишкової мікробіоти. Журнал гастроентерології та гепатології, 34(9),1554–1562.

Chen, G., & Zhang, Q. (2020). Одночасне кількісне визначення вільних жирних кислот і ацилкарнітинів у зразках плазми за допомогою мічення дансилгідразином і рідинної хроматографії – потрійної квадрупольної мас-спектрометрії. Аналітичний та біоаналітичнийХімія, 412 (12), 2841–2849.

Чен, Дж., Лам, К.Т., Конг, А.Й., Чжан, В.Л., Жан, Дж.Й., Бі, К.В., … Цім, К.В. (2014). Екстракт плодів Ziziphus jujuba (зизифуса) індукує експресію еритропоетину через фактор, що індукує гіпоксію-1 в культивованих клітинах Hep3B. ПлантаMedica, 80 (17), 1622–1627.

Чен, Дж., Ван, Ф., Хуан, С., Лю, X., Лі, З., Ці, А., … Лі, С. (2019). Відвар Jian-Pi-Yi-Shen полегшує ниркову анемію у 5/6 нефректомованих щурів: вироблення еритропоетину через сигналізацію фактора, індукованого гіпоксією. Доказова комплементарна та альтернативна медицина, 2019, 1–8.
Ченг, Ю., Май, К., Цзен, X., Ван, Х., Сяо, Ю., Тан, Л., … Дін, Х. (2019). Пропіонат полегшує судоми, спричинені пентилентетразолом, наступне руйнування мітохондрій, некроз нейронів і неврологічний дефіцит у мишей. Біохімічна фармакологія, 169, ст.113607.
Фен Ю.Л., Цао Г., Чен Д.К., Вазірі Н.Д., Чен Л., Чжан Дж. … Чжао Ю.Й. (2019). Мікробіом-метаболоміка розкриває мікробіоту кишечника, пов’язану з гліцинкон’югованими метаболітами та метаболізмом поліамінів при хронічній хворобі нирок. Cellular and Molecular Life Sciences, 76(24), 4961–4978.
Гаррідо, П., Рібейро, С., Фернандес, Дж., Вала, Х., Бронзе-да-Роша, Е., Роша-Перейра, П., … Рейс, Ф. (2015). Залізо-гепсидиновий дисметаболізм, анемія та ниркова гіпоксія, запалення та фіброз у моделі залишкової нирки щура. PLoS ONE, 10(4), стаття e124048.
Хіґаші, Т. та Огава, С. (2016). Ізотопно-кодовані реагенти для дериватізації, що підсилюють ESI, для диференціального аналізу, кількісного визначення та профілювання метаболітів у біологічних зразках за допомогою РХ/МС: огляд. Журнал фармацевтичного та біомедичного аналізу, 130, 181–193.
Цзі, X., Хоу, C., Гао, Y., Сюе, Y., Янь, Y., і Гуо, X. (2020). Метагеномний аналіз модуляторних ефектів полісахаридів зизифуса (Ziziphus jujuba Mill.) на мікробіоту кишечника в мишачій моделі колоректального раку. Їжа та функції, 11 (1), 163–173.
Цзі, X., Хоу, C., Янь, Y., Ши, M., і Лю, Y. (2020). Порівняння структурної характеристики та антиоксидантної активності полісахаридів з плодів зизифуса (Ziziphus jujuba Mill.). Міжнародний журнал біологічних макромолекул, 149, 1008–1018.

Цзі, X., Хоу, Ч., Чжан, X., Хань, Л., Інь, С., Пен, К., … Ван, М. (2019). Мікробіометаболомічний аналіз впливу Zizyphus jujuba cv. Споживання полісахаридів Muzao на фекальній мікробіоті та метаболітах мишей колоректального раку.Міжнародний журнал біологічних макромолекул, 131, 1067–1076.

Цзі, X., Пен, Q., Юань, Ю., Шен, Дж., Се, X., і Ван, М. (2017). Виділення, структури та біоактивність полісахаридів з плодів зизифуса (Ziziphus jujuba Mill.): Огляд. Харчова хімія, 227, 349–357.
Цзян, Н., Чжао, Х., Хан, Ю., Лі, Л., Сюн, С., Цзен, Л., … Сун, Л. (2020). HIF-1 зменшує пошкодження канальців при діабетичній нефропатії за допомогою HO-1-опосередкованого контролю мітохондріальної динаміки. Проліферація клітин, 53(11), стаття e12909.
Капіціну, П. П., Лю, К., Унгер, Т. Л., Ра, Дж., Давідофф, О., Кіт, Б., … Хаасе, В. Х. (2010). Печінковий HIF-2 регулює реакції еритропоезу на гіпоксію при нирковій анемії. Кров, 116(16), 3039–3048.
Келлі, К.Дж., Чжен, Л., Кемпбелл, Е.Л., Саїді, Б., Шольц, Ч.І., Бейлесс, А.Дж., … Колган, С.П. (2015). Взаємозв’язок між жирними кислотами з коротким ланцюгом мікробіоти та HIF кишкового епітелію посилює функцію тканинного бар’єру. Cell Host & Microbe, 17 (5), 662–671.
Ко, А., Де Ваддер, Ф., Ковачева-Датчарі, П., і Б¨ акхед, Ф. (2016). Від харчових волокон до фізіології організму: коротколанцюгові жирні кислоти як ключові метаболіти бактерій. Cell, 165 (6), 1332–1345.
Лакшманан, А.П., Аль, З.М., Алі, Б.Х., і Терранегра, А. (2021). Вплив пребіотика камеді акації на склад кишкового мікробіому у щурів з експериментальною хронічною хворобою нирок. Біомедицина та фармакотерапія, 133, ст
110992.
Лам К., Чан П. Х., Лі П., Лау К. М., Конг А., Гонг А. … Цім К. (2016). Хімічна та біологічна оцінка відварів трав, що містять зизифус (Ziziphus jujuba): індукція експресії еритропоетину в культурах. Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 1026, 254–262.
Lappin, TR, & Lee, FS (2019). Оновлення щодо мутацій у HIF: шляху EPO та їх ролі в еритроцитозі. Огляди крові, 37, стаття 100590.
Леблан Дж. Г., Чейн Ф., Мартін Р., Бермудес-Умаран Л. Г., Куро С. та Лангелла П. (2017). Сприятливий вплив на енергетичний метаболізм господаря коротколанцюгових жирних кислот і вітамінів, що виробляються комменсальними та пробіотичними бактеріями. Фабрики мікробних клітин, 16 (1), 79.
Лі Л., Ма Л. та Фу П. (2017). Жирні кислоти з коротким ланцюгом і захворювання нирок, отримані з кишкової мікробіоти. Розробка та терапія дизайну ліків, 11, 3531–3542.
Лі Л. та Ши Дж. Й. (2013). Аналіз полісахаридних і ліпідних компонентів кори кори кориці за допомогою ГХ-МС. Zhong Yao Cai, 36(4), 578–580.
Лю, Г., Лю, X., Чжан, Ю., Чжан, Ф., Вей, Т., Ян, М., … Чжао, З. (2015). Гепатопротекторні ефекти полісахаридів, витягнутих з Zizyphus jujube cv. Huanghetanzao. Міжнародний журнал біологічних макромолекул, 76, 169–175.

Локателлі, Ф., Фішбейн, С., Блок, Джорджія, і Макдугал, IC (2017). Націлювання на фактори, що викликають гіпоксію, для лікування анемії у пацієнтів із хронічною хворобою нирок. Американський журнал нефрології, 45 (3), 187–199.

Локателлі, Ф., Ханнедуш, Т., Фішбейн, С., Морган, З., Огуї, Д., та Вайт, В.Б. (2019). Серцево-судинна безпека та смертність від усіх причин метоксиполіетилену

Гліколь-епоетин бета та інші засоби, що стимулюють еритропоез, при анемії ХХН: рандомізоване дослідження не меншої ефективності. Клінічний журнал Американського товариства нефрології: CJASN, 14(12), 1701–1710.
Максвелл, П. (2003). HIF-1: система реагування на кисень, особливо важлива для нирок. Журнал Американського товариства нефрології, 14 (11), 2712–2722.
Meijers, BK, & Evenepoel, P. (2011). Вісь кишечник-нирки: індоксилсульфат, п-крезилсульфат і прогресування ХХН. Трансплантація нефрологічного діалізу, 26(3), 759–761.
Мікамі, Д., Кобаясі, М., Увада, Дж., Ядзава, Т., Каміяма, К., Нішіморі, К., … Івано, М. (2020). Коротколанцюгова жирна кислота пом’якшує хронічну хворобу нирок, спричинену аденіном, через шляхи FFA2 і FFA3. Biochimica Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology Lipids, 1865(6), стаття 158666.
Мортон, Д.Б., Гріффітс, П.Х. (1985). Рекомендації щодо розпізнавання болю, дистресу та дискомфорту в експериментальних тварин та гіпотеза для оцінки. Ветеринарний запис, 116(16), 431–436.
Панджета, М., Тагірович, І., Софіч, Е., Коріч, Дж., і Дервішевич, А. (2017). Інтерпретація рівня еритропоетину та гемоглобіну у пацієнтів із різними стадіями хронічної хвороби нирок. Журнал медичної біохімії, 36 (2), 145–152.
Паппа, М., Дунусі, Е., Дуні, А., і Катоподіс, К. (2015). Менш відомі патофізіологічні механізми анемії у хворих на діабетичну нефропатію. Міжнародна урологія та нефрологія, 47(8), 1365–1372.
Сакашіта, М., Танака, Т., і Нангаку, М. (2019). Гіпоксія-індукований фактор-інгібітори пролілгідроксилазного домену для лікування анемії при хронічній хворобі нирок. Внески до нефрології, 198, 112–123. https://doi.org/10.1159/000496531.
Шодель, Дж., Реткліфф, П. Дж. (2019). Механізми сигналізації гіпоксії: нові наслідки для нефрології. Nature Reviews Nephrology, 15 (10), 641–659.
Тако Е., Глан Р.П., Кнез М. та Стангуліс Дж.К. (2014). Вплив пшеничних пребіотиків на кишкову бактеріальну популяцію та статус заліза у курчат-бройлерів з дефіцитом заліза. Журнал харчування, 13, 58.
Тан, В. Х., Ван, З., Кеннеді, Ді-Джей, Ву, Ю., Буффа, Д. А., Агатіса-Бойл, Б., … Хейзен, С. Л. (2015). Залежний від кишкової мікробіоти триметиламін-N-оксид (ТМАО) шлях сприяє як розвитку ниркової недостатності, так і ризику смертності при хронічній хворобі нирок. Circulation Research, 116(3), 448–455.
Тхавараджа, С., Чой, М.Дж. (2019). Застосування засобів, що стимулюють еритропоез, у пацієнтів із ХХН та раком: клінічний підхід. Американський журнал захворювань нирок, 74(5), 667–674.
Ван, Ф., Ю, Х., Хуан, С., Чжен, Л., Чжен, П., Чжан, С., … Чен, Дж. (2020). Jian-PiYi-Shen регулює експресію EPO та білка, що переробляє залізо, у анемічних щурів із хронічною хворобою нирок: накопичення фактора, що індукує гіпоксію-2 за допомогою сигналізації ERK. Доказова комплементарна та альтернативна медицина, 2020, 8894257.
Wang, S., Lv, D., Jiang, S., Jiang, J., Liang, M., Hou, F., … Chen, Y. (2019). Кількісне зниження коротколанцюгових жирних кислот, особливо бутирату, сприяє прогресуванню хронічної хвороби нирок. Клінічна наука, 133 (17), 1857–1870.
Вебстер, AC, Наглер, Е.В., Мортон, Р.Л., і Массон, П. (2017). Хронічна хвороба нирок. Lancet (Лондон, Англія), 389 (10075), 1238–1252.
Се, X., Ян, X., Ву, Дж., Ма, Дж., Вей, В., Фей, X., … Ван, М. (2020). Trib1 сприяє відновленню після гострого ураження нирок, спричиненого ішемією/реперфузією, шляхом регулювання поляризації ниркових макрофагів. Frontiers in Immunology, 11, 473.
Сю, М., Наґаті, Дж.С., Се, Дж., Лі, Дж., Волтерс, Х., Мун, Я., … Гарсія, ДЖА (2014). Ацетатний перемикач регулює стресовий еритропоез. Природна медицина, 20 (9), 1018–1026.
Юе, Ю., Ву, С., Лі, З., Лі, Дж., Лі, X., Сян, Дж., … Дін, Х. (2015). Полісахариди дикого зизифуса захищають від експериментального запального захворювання кишечника, покращуючи функцію кишкового бар’єру. Їжа та функції, 6 (8), 2568–2577.

Чжао, С., Лі, Л. (2018). Маркування ізотопом дансилгідразину РХ-МС для комплексного профілювання субметаболому карбонової кислоти. Аналітична хімія, 90 (22), 13514–13522.

Чжен, Л., Чень, С., Ван, Ф., Хуан, С., Лю, X., Ян, X., … Чень, Дж. (2020). Чітка реакція кишкової мікробіоти на відвар Jian-Pi-Yi-Shen пов’язана з покращенням клінічних результатів у 5/6 щурів після нефректомії. Frontiers in Pharmacology, 11, 604.