Фоточутливі наноагрегати проліків, що містять хіміотерапевтичну функцію спокою, посилюють імунотерапію раку

Анотація

Імунотерапія в поєднанні з ефективними терапевтичними засобами, такими як хіміотерапія та фотодинамічна терапія, є успішною стратегією активації протипухлинної імунної відповіді для покращення протипухлинного лікування. Однак розробка багатофункціональних біорозкладаних, біосумісних, малотоксичних, але високоефективних і клінічно доступних трансформованих наноімуностимуляторів залишається проблемою і користується великим попитом. Тут ми повідомляємо та розробляємо новий фотохіміотерапевтичний нанопрепарат без носіїв COS-BA/Ce6 NPs шляхом поєднання трьох багатофункціональних компонентів: самоорганізованої природної маломолекулярної бетулінової кислоти (BA), водорозчинного олігосахариду хітозану (COS), і низькотоксичний фотосенсибілізатор хлорин e6 (Ce6) для посилення протипухлинної ефективності імунотерапії раку, опосередкованої анти-PD-L1-. Ми показуємо, що розроблені нанопрепарати мали розумну та відмітну характеристику «сплячки» в хіміотерапевтичному ефекті з бажаною нижчою цитотоксичністю та численні сприятливі терапевтичні характеристики, включаючи покращене генерування 1 O2, викликане зменшенням енергетичного розриву Ce6, чутливість до рН, хорошу здатність до біологічного розкладання та біосумісність, що забезпечує високоефективну синергетичну фотохіміотерапію. Крім того, у поєднанні з анти-PD-L1 терапією хіміотерапія на основі нанокомпонентів і хіміотерапія/фотодинамічна терапія (PDT) можуть ефективно активувати протипухлинний імунітет при лікуванні первинних або віддалених пухлин, відкриваючи потенційно привабливі можливості для клінічної імунотерапії.

Переваги cistanche tubulosa - Протипухлинний

КЛЮЧОВІ СЛОВА

Імунотерапія раку; наноімуностимулятори; Хіміотерапевтичний спокій; Проліки; Самостійна збірка; Природна мала молекула; бетулінової кислоти; Фотодинамічна терапія

1. Введення

Імунотерапія раку, така як стратегія блокування імунної контрольної точки з використанням PD-L1 або CTLA-4 для боротьби з раком шляхом активації імунної системи хазяїна, безсумнівно, революціонізувала лікування раку1,2. На жаль, слабка імунна відповідь і неефективність терапевтичних ефектів значно обмежують його клінічні перспективи3,4. Нещодавні дослідження показали, що поєднання імунотерапії з іншими методами, такими як хіміотерапія5, фотодинамічна терапія (ФДТ)6, фототермічна терапія (ФТТ)7 та променева терапія8, може ефективно викликати протипухлинну імуногенність, спонукаючи ракові клітини зазнавати імуногенної клітинної загибелі ( МКБ)9, що свідчить про потенціал імунної модуляції для активації протипухлинної імунної відповіді. Численні інноваційні конструкції наноматеріалів, засновані на цих синергетичних комбінаціях стратегій імунотерапії, досягли значно покращеної протиракової активності, включаючи неорганічні10, полімерні11 та біоміметичні12 наночастинки (НП). Однак розробка багатофункціональних біорозкладаних, біосумісних, низькотоксичних, але високоефективних і клінічно доступних трансформованих наноімуностимуляторів залишається великою проблемою та величезним попитом. Природні біологічні матеріали, такі як нуклеїнові кислоти 13, білки 12, пептиди 14, 15 і низькомолекулярні природні продукти 16, 17 завдяки їхнім притаманним перевагам (наприклад, біосумісність, нетоксичність) викликають значний дослідницький інтерес для медичних застосувань. Особливо в останні роки послідовно були виявлені протипухлинні біоактивні природні малі молекули терпеноїдів (NSM), які володіють функцією самозбірки18,19. Наприклад, бетулінова кислота (BA), ергостерин (ET) і абієтинова кислота (AA) можуть самозбиратися в мікронні або наноструктуровані частинки. Ці NSM є привабливими будівельними блоками для розробки протипухлинних засобів для синергічної хіміотерапії та ФДТ. Було доведено, що вони демонструють значні переваги легкого нано-виробництва, кращої біосумісності та здатності до біодеградації, меншої токсичності зі зниженим пошкодженням печінки та високого синергізму в протипухлинній терапії20e23. Це забезпечує багатообіцяючі альтернативи для розробки клінічно доступних нано-імуностимуляторів для синергічної імунотерапії. Однак загалом сильніша ліпофільність цих NSM призвела до неефективного клітинного ендоцитозу, що послабило їх протипухлинну активність і обмежило їх клінічну цінність для лікування раку24. Подібно до нанокомпозитів, про які зазвичай повідомляють, відповідні нанокомпозиції NSMs сприяли клітинному поглинанню для посилення хіміотерапевтичних ефектів, але також ненавмисно збільшували ризик неспецифічної цитотоксичності для нормальних клітин22. Таким чином, як максимізувати протипухлинну ефективність терпеноїдних наноагентів NSM, мінімізуючи їх токсичність для нормальної тканини, варто глибоко задуматися як над ключовим питанням у процесі синергічної імунотерапії.

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

Стратегії проліків широко застосовувалися для покращення поглинання клітинами ліпофільних малих молекул шляхом підвищення гідрофільності25. Як правило, амфіфільні препарати особливо мають вищу ефективність поглинання клітинами, ніж гідрофільні або ліпофільні препарати26. Чим вищий клітинний фагоцитоз, тим краща терапевтична ефективність24. Таким чином, розробка молекул проліків амфіфільних терпеноїдів NSM може бути потенційним методом максимізації їх терапевтичних ефектів. Крім того, нанопрепарати, що реагують на стимули до специфічного мікрооточення пухлини (наприклад, реакція на кислоту, окисно-відновну реакцію) мають великі перспективи для контролю вивільнення ліків, що є перевагою для придушення цитотоксичності хіміотерапевтичних препаратів 27, 28. Тим часом супрамолекулярна збірка (наприклад, підхід повторного осадження) була ефективною стратегією для отримання високорозчинних у воді нанопрепаратів без носія 22, 29, які, як можна було очікувати, певною мірою зменшать ефективність фагоцитозу амфіфільних NSM, тим самим послаблюючи їх пре-препарати. розроблена цитотоксичність. Ми припускаємо, що чутливі до стимулів і повністю гідрофільні нанопрепарати були створені на основі проліків амфіфільних NSM і можуть ефективно пригнічувати його неспецифічну цитотоксичність для нормальних клітин, одночасно стимулюючи вивільнення високотоксичних амфіфільних NSM в пухлинні клітини, сприяючи їхньому спокою в нормальних тканинах і активація в місці пухлини. Важливо вибрати відповідний водорозчинний і реагуючий на стимули попередник для модифікації терпеноїдних NSM для отримання амфіфільних молекул проліків. Протягом багатьох років олігосахариди хітозану (COS), як продукти деградації хітозану, не тільки мають хорошу розчинність у воді та велику кількість груп eOH oreNH2, що призводить до хорошої реакції рН, але також мають корисну протипухлинну дію, посилюючи імунну функцію господаря шляхом регулювання активності імунних клітин, таких як моноцитарні макрофаги та лімфоцити30,31. Це гарантує величезну можливість конструювання цільових нано імуностимуляторів, що реагують на стимули, для синергетичної імунотерапії.

Тут, виходячи з наведених вище міркувань, у нашому експериментальному дизайні пентациклічні тритерпенові NSMs бетулінової кислоти (BA) використовуються як потужний протипухлинний агент32, COS був введений для синтезу амфіфільної молекули COS-BA для покращення хіміотерапевтичного ефекту. Хлорин e6 (Ce6), широко використовуваний фотосенсибілізатор з дуже низькою токсичністю/без темної токсичності33, був використаний для створення повністю водорозчинних без носіїв фоточутливих проліків COS-BA/Ce6 NP з використанням стратегії прямого спільного збирання. НЧ COS-BA/Ce6 поєднують два терапевтичних способи, хіміотерапію та фотодинамічну терапію (ФДТ), які можуть ефективно підвищити представлення пухлинних антигенів Т-клітинам, генеруючи надійні імунологічні відповіді за допомогою імунного ад’юванта анти-PD-L1 викликати високоефективну та синергетичну протипухлинну хіміотерапію/ФДТ/імунотерапію (схема 1). Сконструйовані наночастинки COS-BA/Ce6 показали розумну функцію спокою з підступними хіміотерапевтичними ефектами, тобто неопромінені спільно зібрані наночастинки продемонстрували значно пригнічену in vitro цитотоксичність порівняно з амфіфільною COS-BA проти ракових або нормальних клітин. Завдяки характерній поведінці, що реагує на рН, він демонструє низьку токсичність і біобезпеку для нормальної тканини in vivo, але є високотоксичним для тканини пухлини через стимулююче вивільнення гіперактивного COS-BA в слабокислому мікросередовищі пухлини34. Наскільки нам відомо, на даний момент все ще рідко повідомляють про розроблені нанопрепарати, які мають цю хіміотерапевтичну функцію спокою. Між тим, нанопрепарат має численні сприятливі терапевтичні властивості, такі як покращене генерування 1 O2 шляхом зменшення енергетичного розриву (DEST) Ce6, швидкий біологічний метаболізм і посилене накопичення пухлини, що призвело до ефективної та безпечної протипухлинної комбінації хіміотерапії та лікування ФДТ. Більш важливо те, що як хіміотерапія на основі NP, так і системи хіміотерапії/ФДТ можуть ефективно активувати протипухлинний імунітет шляхом сприяння проліферації TNF-a та IFN-g-продукуючих CD8þ Т-клітин у первинних або віддалених пухлинах. Запропонований нами біорозкладний, біосумісний, унікально сплячий, біологічно безпечний і високоефективний фотохіміотерапевтичний нанопрепарат досягає значних системних імунних терапевтичних відповідей, відкриваючи привабливі можливості для клінічного застосування в лікуванні віддаленого або метастатичного раку.

Схема 1 ФДТ і хіміотерапія спільно зібраних НЧ COS-BA/Ce6 посилювали анти-PD-L1 для індукування системної протипухлинної імунотерапії. Введення водорозчинного COS може ефективно посилити хіміотерапевтичну активність БА (зображеного у вигляді півмеча), що призводить до гіперактивного амфіфільного проліку COS-BA (довгий меч). У спільній збірці з фотосенсибілізатором Ce6 (піхви) структуровані оболонкою та чутливі до рН нанокомпоненти мали розумну та характерну функцію «сплячки» з пригніченою хіміотерапевтичною токсичністю для нормальних тканин. Але як тільки він прибув і був стимульований кислим (Hþ) мікрооточенням пухлини, високоактивний амфіфільний проліки COS-BA буде вивільнений, що призведе до значної хіміотерапії. Крім того, сконструйовані спільні збірки продемонстрували чудову активність PDT із посиленим утворенням синглетного кисню ( 1 O2), викликаним зменшеним енергетичним розривом між синглетним і триплетним збудженими станами (DEST) Ce6. У поєднанні з блокуванням контрольних точок проти PD-L1 вивільнення пухлинно-асоційованих антигенів після хіміотерапії/лікування ФДТ може ефективно активувати системну протипухлинну імунну відповідь для імунотерапії віддаленого раку.

2. Матеріали та методи

2.1. Синтез COS-BA

Бетулінова кислота (40 мг, 0.1 ммоль), EDC (38 мг, 0.2 ммоль) і NHS (17 мг, 0.15 ммоль ) розчиняли в 3 мл N,N-диметилформаміду (DMF). Після перемішування при кімнатній температурі протягом 30 хвилин 96 мг водного розчину COS (1 мл) обережно по краплях додавали в суміш і перемішували протягом 24 годин. Потім реакційну суміш розбавляли CH2Cl2 і повторно екстрагували. CH2Cl2 шар випарюють і очищають на колонці з силікагелем. БА, що не прореагував, спочатку видаляли, використовуючи петролейний ефір: ацетон (5:1, об’єм/об’єм) як елюент, а потім змінювали на 3:1, щоб отримати білий COS-BA (вихід: 42%), де COS ідентифікували як димер ( n Z 2). 1 H ЯМР (40{{70}} МГц, CDCl3) d: 8,98 (1H, с, BA-28 O] CeNH), 4,73 (1H, с, H -29a), 4,60 (1H, с, H-29b), 3,18 (1H, дд, JZ 4,8, 10,8 Гц, H-3), 2,95e3,93 (8H, m, COS), 2,64 (3H, с, CH3eCOS), 0,76 (3H, с, H-24), 0,83 (3H, с, H-25), 0,90 (3H, с, H{ {69}}), 0,97 (3Н, с, Н-26), 0,98 (3Н, с, Н-27), 1,70 (3Н, с, Н-30). 13C ЯМР (100 МГц, CDCl3) d: 179,18 (CO, COS), 156,43 (C- 28), 150,97 (C-20), 109,03 (C-29), 78,74, 77,04 , 69.32, 69.22, 65.25, 58.14, 55.62, 55.21, 53.65, 53.22, 50.52, 45.96, 44.32,44.11, 41.85, 40.59, 38.68, 38.55, 37.32, 37. 04, 36.39, 35.31, 34.21, 31.81, 31.54, 31.17, 30.28 , 29.09, 27.80, 27.22, 25.74, 25.53, 20.91, 19.48, 18.12, 16.02, 15.87, 15.17, 14.65, 14.62. ESIeMS m/z: 814,5871 [M‒6H] (C44H72N2O12).

2.2. Приготування НЧ COS-BA/Ce6

Спільно зібрані наночастинки COS-BA/Ce6 були підготовлені методом одноетапного повторного осадження. Як правило, спочатку змішували 5 мл Ce6 (33 ммоль/л) і 40 мл COS-BA (33 ммоль/л) розчинів ДМСО. Згодом суміш швидко вводили в 1 мл води, що містить 10 мл NaOH (50 ммоль/л) під ультразвуковою обробкою (KQ-250E, ShuMei, Куньшань, Китай). Після обробки ультразвуком протягом 10 хвилин НЧ COS-BA/Ce6 отримували центрифугуванням при 13,000 об/хв (TGL-16G, Xiangyi, Чанша, Китай) протягом 25 хвилин. Інші склади з різними співвідношеннями COS-BA до Ce6 готували за тією ж процедурою з постійним молярним співвідношенням NaOH до Ce6 3:1.

2.3. Клітинні лінії

Клітинні лінії людини MCF-7, HepG2, LO2 і мишачі 4T1, L929 надаються Інститутом біохімії та клітинної біології SIBS, CAS (Китай). MCF-7, HepG2 і LO2 культивували в середовищі DMEM з 10% фетальної бичачої сироватки (FBS, Gibco) і 1% пеніцилін-стрептоміцинового антибіотика (Life Technology, США) при 37 C. 4T1 і L929 культивували в RMPI-1640 середовище з тим же співвідношенням, що й вище.

2.4. Дослідження клітинного поглинання та ендоцитних шляхів

Для дослідження поглинання клітинами клітини 4T1 або LO2 інкубували з вільними НЧ Ce6 або COS-BA/Ce6 (еквівалентна концентрація Ce6: 1,7 мг/мл, COS-BA: 19,5 мг/мл, BA: 10 .8 мг/мл) протягом різного часу. Після промивання, фіксації та фарбування DIPA (#D9542, Sigma) клітини знімали під флуоресцентним інвертованим мікроскопом (FIM) (DSY-2000X, UP Optotech, Чанчунь, Китай). Інтенсивність флуоресценції визначали методом проточної цитометрії за допомогою системи Guava EasyCyte mini (Merck Millipore, Німеччина). Для кількісного визначення ефективності поглинання клітинне накопичення BA та COS-BA вимірювали за допомогою ВЕРХ (Agilent 1200, США). Як правило, клітини 4T1 обробляли вільним COS-BA або BA (еквівалент BA: 25 мг/мл) протягом 0,5 та 3 годин. Після промивання PBS клітинні гранули збирали та піддавали ультразвуковій гомогенізації (JY92-IIN, Scientz Biotechnology, Нінбо, Китай) для лізису клітин. Потім COS-BA або BA екстрагували хлороформом для аналізу ВЕРХ після ліофілізації зразків. Рухомою фазою була вода (0,2% фосфорна кислота) та ацетонітрил зі швидкістю потоку 1,0 мл/хв, а відповідні об’ємні співвідношення становили 60:40 та 15:85 (об’єм/об’єм) для аналізу COS-BA та BA відповідно. . Довжина хвилі детектування становила 213 нм. Для дослідження ендоцитних шляхів НЧ COS-BA/Ce6 клітини 4T1 висівали в 6-планшети з лунками та інкубували протягом 24 годин перед попередньою обробкою різними інгібіторами ендоцитозу протягом 30 хвилин, включаючи інгібітор мікропіноцитозу [50 ммоль/л , етилізопропіламілорид (EIPA) (#N132356, Aladdin)], інгібітор ендоцитозу, опосередкованого клатрином [20 ммоль/л, хлорпромазин (#C7010, Solarbio)], інгібітор ендоцитозу, опосередкованого кавеолами [25 ммоль/л, ністатин ( #IN0260, Solarbio)] та інгібітор підкислення лізосом [50 ммоль/л, хлорохіну фосфат (#C9720, Solarbio)]35. Далі клітини додатково культивували з 2 мл НЧ COS-BA/Ce6 (Ce6: 1,7 мг/мл, COS-BA: 19,5 мг/мл) протягом 2 годин і знімали під FIM (UP Optotech). Клітини, інкубовані без інгібітора ендоцитів при 37 °C, були встановлені як контрольні та при низькій температурі інкубації (4 °C) для оцінки енергозалежного ендоцитозу. Між тим, середню інтенсивність флуоресценції клітин також визначали за допомогою проточної цитометрії.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Натисніть тут, щоб переглянути продукти Cistanche Enhance Imunity

【Запитуйте більше】 Електронна пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Тест на цитотоксичність

Клітини 4T1 висівали в 96-лунковий планшет. Потім клітини обробляли різними концентраціями НЧ COS-BA протягом 24 годин. Після цього в лунку додали 10 мл барвника MTT (#M158055, Aladdin) (5 мг/мл) та інкубували ще 4 години, а потім додали 150 мл ДМСО для розчинення кристалів формазану. . Оптичну густину кожної лунки при 492 нм реєстрували рідером для мікропланшетів. Для групи опромінення клітини обробляли препаратами протягом 4 годин, потім опромінювали протягом 10 хвилин світлом 675  10 нм та інкубували ще 20 годин. Цитотоксичність НЧ COS-BA/Ce6 (1 мг/мл Ce6 відповідає 11,5 мг/мл COS-BA та 6,4 мг/мл BA) щодо інших клітин (MCF-7, HepG2, LO2 та L929) також визначали за допомогою того самого аналізу MTT, тільки з іншим середовищем. Між тим, індекс комбінації був розрахований програмним забезпеченням CompuSyn 2.0 з використанням розрахунку теореми Chou Talalay36.

2.6. Моделі тварин

Усі експериментальні процедури були виконані відповідно до протоколів, затверджених Комітетом з догляду та використання тварин Харбінського медичного університету. Клітини 4T1 суспендували в середовищі RMPI-1640 і вводили підшкірно в праву спину кожної самки миші BALB/c (18-22 г, вік 6-7 тижнів).

2.7. Флуоресцентне зображення in/ex vivo

200 мл 5% розчину глюкози COS-BA/Ce6 NPs (еквівалент Ce6: 0,35 мг/мл, COS-BA: 4,02 мг/мл) вводили через хвостову вену мишам із пухлиною. Після цього проводили флуоресцентну візуалізацію ділянок пухлини в заздалегідь визначений час за допомогою багатомодельної системи візуалізації тварин AniView 100/600 in vivo (Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., Китай) зі збудженням при 630 нм. Через 24 години після ін’єкції основні органи (серце, печінку, селезінку, легені та нирки) і пухлину збирали для флуоресцентної візуалізації ex vivo. Крім того, також оцінювали флуоресцентні зображення ex vivo пухлин і основних органів у різний час після внутрішньовенних ін’єкцій Ce6 або COS-BA/Ce6 NP.

2.8. Хіміотерапія in vivo/ФДТ

4T1-миші (75e100 мм3) випадковим чином розділені на шість груп (n Z 5): 1) 5% розчин глюкози; 2) Ce6; 3) Се6 з опроміненням; 4) COS-BA (40,2 мг/кг, де БК: 22,3 мг/кг); 5) НЧ COS-BA/Ce6; 6) НЧ COS-BA/Ce6 з опроміненням. Для кожної групи мишам вводять 200 мл НЧ COS-BA/Ce6 (еквівалент Ce6: 3,5 мг/кг тіла) через хвостову вену в дні 0, 2 і 4. Для груп опромінення через 4 години після ін’єкції після кожного введення всіх мишей анестезували ізофлураном, а ділянки пухлини опромінювали світлом 675  10 нм (150 мВт/см2) протягом 15 хв. Обсяги пухлини та масу тіла мишей також записують через день. Обсяги пухлини розраховують за формулою: ВЗ ширина2 довжина/2. Після 14 днів лікування пухлини вирізали та зважували для розрахунку коефіцієнта інгібування пухлини (TIR) ​​за загальновживаним рівнянням: TIRZ (1 зразок/контроль) 100%. Де зразок і контроль являли собою середню вагу пухлини кожної групи, що отримувала лікування, і групи, що отримувала 5% водний розчин глюкози, відповідно.

2.9. Хіміотерапія in vivo/ФДТ/імунотерапія

Щоб продемонструвати потенціал НЧ COS-BA/Ce6 у поєднанні з імунотерапією, була розроблена двостороння модель пухлини шляхом підшкірної ін’єкції клітин 4T1 у лівий і правий боки. Коли пухлини наближалися до 75e100 мм3, мишей розділили на п’ять груп. (1) контроль; (2) COS-BA/ Ce6 NP (COS-BA Z 40,2 мг/кг, де BA Z 22,3 мг/кг); (3) НЧ COS-BA/Ce6 þ світло; (4) НЧ COS-BA/Ce6 þ анти-PDL1; (5) НЧ COS-BA/Ce6 þ анти-PD-L1 þ світло. У день 0 мишам внутрішньовенно вводили 200 мл 5% розчину глюкози (група 1) або НЧ COS-BA/Ce6 (Ce6 Z 3,5 мг/кг) (групи 2, 3, 4, 5). Через 4 години після ін'єкції праві пухлини груп 3 і 4 опромінювали протягом 15 хвилин. Мишей анестезували ізофлураном і перевертали на один бік, щоб уникнути оголення лівих пухлин. Потім антитіло проти PD-L1 (BioXcell, номер продукту: BE0101, номер клону: 10F.9G2) внутрішньовенно вводили мишам груп 4 і 5 на дні 2, 4 і 6 (15 мг на мишу на ін’єкцію). Довжину і ширину кожної пухлини контролювали через день. Після 14 днів лікування сироватку крові мишей збирали для оцінки гамма-інтерферону (IFN-g) (#KMC4021) і фактора некрозу пухлини (TNF-a) (#BMS607-3) за допомогою аналізу ELISA (eBioscience ). Пухлини збирали, дисоціювали, обробляли буфером для лізису еритроцитів і промивали PBS шляхом центрифугування. Потім суспензію клітин пофарбували анти-CD3-FITC (#MA1-10187, клон 145-2C11, eBioscience) і анти-CD8a-PE (#12-0081-85, клон 53-6.7, eBioscience). Після цього за допомогою проточної цитометрії оцінювали інфільтрацію цитотоксичних Т-лімфоцитів (CTL) у правій і лівій пухлинах після різних видів лікування.

3. Результати та їх обговорення

3.1. Синтез, виготовлення та характеристика НЧ COS-BA/Ce6

У цьому дослідженні ми розробили нову невелику молекулу проліків COS-BA на основі водорозчинного олігосахариду хітозану (COS), який може підвищити хіміотерапевтичну активність пентациклічної тритерпенової бетулінової кислоти (BA) шляхом покращення поглинання клітинами через підвищення гідрофільності. COS (ступінь полімеризації, DP: 2e6), який використовується тут, був отриманий нашим раніше описаним методом30. Потім COS-BA був синтезований за допомогою реакції дегідратації конденсації. У поєднанні з аналізом основних компонентів COS, хімічна структура COS-BA вважалася модифікованою дисахаридом (DP:2) BA (додаткова інформація, рис. S1), що було підтверджено 1 H ЯМР, 13 C ЯМР та ESIeMS (Додаткова інформація, рис. S2eS4). Аналіз репрезентативного 1 H ЯМР показав чіткий протонний сигнал COS близько 2,64-3,93 ppm і C]CH2 піки (4,60, 4,73 ppm) BA, що демонструє успішний синтез COS-BA (рис. 1A). Для приготування комбінованого синергетичного протипухлинного реагенту COS-BA/Ce6 NPs був застосований універсальний підхід до повторного осадження шляхом взаємодії з високоефективним фотосенсибілізатором Ce6. Змінюючи початкові молярні співвідношення, обидві композиції COS-BA/Ce6 можуть утворювати сферичні наноструктури з модульованими розмірами (рис. 1B та додаткова інформація, рис. S5). У різних вхідних співвідношеннях COS-BA/Ce6 гідрофільні діаметри НЧ COS-BA/Ce6 були близько 200–300 нм із негативним z-потенціалом. Враховуючи, що наночастинки, отримані за рецептурою 8:1, показали нижчий індекс полідисперсності (PDI, 0,143) при відносно меншому розмірі (249 нм), для комбінованого лікування також була потрібна достатня кількість хіміотерапевтичного засобу COS-BA. Тому ми вибрали склади COS-BA/Ce6 (8:1) для наступного дослідження. За цієї оптимізації наночастинки COS-BA/Ce6 демонстрували вузький розподіл розмірів (рис. 1C) і хорошу розчинність у воді, що вказує на їх колоїдну природу (рис. 1D). Щоб дослідити причини такої успішної спільної збірки, поведінку первинної самоорганізації вільного COS-BA було досліджено за допомогою скануючої електронної мікроскопії (SEM) (рис. 1E), яка припустила, що COS-BA може утворювати дуже однорідний нано- сфера w168 нм, що означає, що хімічна модифікація COS не змінює здатність до самозбирання самого BA (Додаткова інформація, рис. S6). Саме ця властивість, зрештою, сприяє успішному створенню спільних вузлів. Примітно, що окрім твердої наноструктури, підтвердженої просвічуючою електронною мікроскопією (ТЕМ), НЧ COS-BA/Ce6 показали чітку структуру оболонки без структури НЧ COS-BA, а середня товщина оболонки становила приблизно 2,35 нм. Інші фізико-хімічні характеристики підсумовані на рис. 1F. Крім того, НЧ COS-BA/Ce6 показали негативний z-потенціал 5,38 мВ і гідродинамічний розмір w249 нм, що вище, ніж отримано з SEM (w182 нм). Одночасно ефективність завантаження та інкапсуляції Ce6 становила 8,1 і 96% відповідно, як визначено високоефективною рідинною хроматографією (ВЕРХ). Крім того, дані FT-IR (рис. 1G) ще більше підтвердили цю спільну збірку, оскільки НЧ COS-BA/Ce6 демонстрували характерні піки C]N, CeN і C]CH Ce6, які з’являлися при 1633, 1078 і 633 см 1 , відповідно.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

3.2. Механізм спільної збірки та формування структури оболонки

Згодом, щоб краще зрозуміти механізм спільної збірки, ми спочатку дослідили первинний процес формування NP. Ми виявили, що спільна збірка COS-BA з Ce6 може бути спонтанною, оскільки ці два види також можуть утворювати сферичну наноструктуру, навіть якщо не обробляти ультразвуком (Додаткова інформація, рис. S7), що може бути пов’язано з негативною зміною вільної енергії Гіббса (DG ) у співзборах37. Ця спонтанна збірка також свідчить про сильнішу міжмолекулярну взаємодію між COS-BA та Ce6. Загалом, міжмолекулярні взаємодії в супрамолекулярних власних (або ко-) збірках є нековалентним p-p-стекінгом, водневими зв’язками та силами Ван-дер-Ваальса 38,39. Для цього аналізу ми потім досліджували УФ-поглинання НЧ COS-BA/Ce6 (рис. 1H і F), ​​що припустило червоний зсув смуг Соре (410 нм) і Qy (667 нм) порівняно з вільний Се6 (405 і 665 нм відповідно). Тим часом також можна виявити значне червоне зміщене характерне поглинання COS-BA, що вказує на можливе міжмолекулярне укладання pp між COS-BA та Ce640. Крім того, після інкубації з поверхнево-активною речовиною додецилсульфатом натрію (SDS, 0,2% мас./об.) (Додаткова інформація, рис. S8), наночастинки COS-BA/Ce6 показали нещодавно зміщену в синій колір смугу Qy при 641 нм і різко відновили флуоресценцію, демонструючи що гідрофобні взаємодії також сприяли спільному збиранню28. Оскільки ці асоціативні нековалентні взаємодії, спільні збірки показали значне гасіння флуоресценції (98,2%) у воді (рис. 1I). У сукупності розумно вважати, що p‒p стекування та гідрофобні взаємодії можуть бути головними рушійними силами для побудови спільних вузлів. Після цього, щоб більш інтуїтивно зрозуміло візуалізувати процес складання та виявити основні причини, чому можуть утворюватися структуровані оболонкою НЧ, ми виконали спрощену імітаційну модель молекулярної динаміки (MD), яка містить 16 оптимізованих молекул COS-BA та додаткові дві молекули Ce6 у водяному ящику. . Спочатку ми оцінили можливу взаємодію/зв’язування самосборок COS-BA протягом 5 нс часу моделювання (рис. 2A та допоміжна інформація, рис. S9). Ми виявили, що, за винятком численних внутрішньомолекулярних водневих зв’язків у фракції COS, також можна спостерігати кілька пар міжмолекулярних Н-зв’язків між COS-BA (рис. 2B та додаткова інформація, рис. S10), що вказує на те, що водневий зв’язок може бути одним із основних рушійних сил формування НП COS-BA. Особливо цікаво те, що в самосборках COS-BA всі молекули COS-BA утворюють очевидно симетричну структуру (рис. 2C). Це захоплююче явище спонукало нас дослідити можливий зв’язок між цією властивістю та утворенням структурованих оболонкою наночастинок COSBA. Потім ми спробували розширити блоки коробки. Дивно, але з’єднані коробки, що складаються з молекул COS-BA, були розташовані регулярним чином, що призвело до «ортогональних» порожнистих мережевих структур (Додаткова інформація, рис. S11). Що ще важливіше, ми випадковим чином обчислили товщину молекул оболонки та виявили, що вона узгоджується з TEM (w2,35 нм) (рис. 2D). Ця тенденція до утворення порожнистих мережевих структур може бути відповідальною за утворення структурованих оболонкою NP. Щоб перевірити цю ідею, було змодельовано структуру MD спільних вузлів COS-BA/Ce6 (рис. 2E та допоміжна інформація, рис. S12). Подібно до самосборок COS-BA, велика кількість внутрішньомолекулярних і міжмолекулярних Н-зв’язків також була знайдена в спільних складаннях (рис. 2F і додаткова інформація, рис. S13). Крім того, можливе утворення pp між C]C COS-BA та ароматичним кільцем Ce6 спостерігалося в спільних збірках (рис. 2G), що узгоджується з даними попередніх УФ-досліджень. Після збільшення кількості блоків все ще можна знайти подібні порожнисті мережеві структури, але зі зниженою регулярністю та ортогональністю (Додаткова інформація, рис. S14). Це може бути можливою причиною неоднорідної морфології НЧ COS-BA/Ce6 порівняно з НЧ COSBA. Крім того, відстань молекулярної оболонки до шару також близька до товщини оболонки (w2,35 нм) НЧ, як видно за допомогою ПЕМ (рис. 2H). Разом ми припустили, що утворення структурованих оболонкою наночастинок COS-BA/Ce6 або наночастинок COS-BA в основному може бути пов’язано з цією тенденцією молекул збиратися в мережеві структури порожнистої оболонки.

Малюнок 1 Виготовлення та характеристика опосередкованих проліками бетулінової кислоти (COS-BA), модифікованих олігосахаридами хітозану, наноблоків COS-BA/Ce6 NP. (A) Посилені ключові позиції 1 H ЯМР COS-BA. (B) Підготовка спільно зібраних наночастинок COS-BA/Ce6 з різними співвідношеннями COS-BA/Ce6. (C) Розподіл наночастинок COS-BA/Ce6 за розмірами з використанням COS-BA та Ce6 (молярне співвідношення 8:1) як будівельних блоків. (D) Розчинність у воді та ефект Тиндаля спільних зборів вказують на колоїдну природу. (E) SEM і TEM зображення вільних самосборок COS-BA і спільно зібраних наночастинок COS-BA/Ce6. (F) Резюме фізико-хімічних властивостей НЧ COS-BA/Ce6. (G) FT-IR спектри, (H) UV Vis спектри та (I) спектри випромінювання флуоресценції вільного Ce6, COS-BA та спільно зібраних COS-BA/Ce6 NPs у воді.

Рисунок 2. Структури (A) самосборок COS-BA та (E) спільно зібраних НЧ COS-BA/Ce6 після моделювання молекулярної динаміки (MD) протягом 5 нс із молярним співвідношенням структурних одиниць 8:1 (COS-BA /Ce6, розрахований на основі ефективності завантаження Ce6). Лінійна модель використовувалася для H2O, а стрижні моделі представляють молекули COS-BA або Ce6, де атоми C Ce6 позначені фіолетовим кольором. Інформація про водневий зв’язок між молекулами COS-BA в (B) їх власних збірках і (F) спільних збірках COS-BA/Ce6 NP. (C) Очевидно симетрична структура молекулярного розташування COS-BA після MD моделювання. (G) Можливі молекулярні взаємодії між COS-BA та Ce6 показують потенційне накопичення pp. Вказана товщина молекул оболонки в «ортогональній» порожнистій мережевій структурі після розширення відповідних блоків MD (D) вільних самосборок COSBA та (H) спільних збірок COS-BA/Ce6 NP.

3.3. Енергетичний механізм посиленої генерації 1 O2

Далі ми додатково дослідили утворення синглетного кисню (1 O2), одного з критичних активних форм кисню (АФК) для ефективності PDT, використовуючи DPBF (1,3-дифенілізобензофуран) як зонд. Після тривалого опромінення розчинів суміші COS-BA/Ce6 NPs з DPBF, УФ-поглинання DPBF зменшилося за інтенсивністю, що вказує на 1 генерацію O2 (рис. 3A). Після порівняння з еталонним метиленовим синім (MB), F ( 1 O2) НЧ COS-BA/Ce6 було розраховано як 0.26, трохи вище, ніж вільний Ce6 (FZ0.19) (Рис. 3B). Як правило, енергія, що поглинається фотосенсибілізаторами, проходитиме три шляхи релаксації, включаючи флуоресценцію, ефект нагрівання через вібраційну релаксацію та генерацію АФК через міжсистемний перетин (ISC)41. У відповідності зі значно погашеним випромінюванням флуоресценції, наночастинки COS-BA/Ce6 також не сприяли жодному ефекту нагрівання у воді (додаткова інформація, рис. S15), що означало посилений процес ISC після спільної збірки Ce6 з COS-BA, таким чином ведучи до покращеного покоління 1 O2. Для подальшого з’ясування молекулярного механізму такого ефекту ми спробували оптимізувати та розрахувати можливу одномолекулярну модель COS-BA/Ce6, що складається з потенційного стекінгу pp, отриманого в результаті моделювання МД за допомогою теорії функціоналу густини (DFT) (рис. 3C). . Дивовижно, але COS-BA/Ce6 показав спостережуване поглинання ультрафіолетового випромінювання з червоним зміщенням на 581,24 нм, ніж у вільного Ce6 (579,30 нм), що вказує на появу pp стекінгу (рис. 3D). Незважаючи на те, що геометрія COS-BA/Ce6 з мінімізованою енергією показала незначні структурні відмінності з введеною конфігурацією MD, все ще можна було спостерігати характерне стекування між зв’язками C]C або C]O COS-BA з порфіновим кільцем Ce6, що ще більше підтверджує те, що вище p‒p можливе укладання. Між тим, нещодавно було продемонстровано, що підвищена ефективність донорства електронів за рахунок p-p стекінгу може сприяти процесу ISC42, тоді як швидкість ISC (KISC) пропорційна (1/DEST) 2,43. Тобто менший енергетичний розрив (DEST) фотосенсибілізатора посилить процес ISC, сприяючи ефективному виробленню АФК. Потім ми обчислюємо найнижчий збуджений синглетний стан (S1) і триплетний стан (T1) Ce6 і COS-BA/Ce6 (рис. 3E), відповідно. Результати показали, що COS-BA/Ce6 продемонстрував зниження DEST на 1,1892 еВ порівняно з вільним Ce6 (1,2001 еВ), підтверджуючи покращений процес ISC. Зменшення DEST корисно для виробництва 1 O2, що також підтверджено в інших нанофотосенсибілізаторах44. Взяті разом, p-стекування, схоже, зменшує DEST Ce6 після спільного збирання з COS-BA, що призводить до покращеного генерування 1 O2.

Рисунок 3. Енергетичний механізм покращеної генерації 1 O2, індукованої НЧ COS-BA/Ce6. (A) UV Vis спектри фоторозпаду 1,3-дифенілізобензофурану (DPBF) після тривалого опромінення НЧ COS-BA/Ce6. (B) На графіках першого порядку зміни УФ-поглинання DPBF (DOD) вихід 1 O2 оцінювався з використанням метиленового синього (MB) (FZ 0.52) у ДМСО як контрольної сполуки. (C) Структури з мінімізованою енергією можливої ​​одномолекулярної моделі COS-BA/Ce6, огляд збоку та спереду, яка була отримана відповідно до початкової молекулярної конфігурації між Ce6 та COS-BA після MD моделювання та наступних розрахунків DFT. (D) Передбачувані переходи спектрів поглинання UV Vis (вертикальні стовпчики) вільного Ce6 та оптимізована модель COS-BA/Ce6. (E) Розраховані рівні енергії їх найнижчого збудженого синглетного стану (S1) і найнижчого триплетного стану (T1), відповідно, [Gaussian 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Де DEST розраховується як ES1 ET1.

3.4. Характеристики періоду спокою при хіміотерапії

Після цього, щоб підтвердити концепцію дизайну в цьому дослідженні, що розробка амфіфільної молекули COS-BA може ефективно підвищити терапевтичний ефект БА шляхом покращення поглинання клітиною через підвищення гідрофільності, а тим часом подальше конструювання чутливого до стимулів і повністю гідрофільного COS-BA/Ce6 НЧ сприяли його спокою в нормальних тканинах і активації в місцях пухлини. Щоб перевірити цю гіпотезу, ми спочатку дослідили поведінку вивільнення ліків COS-BA/Ce6 NPs у різних буферних розчинах (рис. 4A). Результати показали, що НЧ COS-BA/Ce6 показали pH-чутливу поведінку із кумулятивним вивільненням Ce6 88% при pH 5,6 і 57% при pH 7,4 через 24 години відповідно. Ця особливість, ймовірно, виникла внаслідок руйнування численних водневих зв’язків, які існували в наночастинках COS-BA/Ce6 після введення кислого Hþ45, що призвело до збільшення вивільнення Ce6 (рис. 4B). Це було додатково підтверджено розбиранням наночастинок COS-BA/Ce6 після інкубації безпосередньо в кислому середовищі (рис. 4C). Ця функція, що реагує на рН, може бути корисною для ефективної протипухлинної терапії через слабокисле мікрооточення пухлини34. Тим часом наночастинки COS-BA/Ce6 мали кращу стабільність, оскільки після інкубації в PBS та середовищі для культури клітин 1640-RMPI протягом 10 днів не спостерігалося значних змін розміру або PDI (додаткова інформація, рис. S16), що було б важливо для їх потенційного використання для подальших біомедичних застосувань. Згодом було проведено подальші дослідження шляхом оцінки цитотоксичності вільного ліпофільного БА (кут контакту q: 133,3 ) та амфіфільного COS-BA (q: 52 ) (рис. 4D) за допомогою стандартних аналізів метилтіазоліл-дифенілтетразолію броміду (МТТ). Як і було передбачено, для ракових клітин 4T1 або нормальних гепатоцитів LO2 індивідуальний COS практично не має протипухлинної активності при відносно низьких дозах. Це може бути пов’язано з антипроліфераційними ефектами COS, які активуються через індукцію сигнального шляху NF-kB лише у високих концентраціях (приблизно на рівні міліграмів)30. У той час як COS-BA має надзвичайно низькі значення IC50 (6,03 мг/мл для 4T1 і 9,92 мг/мл для LO2) порівняно з показниками BA (17,63 мг/мл для 4T1 і 20,53 мг/мл для LO2) навіть при однакових масових концентраціях (рис. 4E і J). Отримані результати свідчать про те, що модифікація водорозчинного COS значно підвищує ефективність поглинання клітинами ліпофільного БА, що призводить до сильної протипухлинної активності COS-BA. Щоб кількісно визначити ефективність поглинання, накопичення BA або COS-BA в клітинах 4T1 безпосередньо визначали за допомогою ВЕРХ (додаткова інформація, рис. S17). Результати чітко підтвердили, що амфіфільний COS-BA демонструє значно більше поглинання, ніж вільний BA (приблизно в 3.6-рази після 3 годин інкубації), демонструючи посилену хіміотерапевтичну активність COS-BA. Наведений вище висновок був додатково підтверджений значно покращеною цитотоксичністю амфіфільної COSBA проти ракових клітин HepG2 і MCF-7 (Додаткова інформація, рис. S18), що добре узгоджується з концепцією дизайну. Після спільного збирання з Ce6 ми виявили, що НЧ COS-BA/Ce6 без опромінення виявляють помітно пригнічену цитотоксичність проти ракових клітин 4T1 порівняно з еквівалентом COS-BA, особливо при 11,5 мг/мл, але основна активність ФДТ не вплинула ( рис. 4F). Щоб більш повно підтвердити це явище, ми додатково дослідили in vitro цитотоксичність НЧ COS-BA/Ce6 проти інших ракових клітин, включаючи MCF-7 і HepG2. Цікаво, що амфіфільний COS-BA продемонстрував дуже сильну цитотоксичність проти клітин MCF-7 (рис. 4G), але хіміотерапевтична активність значно знизилася після спільної збірки з Ce6, тобто неопромінених НЧ COS-BA/Ce6. Подібні результати також спостерігалися в клітинах HepG2 лише з незначним зниженням (рис. 4H). Щоб підтвердити вищезазначені висновки, ми також оцінили хіміотерапевтичні ефекти нанокомпонентів і COS-BA проти нормальних клітин L929 фібробластів миші та гепатоцитів LO2 людини (рис. 4I). Результати показали, що зібрані наночастинки COS-BA/Ce6 значно зменшили вихідний високотоксичний амфіфільний препарат COS-BA, демонструючи чудову біосумісність. Аналізуючи цитотоксичність, значення IC50 амфіфільної COS-BA були значно нижчими, ніж у спільно зібраних наночастинок COS-BA/Ce6 незалежно від ракових або нормальних клітин (рис. 4J). Тобто конструкція повністю гідрофільних і чутливих до стимулів нанокомпонентів може заздалегідь ефективно пригнічувати високу цитотоксичність амфіфільного препарату COS-BA. Враховуючи характерну реакцію на рН, здається, що НЧ COS-BA/Ce6 будуть неактивними в нормальних тканинах з бажаною низькою токсичністю хіміотерапії, але активними в пухлинних тканинах завдяки їх стимулюючому вивільненню високотоксичного COS-BA в слабокислій пухлині. мікросередовище. У сукупності, на відміну від неофункціоналізації хіміотерапевтичних реагентів, яка має підвищену протипухлинну активність22,23, амфіфільні наногрупи, опосередковані COS-BA, не тільки демонструють розумну характеристику «сплячки» з прихованим ефектом хіміотерапії, але й зберігають спеціалізовану активність ФДТ, демонструючи величезний потенціал для розумної протипухлинної терапії.

Рисунок 4 (A) Профілі вивільнення Ce6 in vitro з НЧ COS-BA/Ce6 у PBS (pH 7,4, 6,5 або 5,6), що містить Tween 80 (0.5%, об./об.) при 37 C. (B) Можливий pH-чутливий механізм, який Hþ запускає розбирання НЧ. (C) Розбирання наночастинок COS-BA/Ce6 після прямої інкубації у воді з pH приблизно 4.0. (D) Контактний кут вільних НЧ BA, Ce6, COS-BA та COS-BA/Ce6 відповідно. (E) Клітинна цитотоксичність вільного BA, COS і амфіфільного COS-BA проти типових ракових клітин 4T1 і нормальних клітин LO2. Життєздатність ракових клітин (F) 4T1, (G) MCF-7, (H) HepG2 після інкубації з вільними НЧ COS-BA, COS-BA/Ce6 з/без опромінення при вказаній еквівалентній концентрації COS-BA протягом 24 год. (I) Клітинна цитотоксичність вільного COS-BA, неопромінених НЧ COS-BA/Ce6 проти нормальних клітин LO2 і L929. (J) IC50 аналіз COS-BA проти раку та нормальних клітин. Дані виражені як середнє SD (n Z 6). *P ˂ 0.05, **P ˂ 0,01 і ***P ˂ 0,001 показують значні відмінності.

Щоб дослідити можливі причини цієї характеристики спокою при хіміотерапії, залежну від часу поведінку поглинання клітинами COS-BA/Ce6 NPs послідовно оцінювали шляхом інкубації з раковими клітинами 4T1. Результати показали, що, незважаючи на те, що НЧ COS-BA/Ce6 продемонстрували значне гасіння флуоресценції, вони все ще продемонстрували підвищену фагоцитарну ефективність порівняно з вільним Ce6 завдяки сильнішій цитоплазматичній червоній флуоресценції, як визначено кількісним аналізом проточної цитометрії (рис. 5A). Цю покращену клітинну інтерналізацію NPs можна віднести до ендоцитозу21. Взявши разом, ми припустили, що, хоча високорозчинні водорозчинні збірки COS-BA/Ce6 NPs (контактний кут q: 36,7 ) демонструють покращений клітинний ендоцитоз, ніж ліпофільний Ce6 (q: 132,6, близький до BA), знижена ефективність фагоцитозу НЧ можуть з’являтися порівняно з амфіфільною молекулою COS-BA, таким чином, здається, пригнічується хіміотерапевтична цитотоксичність НЧ COS-BA/Ce6. Тобто ефективність поглинання клітиною від високої до низької як така послідовність: амфіфільний COS-BA, гідрофільний COS-BA/Ce6 NP, ліпофільний BA або Ce6. Що ще важливіше, неадекватне розбирання клітинних НЧ може бути іншою важливою причиною ослабленого хіміотерапевтичного ефекту, все це може бути пов’язано з інтелектуальним хіміотерапевтичним спокоєм НЧ COS-BA/Ce6. Крім того, оскільки розбирання наночастинок було спеціально проведено в кислому середовищі пухлинних клітин, щоб продемонструвати властивість реагувати на рН, ми додатково спробували порівняти ефекти поглинання наночастинок COS-BA/Ce6 у нормальних клітинах LO2 (рис. 5B) . Однак НЧ COS-BA/Ce6 не виявляли суттєво інгібованої червоної флуоресценції Ce6 у клітинах LO2. Навпаки, поведінка поглинання LO2 була подібною до поведінки ракових клітин 4T1, що свідчить про те, що НЧ COS-BA/Ce6 також можуть розкладатися навіть у нормальних клітинах, що може бути результатом слабокислого рН внутрішньоклітинних компартментів (ендосом/лізосом), що існують усередині як ракові, так і нормальні клітини46. Оскільки клітинне поглинання наночастинок залежить від процесу ендоцитозу, пряма інкубація препарату може не підкреслити рН-чутливість наночастинок COS-BA/Ce6 на клітинному рівні. Тим не менш, мікрооточення пухлини (TME) є дуже кислим порівняно з нормальними тканинами47. Незалежно від внутрішньоклітинного раку чи ТМЕ, НЧ COS-BA/Ce6 можуть реагувати на pH і розібратися, щоб викликати вивільнення високотоксичного COS-BA. Тоді як у нормальних тканинах наночастинки COS-BA/Ce6 можна було розібрати лише після потрапляння в нормальне клітинне середовище, зменшуючи ймовірність вивільнення COSBA. Таким чином, ми робимо висновок про те, що характеристика хіміотерапевтичного спокою НЧ COS-BA/Ce6 щодо мікрооточення пухлини є дійсною та надійною, а ідея дизайну в цьому дослідженні є здійсненною.

3.5. Протипухлинна ефективність хіміотерапії in vitro/PDT COS-BA/Ce6 NPs

Крім того, перед детальною хіміотерапією/ФДТ протипухлинною ефективністю COS-BA/Ce6 NP in vitro та для подальшого розкриття механізму ендоцитозу ми вивчаємо чотири основні шляхи ендоцитозу шляхом додавання відповідних інгібіторів ендоцитів, включаючи хлорпромазин (опосередкований клатрином), хлорохіну фосфат ( інгібітор підкислення лізосом), ністатин (опосередкований кавеолами) та інгібітор макропіноцитозу EIPA (етилізопропіламілорид) (рис. 5C і D). Ми спостерігаємо, що введення ністатину та хлорпромазину може більш ефективно пригнічувати фагоцитарну ефективність, ніж EIPA та хлорохінфосфату, демонструючи суттєво знижену клітинну флуоресценцію порівняно з нормальним 37 C. Ці результати вказують на те, що НЧ COS-BA/Ce6 інтерналізуються кількома механізмами, головним чином через шляхи ендоцитозу, опосередковані клатрином і кавеолами. Оскільки збільшення генерації 1 O2 через міжмолекулярні взаємодії, наночастинки COS-BA/Ce6 демонструють значно підвищений вихід міжклітинних АФК, ніж у Ce6, на що вказує сильніша зелена флуоресценція зонда DCFH (рис. 5E), що означає вищу фотодинамічну ефективність. Аналізи МТТ демонструють, що наночастинки COS-BA/Ce6 під опроміненням виявляють помітно посилений інгібуючий ефект на клітини 4T1, ніж еквівалент Ce6, але мають відносно помірну цитотоксичність без опромінення (рис. 5F). Важливо, що IC50 Ce6 ​​(0,53 мг/мл) у НЧ COS-BA/Ce6 був набагато нижчим, ніж у вільному Ce6 (1,39 мг/мл) (рис. 5G), що свідчить про значно покращену ефективність ФДТ, яка була додатково продемонстровано цитотоксичністю НЧ COSBA/Ce6 проти людських MCF-7 і ракових клітин HepG2 (додаткова інформація, рис. S19). Подібним чином, порівняно з вільним Ce6, відносно нижчі значення IC25, IC50 та IC75 також спостерігалися в комбінованих збірках (рис. 5G). Тим часом, порівняно з лише Ce6 PDT та одноразовою хіміотерапією NPs у темряві, COS-BA/Ce6 NPs під опроміненням досягли більш ефективної комбінованої хіміотерапії/PDT проти вищевказаних трьох ракових клітин, демонструючи синергізм (індекс комбінації: CI ˂ 1) ( рис. 5I). Крім того, подвійне фарбування флуоресценції живих/мертвих клітин із використанням кальцеїн-ацетоксиметилового ефіру (кальцеїн-АМ) та йодиду пропідію (PI) додатково підтвердило, що НЧ COS-BA/Ce6 можуть ефективно індукувати апоптоз і некроз клітин, оскільки оброблені клітини були майже забарвлені. з червоним сигналом флуоресценції PI при культивуванні протягом додаткових 10 годин після опромінення (рис. 5H). Тим часом, неопромінені НЧ COS-BA/Ce6 (вища доза Ce6: 3,2 мг/мл) також мали певну хіміотерапевтичну активність, що видно одночасно за сигналами AM і PI. Цю надзвичайно покращену PDT-активність НЧ COS-BA/Ce6 було додатково підтверджено фарбуванням AM/PI після лікування протягом додаткових 20 годин (Додаткова інформація, рис. S20). Крім того, при додаванні азиду натрію (SA) і D-маніту (DM), окремого спеціального гасника 1 O2 і $OH48, до клітин 4T1, оброблених COS-BA/Ce6 NPs-PDT, очевидно підвищена життєздатність клітин означала, що Фотореакції типу I ($OH) і типу II (1 O2) відбувалися одночасно в процесі PDT, опосередкованому наночастицями COSBA/Ce6 (рис. 5J). Крім того, наночастинки COS-BA/Ce6 мають кращу сумісність з кров’ю, про що свідчить незначний гемоліз еритроцитів (рис. 5K), що свідчить про потенціал для біомедичних застосувань шляхом внутрішньовенного введення.

3.6. Біорозподіл НЧ COS-BA/Ce6 in vivo

Згодом, перед дослідженням розподілу in vivo, ми оцінили фармакокінетику НЧ COS-BA/Ce6 шляхом моніторингу концентрації Ce6 у крові після внутрішньовенної ін’єкції еквівалентних НЧ Ce6 або COS-BA/Ce6. Профілі концентрації Ce6 у крові (рис. 6A) і порівняльні фармакокінетичні параметри (таблиця допоміжної інформації S1) чітко свідчать про те, що НЧ COS-BA/Ce6 мають тривалу циркуляцію в крові, що може сприяти більшому накопиченню в пухлині сайти. Зокрема, НЧ COS-BA/Ce6 показали швидке виведення з крові протягом 2 годин, що свідчить про сприятливу здатність до біологічного розкладання. Відповідно, потім ми досліджували біорозподіл in vivo та здатність до накопичення пухлини НЧ COS-BA/Ce6 (рис. 6B і C). Подібно до загальновідомих нанокомпозитів Ce633, НЧ COS-BA/Ce6 можуть швидко поширюватися по всьому тілу. Особливо протягом перших 4 годин збірки демонстрували явно сильніше випромінювання флуоресценції в місцях пухлини, ніж вільний Ce6, що свідчить про покращене утримання та здатність націленого на пухлину накопичення НЧ COS-BA/Ce6, ймовірно, через ефект пасивного утримання підвищеної проникності (EPR). наночастинки14. Через 6 годин після ін'єкції інтенсивність флуоресценції в місцях пухлини поступово швидко зменшувалася. Примітно, що на відміну від нанокомпозитів, про які зазвичай повідомляють, зі значно посиленим накопиченням пухлини порівняно з вільним позитивним лікарським засобом29, НЧ COS-BA/Ce6 не показали дуже значного накопичення в місцях пухлини через 24 години після ін’єкції, ніж вільний Ce6 (рис. 6C), який був далі підтверджується зображенням вирізаної пухлини (рис. 6D і E). Відмінна здатність до біологічного розкладання НЧ може бути відповідальною за введення природних малих органічних молекул. Це також спостерігалося з іншими терпеноїдами, опосередкованими малими молекулами нанокомпонентами49. Крім того, наночастинки COS-BA/Ce6 також продемонстрували подібний розподіл у тканинах, як вільний Ce6 (рис. 6E), і середня інтенсивність флуоресценції ex vivo була загалом нижчою, ніж інтенсивність флуоресценції in vivo, що додатково означає хорошу здатність до біологічного розкладання. Крім того, враховуючи велику різницю в рівнях флуоресценції між 2 та 4 годинами після ін’єкції НЧ і Ce6, а також експериментальну працездатність, що дозволяє достатні інтервали для опромінення, 4 години після введення було обрано як точку світлового часу для наступної терапії ФДТ.

Враховуючи не дуже помітне накопичення пухлини через 24 години, ніж вільний Ce6, для подальшої перевірки посиленого ефекту EPR, який справді мають НЧ COS-BA/Ce6, ми негайно відстежували флуоресцентні зображення пухлин ex vivo в різний час після внутрішньовенної ін’єкції нанопрепаратів ( Рис. 6F і G). Примітно, що або через 20 хвилин, або через 12 годин після ін’єкції НЧ COS-BA/Ce6 справді демонстрували сильнішу флуоресцентну емісію в місцях пухлини, ніж вільний Ce6, демонструючи чудову та підвищену здатність до накопичення пухлини. Тим часом, з часом інтенсивність флуоресценції, що зберігається в пухлинній тканині, поступово слабшає (рис. 6G), що повністю узгоджується з результатами флуоресцентної візуалізації тварин in vivo. Очевидно, що цей швидкий біологічний метаболізм і посилене накопичення пухлини дозволили уникнути потенційної довгострокової токсичності накопичення, гарантуючи високоефективну протипухлинну терапію з кращою біобезпекою.

Малюнок 5. Протиракова ефективність in vitro НЧ COS-BA/Ce6. Клітинна інтерналізація (A) ракових клітин 4T1 і (B) нормальних клітин LO2, інкубованих у вільних НЧ Ce6 або COS-BA/Ce6 протягом 0.5 і 3 годин, і відповідний проточний цитометричний аналіз інтенсивності флуоресценції. (C) Дослідження інгібування специфічного ендоцитного шляху та (D) відповідна інтенсивність флуоресценції клітин, виміряна проточною цитометрією після інкубації з COSBA/Ce6 NP з/без інгібіторів ендоцитів, включаючи хлорпромазин, хлорохін, ністатин та етилізопропіламілорид (EIPA). Масштаб Z 20 мм. (E) Клітинна генерація ROS, індукована вільними НЧ Ce6 або COS-BA/Ce6 (еквівалент Ce6: 1,6 мг/мл). Масштаб Z 20 мм. (F) Життєздатність клітин 4T1 після різних обробок протягом 24 годин. (G) Аналіз IC25, IC50, IC75 вільних НЧ Ce6 і COS-BA/Ce6 проти клітин 4T1, MCF-7 і HepG2 відповідно. (H) Фарбування живими/мертвими кальцеїном-AM/йодидом пропідію (PI) клітин 4T1, оброблених COS-BA/Ce6 (Ce6: 1,6 мг/мл), після інкубації протягом додаткових 10 годин, а також неопромінених COS- НЧ BA/Ce6 (Ce6: 3,2 мг/мл). Масштаби Z 50 мм. (I) Індекс комбінації (CI) COS-BA/Ce6 NPs на клітинах 4T1, MCF-7 і HepG2, як визначено розрахунком за теоремою Чоу Талалая. (J) Механізми PDT (Тип I і Тип II), індуковані опроміненням НЧ COS-BA/Ce6 і оцінені за допомогою специфічних гасників 1 O2 і $OH азиду натрію (SA) і D-маніту (DM), відповідно. (K) Відсоток гемолізу еритроцитів після інкубації з COS-BA/Ce6 NP протягом 4 годин. Дані виражені як середнє SD (n Z 3). *P ˂ 0,05, **P ˂ 0,01 і ***P ˂ 0,001 демонструють достовірні відмінності.

Малюнок 6 Кровообіг in vivo та біорозподіл НЧ COS-BA/Ce6. (A) Профілі концентрації Ce6 у крові після внутрішньовенних ін’єкцій еквівалентного Ce6 або спільно зібраних НЧ COS-BA/Ce6 (n Z 3). (B) Флуоресцентні зображення всього тіла мишей з пухлиною 4T1 після внутрішньовенних ін'єкцій вказаних препаратів у різні моменти часу. (C) Середня інтенсивність флуоресценції, отримана з ділянок пухлини в (B). (D) Флуоресцентні зображення ex vivo пухлин і основних органів, вирізаних у вищезазначених мишей через 24 години, і відповідний (E) кількісний результат інтенсивності флуоресценції (n Z 3). (F) Флуоресцентні зображення ex vivo пухлин і основних органів у різний час після внутрішньовенних ін’єкцій Ce6 або COS-BA/Ce6 NP, і (G) відповідний аналіз інтенсивності флуоресценції пухлин. Дані виражені як середнє SD (n Z 3).

3.7. Комбінаторне протипухлинне лікування хіміотерапією/ФДТ in vivo 

Враховуючи унікальну характеристику спокою, хорошу здатність до біологічного розкладання та активність ФДТ, було досліджено комбіновану протипухлинну терапію in vivo хіміотерапією/ФДТ. Мишей із пухлиною 4T1 випадковим чином розділили на 6 груп і вводили внутрішньовенно еквівалент Ce6 (3,5 мг/кг тіла) кожні 2 дні, загалом три дози. Через 4 години після ін'єкції ділянки пухлини мишей у світлих групах опромінювали протягом 15 хвилин (рис. 7A). Тим часом відповідні об’єми пухлини або масу тіла реєстрували через день. Після 14 днів лікування (рис. 7B) вільний Ce6 з опроміненням і вільний COS-BA виявилися неефективними для пригнічення пухлини, ймовірно, через обмежене накопичення препарату в пухлинній тканині. Навпаки, після опромінення НЧ COS-BA/Ce6 спостерігалося найбільш значне інгібування пухлини, що підтверджує чудову ефективність комбінації хіміотерапії/ФДТ. Середня вага пухлини (рис. 7D) і відповідні фотографії розсічених пухлин (рис. 7E) продемонстрували найкращу протипухлинну ефективність НЧ COS-BA/Ce6 під опроміненням, оскільки миші, які отримували лікування, показали найменші розміри пухлин, ніж миші інших груп. Середній коефіцієнт інгібування пухлини оброблених PDT COS-BA/Ce6 NP досягав 80,3%, вище, ніж у вільного Ce6 PDT (42,4%) і вільного COS-BA (38,5%). Примітно, що хоча попередні дослідження in vitro показали, що НЧ COS-BA/Ce6 без світла виявляли неактивну функцію хіміотерапевтичної активності, вони все ще демонструють підвищену протипухлинну ефективність (49,5%) порівняно з вільним COS-BA (рис. 7D). Ми припустили, що цьому результату сприяють дві можливі причини, одна - це більш високе накопичення пухлини COS-BA/Ce6 NP через широко відомий ефект EPR. Іншим фактором є слабокисле мікрооточення пухлини, яке стимулювало вивільнення високотоксичного COS-BA. Через вищу критичну концентрацію міцел (CMC, 187 мг/мл) COS-BA (додаткова інформація, рис. S21), він міг існувати в мономерному стані в середовищі пухлини, таким чином сприяючи покращеній хіміотерапії неопромінених COS-BA НЧ BA/Ce6. Крім того, для подальшої перевірки вищої протипухлинної ефективності НЧ COS-BA/Ce6 було проведено фарбування пухлин гематоксиліном та еозином (H&E) (рис. 7G).

Рисунок 7 Дослідження ефективності з підшкірною моделлю ксенотрансплантата 4T1. (A) Схематичне зображення лікування ФДТ in vivo. (B) Профілі росту пухлини, (C) зміни ваги тіла та (D) маси вирізаної пухлини, що містить коефіцієнти інгібування пухлини, у мишей, які несуть 4T1-, після різних обробок у зазначених групах (n Z 5 для кожної групи). (E) Зображення вирізаних пухлин у типових мишей після лікування. (F) Біохімічний аналіз сироватки після лікування наночастицями COS-BA/Ce6 протягом 14 днів. (G) Репрезентативне фарбування H&E вирізаних зрізів пухлини після різних процедур. Масштаби Z 50 мм. (H) Фарбування TUNEL вільних Ce6 і COS-BA/Ce6 NPs, оброблених ФДТ зрізів пухлини. Масштабні стовпчики Z 20 мм **P <0,01 вказують на значні відмінності.

Результати показали, що зрізи пухлини, оброблені COS-BA/Ce6 NPs-PDT, показали серйозне пошкодження тканини та дефіцит ядер, тоді як помірний некроз тканин спостерігався в інших групах. Одночасно, порівняно з вільним світлом Ce6, НЧ COS-BA/Ce6 під опроміненням значно збільшили кількість TUNEL-позитивних клітин, які демонструють сильніше коричневе забарвлення ядер (рис. 7H), що додатково підтверджує чудову комбіновану терапію хіміотерапією/ФДТ. Крім того, не спостерігалося явних варіацій маси тіла в усіх групах (рис. 7C). Навіть якщо групи COSBA/Ce6 NPs або Ce6 light мали помірну втрату ваги тіла під час введення, вага тіла повернулася до норми через кілька днів. Жодних очевидних пошкоджень або запальних уражень не було виявлено в основних органах, зібраних наприкінці обробки (додаткова інформація, рис. S22), що вказує на низьку/відсутність системної токсичності та хорошу біобезпеку НЧ COS-BA/Ce6. Крім того, хоча НЧ COS-BA/Ce6 в основному накопичуються в тканині печінки, відповідні маркери функції печінки (ALT, AST і ALP) не показали значних змін порівняно зі здоровими мишами (рис. 7F), що свідчить про кращу біосумісність. Крім того, маркери ниркової функції (BUN, CRE та UA) та біохімічні параметри (ALB та TBIL) також виявилися подібними до нормальних мишей, що додатково означає кращу біобезпеку. Очевидно, що ці невеликі органічні проліки, опосередковані COS-BA, спільні збірки COS-BA/Ce6 NPs мають численні сприятливі терапевтичні властивості, які відкривають привабливі можливості для застосування в клінічній медицині.

3.8. Протипухлинний імунітет комбінованої хіміотерапії/ФДТ і анти-PD-L1 блокади

Нещодавно численні інноваційні дослідження показали, що поєднання імунотерапії раку з іншими методами лікування може ефективно викликати пухлиноспецифічні імунні відповіді на усунення первинних або віддалених пухлин1. Підбадьорені унікальною функцією спокою при хіміотерапії та відмінною протипухлинною ефективністю хіміотерапії/ФДТ НЧ COS-BA/Ce6, ми задаємося питанням, чи можуть вони також викликати імунологічні відповіді за допомогою імунного ад’юванта анти-PD-L1, щоб викликати високоефективну протипухлинну терапію . Чи може він лікувати віддалені пухлини, які не можна лікувати безпосередньо за допомогою лікування ФДТ, таким чином забезпечуючи альтернативну стратегію для клінічних протипухлинних застосувань? Щоб перевірити цю гіпотезу, у цьому дослідженні була створена модель «двох пухлин», а детальні експериментальні процедури показані на рис. 8A. Як правило, дві пухлини 4T1 були щеплені в лівий і правий боки кожної миші. Враховуючи, що анти-PD-L1 сам по собі не має помітного імунотерапевтичного ефекту50, експерименти були розділені на 5 груп, включаючи групу без лікування, COS-BA/Ce6 NPs, COS-BA/Ce6 NPs з анти-PD-L1, COS- НЧ BA/Ce6 зі світлом, НЧ COS-BA/Ce6 зі світлом і анти-PD-L1. Після одноразової внутрішньовенної ін’єкції НЧ (Ce6: 3,5 мг/кг) праві пухлини (первинна пухлина) у світлих групах опромінювали протягом 15 хвилин для оцінки імунологічних ефектів ФДТ/хіміотерапії, тоді як ліві пухлини (віддалені пухлини) у всіх групах без лікування були відібрані індивідуальні хіміотерапевтичні засоби. Згодом, у дні 2, 4 та 6, мишам у імунних групах внутрішньовенно вводили антитіло проти PD-L1 (15 мг на мишу на ін’єкцію) у цілому три дози. Важливо, що незалежно від лікування ФДТ чи ні, НЧ COS-BA/Ce6 плюс анти-PD-L1 можуть ефективно пригнічувати прогресування первинної пухлини (рис. 8B). І відповідні середні коефіцієнти інгібування пухлини окремо досягли 86.7% (опромінення) і 76,5% (без опромінення), що набагато вище, ніж індивідуальна хіміотерапія (5,7%) або лікування хіміотерапією/ФДТ (27,4%) (рис. 8C). . Фотографії розсічених пухлин (рис. 8D) і мишей, що несуть 4T1- (додаткова інформація, рис. S23) після 14 днів лікування також візуально підтвердили вищезазначений висновок. Ці результати свідчать про те, що як хіміотерапія на основі НП, так і хіміотерапія/ФДТ можуть ефективно активувати протипухлинний імунітет. Між тим, найбільш вражаюче те, що блокада анти-PD-L1 плюс наночастинки також забезпечили чудовий ефект інгібування пухлини для неопромінених віддалених (ліворуч) пухлин (рис. 8E та F), загалом сильніший, ніж поодинці наночастинки COS-BA/Ce6, які були також підтверджено відповідними розрізаними пухлинами та зображеннями мишей після лікування (рис. 8D та рис. S23), що додатково демонструє ефективну протипухлинну імунну відповідь, індуковану НЧ COS-BA/Ce6.

Щоб повністю вивчити цю ефективну протипухлинну імунну відповідь, цитотоксичні Т-лімфоцити CD8® (CTL), критичні імуноцити для імунотерапії раку4, були додатково оцінені шляхом аналізу імунних клітин у правій або лівій пухлинах після 14 днів лікування. Було виявлено, що наночастиці COS-BA/Ce6 плюс анти-PD-L1 з лікуванням ФДТ або без нього викликають стійку інфільтрацію CD8þ CTL у первинних пухлинах (рис. 8H і J). Інфільтрація CD8® CTL становила до 11,3% після хіміотерапії на основі COS-BA/Ce6 NPs/PDT плюс лікування анти-PD-L1, трохи вище, ніж COS-BA/Ce6 NPs плюс анти-PD-L1 (9,63%), і значно вище, ніж в інших групах без анти-PD-L1, включаючи лікування хіміотерапією на основі COS-BA/Ce6 NPs (5,12%) або хіміотерапією/PDT лише (4,07%). Подібним чином, порівняно з неімунними групами, значне збільшення інфільтрації ЦТЛ також спостерігалося в лівих (віддалених) пухлинах у мишей після COS-BA/Ce6 NPs плюс антиPD-L1 з або без лікування PDT (рис. 8I та K), далі означаючи високоефективну імунну відповідь, спричинену хіміотерапією або комбінованою терапією хіміотерапія/ФДТ. Тим часом, після введення анти-PD-L1, як хіміотерапія на основі COS-BA/Ce6-, так і хіміотерапія/ФДТ призвели до потужного виробництва багатьох цитокінів, які відіграють ключову роль у регуляції цитотоксичних функцій ЦТЛ8, включаючи пухлину фактор некрозу-альфа (TNF-a) (рис. 8L) та інтерферон-гамма (IFN-g) (рис. 8M) у зразках сироватки мишей після 14 днів лікування, що додатково підтверджує наявність ефективних протипухлинних імунних відповідей. Крім того, не спостерігалося явних змін маси тіла в різних групах лікування (рис. 8N), що вказує на сприятливу біобезпеку цієї комбінованої хіміотерапії/ФДТ/імунотерапії. У сукупності ми виявили, що хоча анти-PD-L1 плюс НЧ COSBA/Ce6 зі світлом показали дещо вищий коефіцієнт інгібування пухлини (86.7%), ніж неопромінена група (76,5%) проти правої пухлини внаслідок впливу ФДТ (рис. 8B–D) не спостерігалося істотних відмінностей у терапевтичних ефектах на ліві пухлини за наявності (77,8%) або відсутності (78,4%) ФДТ (рис. 8E–G). Ми припускаємо, що такі можливі причини призводять до цього явища. По-перше, щодо механізму хіміотерапії або ФДТ, що посилює імунологічні ефекти блокади контрольних точок анти-PD-L1, накопичені дослідження показали, що ці методи лікування можуть спровокувати гостре запалення в області пухлини, тим самим збільшуючи представлення пухлинно-асоційованих антигенів T клітин, таким чином спонукаючи ракові клітини піддаватися ICD8,9. Пухлинні клітини, які проходять ICD, посилюють сигнали «з’їж мене» шляхом впливу кальретикуліну (CRT) на поверхні імуногенно вмираючих пухлинних клітин і сигнали «небезпеки» шляхом вивільнення блоку 1 високомобільної групи (HMGB1), сприяючи активації дендритних клітин для активації ЦТЛ, активність яких може бути посилена за допомогою анти-PD-L1, що призведе до значного покращення протипухлинної імунотерапії51.

Рисунок 8. Протипухлинний ефект хіміотерапії на основі COS-BA/Ce6 NPs/PDT плюс імунотерапія анти-PD-L1 блокадою контрольних точок. (A) Схематична ілюстрація хіміотерапії/PDT на основі CNP з анти-PD-L1 терапією. (BeD) (B) Профілі росту пухлини, (C) середня вага пухлини та (D) зображення вирізаних пухлин у типових мишей для первинних (праворуч) пухлин після різних процедур протягом 14 днів, як зазначено. (EeG) (E) Криві росту пухлини, (F) середня вага пухлини та (G) зображення вирізаних пухлин для неопромінених віддалених (зліва) пухлин після різних видів лікування, як зазначено. (H) Популяції CD8+ Т-клітин у правій пухлині та (J) відсоток інфільтрації CTL були кількісно виявлені за допомогою проточної цитометрії після 14 днів лікування. (I, K) Популяції CD8+ Т-клітин у лівих пухлинах на 14-й день кількісно визначали за допомогою проточної цитометрії (n Z 3). Секреція цитокінів у сироватці після 14 днів лікування, включаючи (L) IFN-g та (M) TNF-a, виміряна за допомогою аналізу ELISA (n Z 3). (N) Зміни маси тіла мишей під час різних процедур. *P < 0.05, **P < 0.01 і ***P < 0.001 показують значні відмінності.

По-друге, у цій роботі НЧ COS-BA/Ce6 можуть бути розподілені на лівій і правій пухлинах одночасно, як ліва хіміотерапія, так і права хіміотерапія/ФДТ мають величезний потенціал для індукування пухлинних клітин, які проходять ICD. Тим часом наночастиці COS-BA/Ce6 вводяться лише в одній дозі, імунотерапія в основному залежить від трьох доз анти-PD-L1, будь то хіміотерапія чи хіміотерапія/PDT, вони є лише праймерами. Терапевтичні відмінності в індукції пухлинних клітин ICD між індивідуальною хіміотерапією та комбінованою хіміотерапією/PDT лікуванням можуть бути не дуже помітними. Відсоток CD8 ® CTL на лівій (рис. 8I і K) і правій пухлинах (рис. 8H і J) також підтверджував наведені вище припущення; жодної суттєвої різниці в CD8 ® CTL не спостерігалося за наявності або відсутності ФДТ. Таким чином, НЧ COS-BA/Ce6 плюс анти-PD-L1 з опроміненням або без нього досягли подібної протипухлинної ефективності проти лівих пухлин. Більше того, оскільки клітини 4T1 експресують низькі рівні PD-L152, широко доведено, що одні анти-PD-L1 мають будь-який помітний імунотерапевтичний ефект на рак молочної залози 4T153,54. Незважаючи на те, що ефекти ICD, опосередковані НЧ COS-BA/Ce6, вимагають подальшого дослідження, представлені результати показали, що НЧ COS-BA/Ce6 досягають надзвичайно посилених імунних відповідей за допомогою анти-PD-L1. У сукупності здається, що НЧ COS-BA/Ce6 справді посилили імунотерапію раку анти-PD-L1, а не лише комбіновану терапію. Незважаючи на те, що анти-PD-L1 плюс НЧ COS-BA/Ce6 з лікуванням ФДТ або без нього не показали істотних відмінностей у терапевтичних ефектах, обидва вони продемонстрували явно підвищену протипухлинну ефективність порівняно з однією дозою НЧ COS-BA/Ce6. Тобто, навіть якщо без легкого лікування, після введення імунного ад’юванта antiPD-L1, імуногенність залишків пухлини після хіміотерапії COS-BA/Ce6 NPs може бути посилена, що призводить до чудових системних протипухлинних імунних відповідей, що призводить до ефективного пригнічення первинних або віддалених пухлин. Таким чином, повинна бути можлива ліквідація первинних і метастатичних пухлин під час клінічної протипухлинної імунотерапії з повторним лікуванням НЧ. Очевидно, що ці результати разом свідчать про високоефективні та синергетичні протипухлинні імунні відповіді, індуковані НЧ COS-BA/Ce6 у поєднанні з блокадою анти-PD-L1, з хіміотерапією окремо або в комбінації з хіміотерапією/ФДТ.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

4. Висновки

Підводячи підсумок, ми цілеспрямовано спроектували, синтезували та розробили біосумісні, біорозкладані, малотоксичні, але високоефективні та клінічно доступні трансформовані фотохіміотерапевтичні нанопроліки COS-BA/Ce6 NPs шляхом поєднання трьох багатофункціональних компонентів, самоорганізованих природних малих молекул бетулінової кислоти. (BA), водорозчинний COS і малотоксичний фотосенсибілізатор Ce6 для комбінованої хіміотерапії/ФДТ. Згодом він викликає високоефективні та синергетичні протипухлинні імунні відповіді в поєднанні з блокадою анти-PD-L1, або з хіміотерапією окремо, або в комбінації з хіміотерапією/ФДТ. Зокрема, ми показуємо, що молекулярне розташування порожнистої мережі може сприяти утворенню наночастинок зі структурою оболонки. Модифікації водорозчинного COS можуть значно посилити протиракову активність ліпофільних природних малих молекул шляхом створення амфіфільного проліку. Ми також показуємо, що отримані нанопрепарати продемонстрували численні сприятливі терапевтичні властивості, особливо розумну функцію «сплячки» з підступними ефектами хіміотерапії. У поєднанні з відмінною чутливістю до рН ці коасамблеї мають низьку токсичність і біологічну безпеку для нормальної тканини, але дуже токсичні для пухлинних тканин. Разом із покращеною генерацією 1 O2, хорошою здатністю до біологічного розкладання та біосумісністю, все це сприяло високоефективній, синергетичній та безпечній протипухлинній хіміотерапії/ФДТ/імунотерапії. Зокрема, індивідуальна хіміотерапія без лікування ФДТ може активувати системну протипухлинну імунну відповідь, відкриваючи привабливі можливості для клінічно синергічної протипухлинної хіміотерапії імунотерапії. Загалом ця робота дає багатообіцяюче розуміння для розробки природних багатофункціональних високобіологічно активних і малотоксичних наноімуностимуляторів для клінічної імунотерапії.

Список літератури

1. Sang W, Zhang Z, Dai YL, Chen XY. Останні досягнення в синергетичній комбінованій імунотерапії раку на основі наноматеріалів. Chem Soc Rev 2019; 48: 3771e810.

2. Li XY, Guo XM, Ling JB, Tang Z, Huang GN, He LZ та ін. Імунотерапія раку на основі наномедицини, розроблена шляхом перепрограмування асоційованих з пухлиною макрофагів. Нанорозмір 2021;13:4705e27.

3. Chao Y, Xu LG, Liang C, Feng LZ, Xu J, Dong ZL та ін. Комбінована місцева імуностимулююча радіоізотопна терапія та блокада системної імунної контрольної точки забезпечують потужну протипухлинну відповідь. Nat Biomed Eng 2018; 2: 611e21.

4. Wen YY, Chen X, Zhu XF, Gong YC, Yuan GL, Qin XY та ін. Інтегровані наночастинки фототермічної хіміотерапії з реакцією мікрооточення пухлини посилили індукцію імуногенної смерті клітин для ефективного лікування колоректального раку. ACS Appl Mater Interfaces 2019;11:43393e408.

5. Peng JR, Xiao Y, Yang Q, Liu QY, Chen Y, Shi K та ін. Внутрішньоклітинна агрегація пептидно-перепрограмованих наноагрегатів малих молекул покращує хіміотерапію раку та комбінаторну імунотерапію. Acta Pharm Sin B 2021; 11: 1069e82.

6. Song W, Kuang J, Li CX, Zhang MK, Zheng DW, Zeng X та ін. Посилена імунотерапія на основі фотодинамічної терапії для ерадикації як первинної, так і легеневої метастазної пухлини. ACS Nano 2018; 12: 1978e89.

7. Wang C, Xu LG, Liang C, Xiang J, Peng R, Liu Z. Імунологічні реакції, викликані фототермальною терапією вуглецевими нанотрубками в поєднанні з анти-CTLA-4 терапією для пригнічення метастазування раку. Adv Mater 2014; 26: 8154e62.

8. He CB, Duan XP, Guo NN, Chan C, Poon C, Weichselbaum RR та ін. Нанорозмірні координаційні полімери «ядро-оболонка» поєднують хіміотерапію та фотодинамічну терапію, щоб посилити імунотерапію блокади контрольних точок раку. Nat Commun 2016; 7: 12499.

9. Galluzzi L, Buque A, Kepp O, Zitvogel L, Kroemer G. Імуногенна клітинна смерть при раку та інфекційних захворюваннях. Nat Rev Immunol 2017; 17: 97e111.

10. Chiang CS, Lin YJ, Lee R, Lai YH, Cheng HW, Hsieh CH та ін. Поєднання магнітних наночастинок на основі фукоїдану та імуномодуляторів покращує імунотерапію, локалізовану на пухлинах. Nat Nanotechnol 2018; 13: 746e54.

11. Zheng XL, Ge JC, Wu JS, Liu WM, Guo L, Jia QY та ін. Біорозкладна нановезикула похідного гіпокретину як тераностік ближнього інфрачервоного випромінювання для подвійної фотоактивної візуалізації та терапії раку. Біоматеріали 2018; 185: 133e41.

12. Спайсер CD, Jumeaux C, Gupta B, Stevens MM. Кон’югати наночастинок пептиду та білка — універсальні платформи для біомедичних застосувань. Chem Soc Rev 2018; 47: 3574e620.

13. Mei YL, Wang RB, Jiang W, Bo Y, Zhang TF, Yu JL та ін. Останні досягнення в наноматеріалах для доставки нуклеїнової кислоти в імунотерапії раку. Biomater Sci 2019; 7: 2640e51.

14. Zheng YL, Ye JX, Li ZY, Chen HJ, Gao Y. Останні досягнення в сонофотодинамічній терапії раку: від розроблених нових сенсибілізаторів до стратегій підвищення ефективності на основі нанотехнологій. Acta Pharm Sin B 2021; 11: 2197e219.

15. Li SK, Zou QL, Li YX, Yuan CQ, Xing RR, Yan XH. Розумні супрамолекулярні фотодинамічні метало-нанопрепарати на основі пептидів, створені шляхом багатокомпонентної координаційної самозбірки. J Am Chem Soc 2018; 140:10794e802.

16. Zhi KK, Wang JC, Zhao HT, Yang X. Самоорганізований гель із натурального продукту з малими молекулами для доставки ліків: прорив у новому застосуванні натуральних продуктів з малими молекулами. Acta Pharm Sin B 2020; 10: 913e27.

17. Yang X, Ma C, Chen ZM, Liu J, Liu FY, Xie RB та ін. Наночастинки, зібрані з однієї невеликої молекули, забезпечують ефективну пероральну доставку ліків. Nano Res 2019;12:2468e76.

18. Zhi KK, Zhao HT, Yang X, Zhang H, Wang JC, Wang J та ін. Природні гелеобразователи і загальний спосіб їх отримання з організмів. Нанорозмір 2018;10:3639e43.

19. Cheng JJ, Fu SY, Qin Z, Han Y, Yang X. Самоорганізовані природні невеликі молекули дитерпенових кислот зі сприятливою протипухлинною активністю та біобезпекою для синергетично посиленої протипухлинної хіміотерапії. J Mater Chem B 2021; 9: 2674e87.

20. Wang JC, Zhao HT, Zhi KK, Yang X. Дослідження природного активного маломолекулярного процесу завантаження ліків і високоефективної синергічної протипухлинної ефективності. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:6827e39.

21. Cheng JJ, Zhao HT, Yao L, Li Y, Qi BK, Wang J та ін. Прості та багатофункціональні природні самоорганізовані стероли з супрамолекулярними фотосенсибілізаторами, опосередкованими протипухлинною активністю, для посиленої протипухлинної фотодинамічної терапії. ACS Appl Mater Interfaces 2019; 11: 29498e511.

22. Cheng JJ, Zhao HT, Wang JC, Han Y, Yang X. Біоактивна природна невелика молекула, налаштована коассемблінг фоточутливих препаратів для високоефективної синергічної та посиленої фотохіміотерапії типу I. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:43488e500.

23. Wang JC, Zhao HT, Qiao WS, Cheng JJ, Han Y, Yang X. Nanomedicine-cum-carrier by co-assembly of natural small products for synergistic enhanced antitumor with захисних дій для тканин. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:42537e50.

24. Xi JC, Лю HP. Останні досягнення в розробці амфіфільних препаратів і вакцин із самодоставкою. Adv Ther 2019; 3: 1900107.

25. Чжан Р. С., Цинь Х. Ф., Конг Ф. Д., Чень П. В., Пан Г. Дж. Поліпшення клітинного поглинання терапевтичних речовин шляхом взаємодії з компонентами клітинної мембрани. Drug Deliv 2019; 26: 328e42.

26 Pujals S, Giralt E. Багаті проліном амфіпатичні клітинні пептиди. Adv Drug Deliv Rev 2008; 60: 473e84.

27. Karimi M, Ghasemi A, Sahandi Zangabad P, Rahighi R, Moosavi Basri SM, Mirshekari H, et al. Розумні мікро/наночастинки в системах доставки ліків/генів, що реагують на стимули. Chem Soc Rev 2016; 45: 1457e501.

28. Cheng JJ, Li XY, Wang S, Han Y, Zhao HT, Yang X. Тритерпенові проліки без носія з відповіддю на глутатіон і біобезпекою для синергетично посиленої фотохіміотерапії. ACS Appl Mater Interfaces 2021;13:245e56.

29. Li XS, Lee SY, Yoon J. Супрамолекулярні фотосенсибілізатори омолоджують фотодинамічну терапію. Chem Soc Rev 2018; 47: 1174e88.

30. Zou P, Yuan SJ, Yang X, Guo YZ, Li LN, Xu CW та ін. Структурна характеристика та протипухлинна дія олігосахаридів хітозану проти ортотопічної пухлини печінки через сигнальний шлях NF-kB. J Funct Foods 2019; 57: 157e65.

31. Zhai XC, Yuan SJ, Yang X, Zou P, Li NL, Li GY та ін. Олігосахариди хітозану індукують апоптоз у карциномі нирок людини через залежний від реактивного кисню стрес ендоплазматичного ретикулуму. J Agric Food Chem 2019; 67: 1691e701.

32. Deng G, Ma C, Zhao HT, Zhang SQ, Liu J, Liu FY та ін. Комбінована протинабрякова та антиоксидантна терапія ішемічного інсульту за допомогою наночастинок бетулінової кислоти, завантажених глібуридом. Theranostics 2019; 9: 6991e7002.

33. Лю К, Сін Р.Р., Цзоу К.Л., Ма Г.Х., Мовальд Х., Янь Х.Х. Проста самоскладання фотосенсибілізаторів, налаштованих на пептиди, для протипухлинної фотодинамічної терапії. Angew Chem Int Ed Engl 2016; 55: 3036e9.

34. Li Y, Lin JY, Wang PY, Luo Q, Lin HR, Zhang Y та ін. Нанопрепарат, що реагує на мікрооточення пухлини, що реагує на зміну форми самонацілюваного вірусу, для фототермічної хіміотерапії в ближньому інфрачервоному діапазоні II з контролем візуалізації. ACS Nano 2019;13:12912e28.

35. Sawada SI, Sato YT, Kawasaki R, Yasuoka JI, Mizuta R, Sasaki Y, et al. Гібридна збірка наногелів для внутрішньоклітинної доставки екзосом: вплив на ендоцитоз і злиття за допомогою полімерної інженерії поверхні екзосом. Biomater Sci 2020; 8: 619e30.

36. Чоу Т.Ц. Теоретичні основи, дизайн експерименту та комп’ютеризоване моделювання синергізму та антагонізму в дослідженнях комбінації лікарських засобів. Pharmacol Rev 2006; 58: 621e81.

37. Zhao YP, Zhao YN, Ma QS, Sun B, Wang QP, Ding Z та ін. Подвійні функціональні нанострижні без носіїв завдяки самозбірці чистих молекул ліків для синергічної хіміо-фотодинамічної терапії. Int J Nanomed 2019; 14: 8665e83.

38. Ma X, Zhao YL. Біомедичне застосування супрамолекулярних систем на основі взаємодії господар-гість. Chem Rev 2015; 115: 7794e839.

39. Qin XH, Zhang MZ, Hu X, Du Q, Zhao ZP, Jiang Y та ін. Наноінженерія нещодавно розробленого похідного хлорину e6 для посиленої фотодинамічної терапії шляхом регулювання метаболізму лактату. Нанорозмір 2021;13:11953e62.

40. Du Q, Qin XH, Zhang MZ, Zhao ZP, Li Q, Ren XM та ін. Нанопрепарат, що регулює мітохондріальний метаболізм і не містить носія, для посилення чутливості фототермічної терапії. Chem Commun (Camb) 2021; 57: 8993e6.

41. Li XS, Yu S, Lee D, Kim G, Lee B, Cho Y та ін. Простий супрамолекулярний підхід до активованої нанотераностики, керованої нуклеїновими кислотами, який долає недоліки фотодинамічної терапії. ACS Nano 2018; 12:681e8.

2. Gilson RC, Black KC, Lane DD, Achilefu S. Hybrid TiO2-ruthenium nano-photosensibilizer синергічно виробляє активні форми кисню як у гіпоксичних, так і в нормоксичних умовах. Angew Chem Int Ed Engl 2017; 56: 10717e20.

43. Xu SD, Yuan YY, Cai XL, Zhang CJ, Hu F, Liang J та ін. Налаштування синглет-триплетного енергетичного проміжку: унікальний підхід до ефективних фотосенсибілізаторів із характеристиками випромінювання, викликаного агрегацією (AIE). Chem Sci 2015; 6: 5824e30.

44. Wu WB, Mao D, Xu SD, Kenry, Hu F, Li XQ та ін. Полімеризація підсилює фотосенсибілізацію. Chem 2018; 4: 1937e51.

45. Kundu PK, Samanta D, Leizrowice R, Margulis B, Zhao H, Bo¨rner M, et al. Контрольована світлом самозбірка нефоточутливих наночастинок. Nat Chem 2015; 7: 646e52.

46. ​​Міядзакі М, Юба Е, Хаяші Х, Харада А, Коно К. РН-чутливі полімер-модифіковані ліпосоми на основі гіалуронової кислоти для клітинно-специфічних внутрішньоклітинних систем доставки ліків. Bioconjug Chem 2018; 29: 44e55.

47. Zhang JY, Liu ZN, Lian P, Qian J, Li XW, Wang L та ін. Селективна візуалізація та загибель ракових клітин за допомогою флуоресценції ближнього інфрачервоного діапазону з можливістю перемикання pH і фототермічних ефектів. Chem Sci 2016; 7: 5995e6005.

48. Cheng JJ, Tan GH, Li WT, Zhang HY, Wu XD, Wang ZQ та ін. Легкий синтез багатофункціональних магнітних Fe3O4@ SiO2@CS@pyropheophorbide-a флуоресцентних наночастинок для фотодинамічної терапії за допомогою хітозану. Новий J Chem 2016; 40: 8522e34.

49. Cheng JJ, Wang S, Zhao HT, Liu Y, Yang X. Дослідження механізму самоскладання та ефективної синергічної протипухлинної хіміофототерапії фоточутливого нанопрепарату, що опосередковується біологічно розкладаним і чутливим до глутатіону проліком урсолової кислоти. Biomater Sci 2021; 9: 3762e75.

50. Yang Y, Xu J, Sun Y, Mo LT, Liu B, Pan XS та ін. Логічна обчислювальна реакція на основі аптамерів на живих клітинах для забезпечення терапії імунної блокади контрольних точок без антитіл. J Am Chem Soc 2021; 143: 8391e401.

51. Kuai R, Yuan WM, Son SJ, Nam J, Xu Y, Fan YC та ін. Усунення наявних пухлин за допомогою комбінованої хіміоімунотерапії на основі нанодисків. Sci Adv 2018; 4: eaao1736.

52. Lesniak WG, Chatterjee S, Gabrielson M, Lisok A, Wharram B, Pomper MG та ін. Виявлення PD-L1 в пухлинах за допомогою [(64)Cu]атезолізумабу з ПЕТ. Bioconjug Chem 2016; 27: 2103e10.

53. Sagiv-Barfi I, Kohrt HEK, Czerwinski DK, Ng PP, Chang BY, Levy R. Терапевтичний протипухлинний імунітет шляхом блокади контрольних точок посилюється ібрутинібом, інгібітором як BTK, так і ITK. Proc Natl Acad Sci USA 2015;112:E966e72.

54. Liang C, Chao Y, Yi X, Xu J, Feng LZ, Zhao Q та ін. Внутрішня радіоізотопна терапія, опосередкована наночастинками, для локального підвищення проникності судинної мережі пухлини для синергетично покращеної терапії раку. Біоматеріали 2019; 197: 368e79.