Потенційні біомаркери сльози для діагностики хвороби Паркінсона — пілотне дослідження Ⅰ

Анотація: Хвороба Паркінсона (ХП) є другим за поширеністю нейродегенеративним захворюванням після хвороби Альцгеймера. У цьому дослідженні профіль протеома сльози у пацієнтів з ідіопатичним БП (ІПД, n=24), носіями мутації E46K-SNCA (n=3) і здоровим контролем (КТ, n {{4 }}) суб’єктів аналізували для виявлення кандидатів на біомаркери для діагностики хвороби Паркінсона. Було проведено обсерваційне, проспективне та пілотне дослідження типу «випадок-контроль», у якому досліджували зразки сліз учасників за допомогою нанорідинної хромато-мас-спектрометрії (nLC–MS/MS) та оцінювали їхні неврологічні порушення. Отримані протеомні дані доступні на ProteomeXchange з ідентифікатором 10.6019/PXD028811.

Натисніть, щоб отримати цистанку Amway від хвороби Паркінсона

Ці аналізи привели до ідентифікації 560 білків сльози, деякі з яких були дерегульовані у пацієнтів з хворобою ХП і які були причетні до імунних реакцій, запалення, апоптозу, деградації колагену, синтезу білка, захисту, транспорту ліпідів і зміненої функції лізосом. З цих білків шість були пов’язані з нейродегенеративними процесами та продемонстрували відмінну здатність класифікувати пацієнтів і контрольну групу. Ці знахідки показали, що певні білки були активовані в сльозах пацієнтів із ХП, головним чином білки, залучені до функції лізосом. Таким чином, у цьому дослідженні білки сльози були ідентифіковані як причетні до нейродегенерації, яка може бути пов’язана з фенотипом агресивного захворювання у пацієнтів з ХП.

Ключові слова: біомаркери; Хвороба Паркінсона; слізна плівка; лізосома

1. Введення

Хвороба Паркінсона (ХП) є другим за поширеністю нейродегенеративним захворюванням після хвороби Альцгеймера (БА), і воно характеризується сповільненістю рухів (брадикінезією), підвищеним м’язовим тонусом (ригідністю), тремтінням (тремором) і порушенням контролю постави. При патологічно підтвердженому БП спостерігається змінна кількість і відкладення неправильно згорнутого альфа-синуклеїну (-syn) у формі тілець Леві (LB) і нейритів Леві в центральній нервовій системі (ЦНС). Ця варіабельність у накопиченні цих структур, ймовірно, відображає клінічну гетерогенність цього захворювання [1–3]. Дійсно, кілька клінічних розладів знаходяться в спектрі хвороб тілець Леві (LBD), включаючи пацієнтів з ідіопатичним (IPD) і генетичним PD і пацієнтів, які страждають на деменцію з LB. Однією з головних проблем у боротьбі з нейродегенеративними захворюваннями є пошук клінічних маркерів, які дозволяють ранню класифікацію пацієнтів і допомагають контролювати прогресування захворювання.

Такі фактори, як окислювальний стрес, протеоліз і змінені концентрації жирних кислот або фосфоліпідів, були пов’язані зі структурними змінами -syn, а посттрансляційні модифікації також можуть змінити розмір, структуру або білкове навантаження -syn [4]. Дерегулюючі мутації та розмноження в гені -syn (SNCA) викликають аутосомно-домінантні сімейні форми БП [5]. Можливо, найпатогеннішою мутацією, яка індукує PD, є мутація E46K у -syn (E46K-SNCA), яка лежить в основі групи агресивних генетичних LBD з клінічними та патологічними ознаками, що нагадують деменцію з LB [6,7]. Хоча мутації в -syn є рідкісними, вони дають унікальну можливість ідентифікувати пацієнтів із хворобою хвороби серця та краще зрозуміти прогресування цих патологій.

Відомо, що у хворих на ХП розвиваються галюцинації, зміни в рухах очей і повік, а також змінюється склад сльози в меншій кількості [8,9]. Крім пошкодження поверхні ока, у цих пацієнтів можуть спостерігатися зміни акомодації, зниження гостроти зору, утворення скотоми (ділянки, де поле зору частково зменшується або повністю дегенерує), а також витончення шарів сітківки, зокрема через зменшення в кількості нервових волокон [10,11]. Дефіцити нейротрансмісії та метаболізму моноамінів також впливають на патологічні зміни зорової системи пацієнтів з ХП [12].

Ці зміни досить характерні, оскільки моноаміни беруть участь у передачі зорової інформації в сітківці [13]. Крім того, у пацієнтів з ХП можуть спостерігатися зміни в іннервації передньої частини ока, що в кінцевому підсумку може змінити склад сліз. Багато нейромедіаторів і трофічних речовин секретуються в сльозах, що походять із водянистої вологи або нервів, що проходять через рогівку [14].

Однак клітинні та молекулярні механізми, які лежать в основі цих асоціацій, ще не повністю з’ясовані. Оскільки БП впливає на кілька немоторних систем і периферичних нервів, у цих пацієнтів може бути змінена слізна секреція, а білковий склад слізної системи може мати характерний профіль у цих пацієнтів, який може служити діагностичним біомаркером. У цьому сенсі аналіз слізних білків пацієнтів з E46K-SNCA та iPD може допомогти визначити корисні біомаркери-кандидати для діагностики та прогресування PD.

Таким чином, дане дослідження мало на меті проаналізувати профіль протеома сльози у пацієнтів з ІПД та носіїв мутації E46K-SNCA, щоб знайти біомаркер, який міг би допомогти в майбутній діагностиці ПД, використовуючи неінвазивні зразки.

2. Матеріали та методи

2.1. Вивчення когорти

Ми розробили обсерваційне проспективне пілотне дослідження типу «випадок-контроль», до якого залучили 24 пацієнти з ІПД, 3 носіїв мутації E46K-SNCA і 27 здорових суб’єктів (СТ). Це дослідження було проведено кваліфікованим медичним персоналом після отримання схвалення від Комітету з етики OSI Ezkerralde-Enkaterri-Cruces CEIC E18/47. Дослідження проводилося в суворій відповідності до положень Гельсінської декларації про біомедичні дослідження за участю людей. Перед збором зразків від усіх суб’єктів було отримано підписану інформовану згоду після пояснення характеру та можливих наслідків дослідження. Пацієнти були набрані у відділення неврології та офтальмології університетської лікарні Крусес (Баракалдо, Біскайя, Іспанія) під час амбулаторних консультацій на основі узгоджених критеріїв включення та виключення. Пацієнти з ІПД відповідали критеріям Банку мозку Паркінсона Великобританії для діагностики БП і не мали жодних відомих мутацій.

Критеріями включення до КТ були особи віком понад 40 років, будь-якої статі та без клінічної історії будь-яких неврологічних розладів. До дослідження були включені особи з будь-яким системним або очним розладом/станом (або в анамнезі). Критеріями виключення були операції на очах протягом останніх трьох місяців, хронічний прийом ліків для очей (наприклад, від глаукоми), алергія в анамнезі, використання будь-яких місцевих ліків (окрім штучних сліз) або пероральних препаратів, що містять кортикостероїди, атопія та пацієнти з синдромом Шегрена синдром.

Користувачі контактних лінз також були виключені, щоб уникнути будь-яких можливих перешкод для інтерпретації результатів. Попередні очні тести та збір зразків були проведені в той самий день, а пацієнтів із хворобою Паркінсона також оглянули в інший день члени дослідницької групи, які є експертами з рухових розладів, щоб оцінити шкалу Паркінсона.

2.2. Офтальмологічне обстеження

Клінічне офтальмологічне обстеження включало тест Ширмера I (SCH), який визначає, чи виробляє око достатньо сліз, щоб підтримувати його вологим. Тест дозволяє воді в сльозах проходити по довжині паперової тестової смужки, і нормальні значення більше або дорівнюють 10 мм змочування паперу через 5 хвилин. Нестабільність слізної плівки оцінювали за допомогою часу розриву сльози (TBUT) з флуоресцеїном. TBUT — час, необхідний для появи першої сухої плями на рогівці після повного моргання. Значення менше 10 с зазвичай відображає певну нестабільність слізної плівки. Критерієм виключення вважалося будь-яке системне захворювання або будь-який інший стан/застосування ліків, які могли б вплинути на інтерпретацію результатів.

2.3. Неврологічний огляд

Експерт-невролог у галузі рухових розладів фіксував вік пацієнтів із ХП під час збору сліз, тривалість їхнього захворювання та їхні бали за Уніфікованою шкалою оцінки хвороби Паркінсона (UPDRS) і шкалою Хоена Яра. Ці тести служать критеріями стратифікації для відстеження прогресування захворювання. Конфіденційність даних пацієнтів була забезпечена використанням Basque Biobank.

2.4. Збір зразків сльози

Усі зразки сльози збирали за допомогою каліброваних скляних мікрокапілярних пробірок на 10 мкл (BLAUBRAND intraMark, Вертхайм, Німеччина). Зразки сльози отримували з нижнього скроневого слізного меніска, зводячи до мінімуму подразнення поверхні ока або краю повік і без встановлення анестезії. Зразки сліз були зібрані з обох очей кожного учасника та негайно поміщені в попередньо охолоджені пробірки Еппендорфа. Після збору сльози зразки зберігали при -80 ◦C до їх аналізу.

2.5. Протеомні аналізи

Протеомні аналізи проводилися в CIC bioGUNE Proteomics Service (Деріо, Біскайя, Іспанія) з використанням протоколу Filter Aided Sample Preparation (FASP) [15] для обробки та розщеплення зразків. Додавали трипсин (Sigma Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) у співвідношенні трипсин: білок 1:50, і суміш інкубували протягом ночі при 37 ◦C, сушили в RVC{{4} } Концентратор Speedvac (Кріст, Відень, Австрія). Отримані пептиди знесолювали та ресуспендували в 0,1% мурашиної кислоти (FA) (Sigma Aldrich, Сент-Луїс, Миссурі, США) з використанням наконечників C18 (Millipore, Сент-Луїс, Миссурі, США).

Зразки аналізували в новому гібридному квадрупольному часпролітному мас-спектрометрі спектрометрії рухливості захоплених іонів (timsTOF Pro з PASEF, Bruker Daltonics, Бремен, Німеччина), підключеному онлайн до рідинного хроматографа nanoElute (Bruker, Ковентрі, Великобританія). Цей мас-спектрометр використовує переваги нового режиму сканування, який називається послідовною фрагментацією з паралельним накопиченням (PASEF), який збільшує швидкість секвенування без будь-яких втрат у чутливості, і було доведено, що він забезпечує видатну аналітичну швидкість і чутливість для аналізу протеоміки [16].

Зразки (200 нг) безпосередньо завантажували в аналітичну колонку Bruker nano elute FIFTEEN C18 розміром 15 см (Bruker, Ковентрі, Великобританія) і розділяли при 400 нл/хв. Колонку нагрівали до 50 ◦C у печі. Ідентифікацію та кількісну оцінку білків проводили за допомогою програмного забезпечення PEAKS (Bioinformatics Solutions Inc., Ватерлоо, Каліфорнія, США). Пошуки проводились у базі даних канонічних записів Uniprot/Swissprot людини (без урахування ізоформ), з допуском на попередник і фрагменти 20 ppm і 0,05 Да.

Кількісне визначення білка без міток на основі площі проводили за допомогою модуля PEAKS Q, доступного в програмному забезпеченні PEAKS. Для подальшого аналізу розглядалися лише білки, ідентифіковані принаймні двома пептидами з частотою помилкових відкриттів (FDR) < 1 відсотка та присутні принаймні в 70 відсотках зразків однієї з досліджуваних груп. Дані були завантажені на платформу Perseus [17] і далі оброблені (перетворення log2, імпутація) перед застосуванням t-критерію Стьюдента для диференціального аналізу експресії білка. Дані протеоміки підсумовані у файлі додаткових матеріалів S1, а дані протеоміки мас-спектрометрії були передані на зберігання до консорціуму ProteomeXchange через репозиторій партнера PRIDE [18] з ідентифікаторами набору даних PXD028811 та 10.6019/PXD028811.

2.6. Статистичний аналіз

Статистичний аналіз проводили за допомогою пакета IBM SPSS Statistics для Windows, 23.0v (IBM-SPSS, Армонк, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США). Нормальність безперервних даних оцінювали за допомогою тесту Шапіро–Вілка. Розраховані p-значення визначають ймовірність того, що зв’язок між білками в наборі даних і даним канонічним шляхом, функціональною мережею або вищестоящим регулятором пояснюється лише випадковістю, на основі точного критерію Фішера з p-значенням < {{5 }}.05 вважається важливим.

Для визначення статистично значущих характеристик, пов’язаних із дискримінацією пацієнтів із ХП, використовували однофакторні логістичні регресії. Після відбору змінних використовували багатофакторну логістичну регресію для побудови дискримінаційної моделі PD та ідентифікації клінічних і протеомних змінних, що стосуються ідентифікації PD. Логістичні моделі дозволяють оцінити зв’язок між дискретною залежною змінною та набором безперервних або дискретних незалежних змінних. Моделі дозволяють класифікувати пацієнтів з ПД або без нього, розраховуючи ймовірність приналежності до кожної групи. P-значення кожної коваріати описує статистичну значущість зв’язку між відповіддю та кожним терміном, включеним у модель.

для отримання додаткової інформації: Ali.ma@wecistanche.com