Бета-глюкан посилює імунну відповідь на вакцину проти хвороби Ньюкасла та змінює експресію МРНК селезінки у курей

АНОТАЦІЯ

Це дослідження було проведено для вивчення впливу перорального введення b-глюкану (G70), продукту, отриманого з клітинної стінки дріжджів, на титри специфічного інгібування гемаглютинації (HI), проліферацію лімфоцитів і вірус Ньюкаслської хвороби (NDV). роль субпопуляцій Т-лімфоцитів у курчат, які отримували живу вакцину проти NDV. Крім того, вплив b-глюкану на експресію генів селезінки досліджували за допомогою секвенування транскриптомів. Результати показали, що додавання b-глюкану підвищувало титр сироваткового NDV HI, збільшувало індекс стимуляції NDV лімфоцитів у периферичній крові та кишковому тракті та сприяло диференціюванню Т-лімфоцитів у CD4+ Т-клітини. Аналіз секвенування РНК (RNA-seq) продемонстрував, що G70 посилює експресію мРНК, пов’язану з G-білковим рецептором і поліпептидом МНС класу I, і знижує експресію мРНК, пов’язану з кателіцидином і бетадефензином. Імуномодулюючий ефект G70 може функціонувати через сигнальний шлях протеїнкінази, що активується мітогеном. Підводячи підсумок, G70 може підвищити імунологічну ефективність живої вакцини проти NDV у курей і може застосовуватися як потенційний ад’ювант у птахівництві.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Ключові слова: вакцина проти ньюкаслської хвороби, бета-глюкан, ад’ювант, курка з чорною кісткою, РНК-сек.

ВСТУП

Полісахариди клітинної стінки дріжджів отримують безпосередньо з клітинної стінки Saccharomyces cerevisiae і широко використовуються як стимулятори росту, протимікробні агенти або імуномодулятори у домашньої птиці для покращення продуктивності та здоров’я (Schiavone та ін., 2017; Хастед та ін., 2021). Раніше було продемонстровано, що продукт під назвою PW220, який містить полісахариди клітинної стінки дріжджів, посилює імунну відповідь, спровоковану вірусом хвороби Ньюкасла (NDV), і змінює мікробне співтовариство сліпої кишки курей при пероральному введенні (Bi et al., 2020). ). Полісахариди клітинної стінки дріжджів в основному складаються з b-глюкану та маннанолігосахаридів (Wang et al., 2018). У цьому дослідженні було досліджено вплив b-глюкану на імунну відповідь на вакцину NDV у курей. Селезінка є ключовим органом для ініціації імунної відповіді. Нещодавнє дослідження показало, що PW220, який є продуктом клітинної стінки дріжджів, підвищує експресію мРНК TGF-b, IL-6, TLR5, GATA-3 і T-bet у селезінці курей ( Бі та ін., 2022). Проте конкретний механізм потрібно з’ясувати. Секвенування РНК (RNA-seq) є однією з високопродуктивних технологій, яку можна застосувати для аналізу кількісної експресії генів і забезпечити аналіз різних профілів експресії на рівні всього транскриптому (Zhao et al., 2018). Завдяки високій чутливості та низькій вартості RNA-seq широко використовується в дослідженнях худоби та птиці (Teixeira et al., 2019; Yuan et al., 2020). Таким чином, у цьому дослідженні було оцінено вплив введення b-глюкану на титри специфічного пригнічення гемаглютинації (HI), проліферацію лімфоцитів і субпопуляції Т-лімфоцитів у курчат, які перорально вакциновані вакциною проти NDV. Крім того, аналіз транскриптомів використовувався для оцінки впливу b-глюкану на експресію генів і основні шляхи передачі сигналу в селезінці курей.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Натисніть тут, щоб переглянути продукти Cistanche Enhance Imunity

【Запитуйте більше】 Електронна пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Тварини

Одноденні комерційні чорнокісткові курчата (самці) були придбані у Guizhou Yushun Poultry Co., Ltd. (Аньшунь, Китай). Курчат розділили на дротяні клітки, що забезпечували вільний доступ до корму та води. У перші 7 днів кімнатну температуру підтримували на рівні від 33 градусів C до 35 градусів Cand, потім поступово знижували на 1 градус C кожні 2 дні до 27 градусів C. Усіх курей обробляли за стандартами, встановленими Центром догляду за тваринами Південно-Західного університету та Комітет з використання (Номер сертифіката етики: IAC-2021-0057). Наприкінці дослідження всі піддослідні птахи були піддані евтаназії CO2.

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

Вакцина

Жива вакцина NDV (штам La Sota) була надана Qingdao YEBIO Bioengineering Co., Ltd. (Ціндао, Китай).

Реагенти 

Продукт дріжджової клітинної стінки (YP) G70 був отриманий із дріжджової клітинної стінки (Saccharomyces cerevisiae), яка містить b-глюкан (більше або дорівнює 70%) (AngelG70, QB/T4572, Angel Yeast, Yichang, China). Як антиген, так і сироватка позитивного контролю для вимірювання NDV-специфічних титрів HI були придбані в Qingdao Regen Diagnostics Development Center (Циндао, Китай). Anti-chicken CD3-APC (C2818-T9580), CD4-FITC (D0117-WA78E) і CD8- PE (L{{14) }}TH49T) у щурів були запропоновані Nanjing Zeweil Biological Technology Co., Ltd. (Нанкін, Китай).

Експериментальний дизайн

Сорок вісім чорнокістних курчат у віці 5 днів були випадковим чином розподілені на 3 групи (таблиця 1) і отримували або основну дієту (таблиця 2), або основну дієту з 0.1% G7{{10} } (b-глюкан, 0,7 г/кг) протягом цього дослідження. Групи H (вакцина G70 +) і C (вакцина) були перорально імунізовані вакциною NDV на 14 і 28 день відповідно. Групу S (Sailne) лікували рівним об’ємом фізіологічного розчину. Зразки крові збирали за допомогою венепункції крила у віці 5, 7, 14, 21, 28, 35 і 42 днів для перевірки титру HI. Через сім днів після бустерної вакцинації 8 курей у кожній колонці було випадковим чином відібрано та умертвлено шляхом асфіксії за допомогою CO2. Лімфоцити відокремлювали як від периферичної крові, так і від порожньої кишки для проведення аналізу проліферації лімфоцитів і проточної цитометрії. У випадку взяття зразків порожньої кишки підвішуюча зв’язка дванадцятипалої кишки була початковою точкою порожньої кишки, а зріз довжиною 5 см збирали з початку порожньої кишки. Селезінку швидко заморожували в рідкому азоті, а потім зберігали при -80° для RT-qPCR і профілювання послідовності.

Таблиця 1. План експерименту

Таблиця 2. 1 Склад і поживність базових раціонів експериментальних бройлерів.

HI дослідження

Аналіз NDV-специфічних титрів HI у сироватці проводили відповідно до попереднього опису (Ball et al., 2019). Коротше кажучи, сироватку розбавляли фосфатно-сольовим буфером (PBS) від 1:2 до 1:1024 у V-подібному 96-планшеті для мікротитрування. Потім додавали 25 мл розведення NDV на лунку та інкубували при 37 градусах протягом 30 хвилин. Після цього в кожну лунку додавали по 25 мл 1% суспензії еритроцитів півня та інкубували при 37° протягом 30 хв. Усі зразки перевіряли двічі, і на кожній чашці містили як позитивні, так і негативні контролі. Титри HI базувалися на найбільшому розведенні, яке призвело до повного пригнічення гемаглютинації. Середній титр HI і стандартну помилку (SE) вимірювали для кожної групи.

Виділення лімфоцитів з периферичної крові

Лімфоцити виділяли та збирали з лімфоцитів периферичної крові за допомогою набору середовища для розділення лімфоцитів (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd., Тяньцзінь, Китай). Потім лімфоцити зберігали в суспензії з середовищем RPMI 1640 (Solarbio, Пекін, Китай), що включає 5% фетальної телячої сироватки та 25 мМ HEPES (pH 7,0).

Виділення лімфоцитів з тонкої кишки

Процес розподілу проводився відповідно до попереднього опису та з невеликими змінами (Yuan et al., 2020). Коротше кажучи, використовуйте клітинний фільтр діаметром 70 мм, щоб розділити кишку на 4 мл холодного PBS. Після цього суспензію зразків клітин центрифугували при 4500 об/хв протягом 12 хв з видаленням супернатанту. Потім ресуспендуйте кишкові клітини на повному середовищі (Solarbio Co., Пекін, Китай), що складається з 5% фетальної бичачої сироватки (FBS) у RPMI 1640 (Sijiqing Co., Ханчжоу, Китай). Зрештою, набір для виділення курячих лімфоцитів (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.) для відділення лімфоцитів. кишкову тканину розділяли на 4 мл холодного PBS за допомогою клітинного фільтра 70 мм. Далі суспензію зразків клітин центрифугували при 4500 об/хв протягом 12 хв і супернатант відкидали. Після цього кишкові клітини ресуспендували в RPMI 1640 (Solarbio Co.), що містить 5% FBS (Sijiqing Co.). Нарешті, лімфоцити були розділені за допомогою набору для виділення курячих лімфоцитів (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.).

Проліферація лімфоцитів 

Клітини висівали в 96-лункові планшети (5£105 на лунку), стимульовані антигеном інактивованого NDV для 4 одиниць гемаглютинації або рівного об’єму фізіологічного розчину. Кожен зразок тестували в 3 повторах. Клітини та антиген інкубували протягом 44 годин при 37 градусах у 5% CO2, а потім до кожної лунки додавали 50 мл метилтіазолілтетразолію (МТТ) (2 мг/мл) та інкубували ще 4 години. Зразки центрифугували при 1200 £ g протягом 8 хвилин при кімнатній температурі. Після цього надосадову рідину обережно видаляли і в кожну лунку додавали 100 мл ДМСО. Планшети струшували протягом 8 хвилин для повного розчинення кристалів. Нарешті, середню оптичну щільність (ОП) реєстрували при 570 нм. Індекс стимуляції (SI) був отриманий за допомогою рівняння: значення OD стимульованих лунок / значення OD нестимульованих лунок (Cui et al., 2020).

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

Аналіз субпопуляцій Т-лімфоцитів методом проточної цитометрії

Суспензії лімфоїдних клітин виділяли і двічі промивали PBS. Концентрацію клітин модифікували до 106/мл і потім зберігали на льоду. Кожен зразок фарбували 2 мл щурячого анти-курячого CD3-APC, CD4- FITC і щурячого анти-курячого CD8-PE у світлонепроникних умовах протягом 30 хв, а потім 2 промиваннями PBS. Клітини аналізували методом проточної цитометрії на проточному цитометрі (BD Bioscience, Сан-Хосе, Каліфорнія).

Аналіз RT-qPCR

Загальну РНК отримували із селезінки за допомогою реагенту TRIzol (Takara, Shiga, Японія) відповідно до вказівок виробника, а потім перетворювали на кДНК за допомогою PrimeScript RT Master Mix (Takara, Далянь, Китай) на термоциклері T100 (Bio-Rad, Геркулес, Каліфорнія). Як ген внутрішнього контролю використовувався курячий бета-актин. RT-qPCR вибраних генів проводили на системі Multiple Real-Time PCR System (AB, Carlsbad, CA) з SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). Відносний кількісний метод (244CT) був виконаний для оцінки кількісної варіації (Bi et al., 2022). Послідовності праймерів наведено в таблиці 3.

Екстракція РНК

Кожен із 3 зразків селезінки з групи H (G70 +вакцина) і групи C (вакцина) використовували для РНК-секвенування з реагентом TRIzol (Takara). Після цього РНК перевіряли на забруднення та деградацію за допомогою 1% агарозного гелю, а чистоту РНК аналізували за допомогою спектрофотометра NanoPhotometer (IMPLEN, Westlake Village, CA). Концентрацію РНК визначали за допомогою набору Qubit RNA Assay Kit у Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies, Карлсбад, Каліфорнія). Цілісність РНК вимірювали за допомогою набору RNA Nano 6000 Assay Kit системи Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія). Результати показали, що РНК була повною і без забруднення ДНК.

Аналіз транскриптомів

Секвенування транскриптомів, збирання послідовностей та аналіз даних були надані компанією Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd. (Пекін, Китай). Основні процедури для транскриптому були перераховані наступним чином: 1) Очищення мРНК від сумарної РНК проводили за допомогою полі-Т-олігоприєднаних магнітних кульок. Фрагментацію проводили двовалентними катіонами в реакційному буфері NEB Next First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) при високій температурі. 2) Перший ланцюг кДНК синтезували з використанням випадкового гексамерного праймера та реверсу Moloney Murine Leukemia Virus (M-MuLV). Потім був синтезований другий ланцюг кДНК з використанням ДНК-полімерази I та РНКази H. 3) Залишки виступів були перетворені в тупі кінці за допомогою активності екзонуклеази/полімерази. Потім структуру шпилькової петлі NEB Next Adapter лігували для підготовки до гібридизації після аденілювання 3'-кінця фрагментів ДНК. 4) Було отримано приблизно від 250 до 300 bp фрагментів кДНК і бібліотеку очистили за допомогою системи AMPure XP Beckman Coulter (Beckman Coulter, Beverly, MA). Потім 3 мл ферменту NEBU SER (Thermo Fisher, Hillsboro, OR) наносили на відібрану за розміром кДНК, ліговану з адаптером, при 37°C протягом 15 хвилин, а потім 5 хвилин при 95°C. ПЛР-ампліфікацію проводили за допомогою ДНК-полімерази Phusion High-Fidelity. Зрештою, продукти ПЛР очищали (система AMPure XP), а якість бібліотеки оцінювали за допомогою системи Agilent Bioanalyzer 2100. Кластеризація закодованих індексом зразків була виконана на TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumina, San Diego, CA). Потім секвенування було виконано на платформі Illumina Novaseq і згенеровано зчитування парних кінців 150 bp. Файли анотації еталонного геному та генної моделі було завантажено з веб-сайту геному (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release- 98/fasta/gallus_gallus/ та ftp://ftp. ensembl.org/pub/re-lease-98/gtf/gallus_gallus/). Індекс еталонного геному був встановлений за допомогою HISAT2 (v2.0.5), а парні чисті зчитування були узгоджені з еталонним геномом. Кількість зчитувань, зіставлених з кожним геном, і фрагментів на кілобаз на мільйон (FPKM) для кожного гена на основі довжини гена та кількості зчитувань, зіставлених з геном, були розраховані за допомогою Feature Counts v1.5.{{38} }p3. Диференціальне вираження між групою H (вакцина G70 +) і групою C (вакцина) було отримано за допомогою пакета DESeq2 R (1.16.1). Гени з P < 0,05 і |log2 (кратна зміна)| > 1 були визначені як гени диференціальної експресії (DEG).

Таблиця 3. Послідовності праймерів для RT-qPCR.

Кількісна ПЛР перевірка в реальному часі 

Для підтвердження результатів секвенування транскриптомів за допомогою RT-qPCR було вибрано два DEG з підвищеною регуляцією та 4 DEG зі зниженою регуляцією під час порівняння групи H (вакцина G70 +) проти групи C (вакцина). РНК перетворювали на кДНК за допомогою PrimeScript RT Master Mix (Takara) на термоциклері T100 (Bio-Rad). Послідовності праймерів наведені в таблиці 3. Як ген внутрішнього контролю використовували курячий b-актин. RT-qPCR вибраних генів проводили на множинній системі ПЛР у реальному часі (Applied Biosystems, Карлсбад, Каліфорнія) з SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). Відносний кількісний метод (244CT) був застосований для оцінки варіації кількісного визначення. Усі зразки проводили в трьох повторах для аналізу.

Статистичний аналіз

Однофакторний дисперсійний аналіз із тестом Duncan post hoc використовувався для численних порівнянь між групами за допомогою програмного забезпечення SPSS (версія 21.0, SPSS Inc., Чикаго, Іллінойс). Дані виражені як середнє § SE. Значення P < 0.05 вважалося статистично значущим.

РЕЗУЛЬТАТИ Вплив b-глюкану на титри сироваткових антитіл

Як показано на малюнку 1, титри HI, специфічні для NDV, знизилися в усіх групах до вакцинації та зросли в групах H (G70+вакцина) і C (вакцина) після імунізації. Цікаво, що вищі титри HI спостерігалися в групі H (G70+вакцина) на 21 (P > 0.05), 28 (P < 0.{{ 14}}5), 35 (P > 0,05) і 42 (P > 0,05) д. віку, ніж у групі C (вакцина).

Вплив b-глюкану на проліферацію лімфоцитів

Вплив G70 на проліферацію лімфоцитів периферичної крові зображено на малюнку 2A. SI в лімфоцитах крові підвищувався у птахів, які отримували вакцину G70 (вакцина G70 +) через 7 днів (P <0,05) після повторної імунізації порівняно з групою вакцинації. Крім того, SI в лімфоцитах порожньої кишки значно збільшився через 7 днів (P < 0,05) після бустерної імунізації порівняно з групою вакцинації (рис. 2B).

Вплив b-глюкану на співвідношення CD4 + / CD8 + Т-клітин у периферичній крові 

На малюнках 3A та 3B показано лімфоцити та клітини CD{2}}, а на малюнках 3C–3E показано співвідношення CD4 + /CD8 + Т-клітин у G70, групи вакцини та фізіологічного розчину відповідно. Як показано на малюнку 3F, не було помітної різниці між групою вакцинації та групою фізіологічного розчину після повторної імунізації (P > 0.05), тоді як частка CD4 + /CD{{12} } Рівень Т-клітин був явно вищим у групі G70 (G70 + вакцина), ніж у групі вакцини (P <0,05).

Рисунок 1. Вплив перорального введення b-глюкану на титри сироваткових антитіл до вакцини проти NDV. Дані виражені як середнє § SE.

Споріднена експресія генів

Як показано на малюнку 4, значно збільшилася експресія мРНК TGF-b (P < 0.05), IL-6 (P < 0.{{13} }5), а TLR5 (P < 0.05) було виявлено в селезінці курей, які отримували G70 (вакцина G70 +), порівняно з групою вакцини. Не було виявлено істотної різниці в експресії мРНК IFN-g (P > 0,05), TLR4 (P > 0,05) і TLR3 (P > 0,05) у селезінці між G70 (G70 + вакциною) і вакциною групи.

Аналіз даних секвенування РНК 

Секвенування РНК з 8 бібліотек селезінки дало 24,1 г необроблених даних, як представлено в таблиці S1 додаткового матеріалу. CN означає вакцину групи, а HN означає вакцину групи G70 +. Бібліотека C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 і H4 відповідно складається з 45 591 492, 47 424 782, 46 193 492, 54 403 376, 47 118 476, 45 899 262, 45 841 884 і 45 504, 438 оригінальних читань. Після аптамеру було видалено неоднозначні послідовності та послідовності низької якості, залишивши 44 050 198, 45 449 884, 44 261 112, 52 097 846, 45 542 404, 44 566 290, 44 113 172 і 44 026 960 чистих зчитувань. Понад 96% чистих зчитувань були серед оригінальних зчитувань, а 8 бібліотек було зіставлено за допомогою HISAT2 для секвенування зчитувань із еталонною базою даних, що складається з геному Галлуса. Крім того, чисті зчитування були зіставлені з цією базою даних у понад 95% випадків. Для бібліотек C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 та H4 було 40 921 384 (92,9%), 41 302 100 (90,87%), 40 771 075 (92,11%), 46 905 784 (90,03%), 42 444 112 (93). .2 %), 40 213 444 (90,23 %), 40 922 895 (92,77 %) і 40 971 972 (93,06 %) зчитування були однозначно приписані до еталонної бази даних відповідно.

Диференційно експресовані гени

Як показано на малюнку 5A, було ідентифіковано загалом 198 диференціально експресованих генів, включаючи 47 генів з підвищеною регуляцією та 151 ген із зниженою регуляцією. DEG були детально описані в додатковому матеріалі, таблиці S2. Рисунок 5B показує, що DEG мають хорошу відтворюваність обробок.

Аналіз класифікації генної онтології та Кіотської енциклопедії генів і збагачення геномів

Гени, які є диференційовано експресованими генами, були класифіковані на 3 основні функціональні категорії на основі системи класифікації генної онтології (GO): біологічний процес, клітинний компонент і молекулярна функція. 10 найкращих термінів GO у 3 категоріях представлені на малюнку 6. Було переважання генів, залучених до «гуморальної імунної відповіді», «хемокінової відповіді», «відповіді на антимікробну гуморальну», «захисної реакції проти бактерії, » «імунна відповідь на антимікробну гумору, опосередковану протимікробними пептидами», «захисна відповідь проти грамнегативних бактерій» і «захисна відповідь проти грампозитивних бактерій» у категорії біологічних процесів. Крім того, у категорії молекулярної функції дивовижне співвідношення генів було пов’язане з «зв’язуванням хемокінового рецептора (CCR) з хемокіновим рецептором СС», «зв’язуванням хемокінового рецептора» та «зв’язуванням ліпополісахариду». Крім того, «мітохондріальний дихальний ланцюговий комплекс I», «НАДН-дегідрогеназний комплекс» і «дихальний ланцюг» були найбільш домінуючими збагаченими термінами в категорії клітинних компонентів. Кіотська енциклопедія генів і аналіз шляхів геномів також проводили на генах з диференціальною експресією. Результати свідчать про те, що гени в основному згруповані в 7 шляхів, включаючи «нейроактивну взаємодію ліганд-рецептор», «розривне з’єднання», «сигнальний шлях мітоген-активованої протеїнкінази (MAPK), «транспортери ABC», «біосинтез амінокислот» «Лікарський метаболізм», «Експорт білка».

Рисунок 2. Вплив перорального введення b-глюкану на індекс стимуляції лімфоцитів (SI). (А) Лімфоцити периферичної крові; (Б) лімфоцити кишечника. Дані виражені як середнє § SE.

Рисунок 3. Вплив перорального введення b-глюкану на співвідношення клітин CD4+/CD8+ периферичної крові. (A) Ворота лімфоцитів; (B) ворота на Т-клітинах CD3+; (C) частоти Т-клітин CD3+ CD4 + CD8 + у групі G70+вакцини; (D) частоти Т-клітин CD3+ CD4 + CD8 + у групі вакцини; (E) частоти Т-клітин CD3+ CD4 + CD8 + у групі фізіологічного розчину; (F) бардіаграма, що представляє співвідношення CD4+/CD8+. Дані виражені як середнє § SE.

Рисунок 4. Вплив перорального введення b-глюкану на експресію мРНК у селезінці курки. Дані виражені як середнє § SE.

Рисунок 5. Підсумок даних RNA-Seq. (A) Список диференціально експресованих генів, (B) карта кластеризації DEG.

Перевірка диференціально експресованих генів за допомогою RT-qPCR

6 DEG, які підвищували або знижували, були підтверджені кількісною ПЛР у реальному часі. Результат припустив, що дані RT-qPCR загалом відповідають даним RNA-seq загалом, що вказує на надійний результат секвенування (рис. 7). Експресія мРНК генів, асоційованих із шляхом MAPK. Як показано на малюнку 8, експресія мРНК FAS (P < 0.05) і CACNA2 (P < 0.05) була значно знижена. виявлено в селезінці курей у групі G70 (вакцина G70 +) у порівнянні з групою вакцини. Крім того, чисельно підвищена експресія мРНК DUSP5 і DUSP4 і чисельно знижена експресія мРНК p38, JNK і ERK була виявлена ​​в групі G70 (вакцина G70 +) порівняно з групою вакцини (P > 0,05). .

ДИСКУСІЯ

Жива вакцина проти НД широко запроваджена на птахофабриках, але все ще існують спорадичні спалахи хвороби Ньюкасла серед імунізованих стад птиці (Zhang et al., 2022). Визначено оптимальні вакцини для стимуляції клітинного та слизового імунітету, а також ефективного гуморального імунітету (Shan et al., 2019). Таким чином, все більше уваги приділялося ад’ювантам, які могли б надавати як слизову, так і клітинну імунну відповідь (Chen та ін., 2014; Ю та ін., 2015). Порівняно зі шляхом ін’єкції, пероральне введення є простішим підходом, який зменшує витрати та викликає менше стресу для курчат-бройлерів (Boyaka та ін., 2003; Zhang та ін., 2008). Результати цього дослідження показали, що дієта, доповнена b-глюканом, значно підвищила рівень специфічних для NDV титрів HI у сироватці крові курей, що узгоджується з попередніми звітами (Horst et al., 2019). NDV-специфічне антитіло має важливе значення для розвитку гуморальної імунної відповіді для захисту курчат від інфекції NDV (Martinez та ін., 2018; Li та ін., 2020). В-лімфоцити виробляють антитіла, а Т-лімфоцити розширюються у відповідь на мітоген (Bohacova et al., 2021). У цьому дослідженні індекс стимуляції лімфоцитів периферичної крові курчат до NDV групи G70 був очевидно вищим, ніж у групі вакцини, що вказує на активацію більшої кількості Т-лімфоцитів. Переважними субпопуляціями Т-лімфоцитів є CD4 + і CD8 + Т-клітини (Cui et al., 2020). CD4 + Т-клітини в основному виробляють цитокіни та сприяють дозріванню В-клітин, тоді як CD8 + Т-клітини пов’язані з уничтоженням цільових клітин (Zhang et al., 2021b). У цьому дослідженні співвідношення CD4 +/CD8 + Т-клітин, виявлених у групі G70, явно зростало, що свідчить про те, що G70 може активувати більше CD4 + Т-клітин із периферичної крові. Крім того, ми спостерігали значно вищий індекс стимуляції кишкових лімфоцитів у групі G70, ніж у групі вакцини, що підтвердило, що b-глюкан також може стимулювати кишкові лімфоцити. Наші попередні експерименти підтвердили, що екстракт клітинної стінки дріжджів PW220 значно збільшив кишково-специфічні клітини sIgA та IgA + (Bi et al., 2020). Тобто, як b-глюкан G70, так і PW220 ефективні у зміцненні імунітету слизової оболонки кишечника.

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

Раніше повідомлялося про підвищення імунітету тварин шляхом введення b-глюкану. Гуо та ін. (2003) підтвердили, що введення b-глюкану покращує індекс бурси та NDV-специфічних антитіл у курчат. Левін та ін. (2018) припустив, що додавання b-глюкану може посилити регуляцію кишкового MHC Ⅱ і збільшити кількість CD45 + клітин для полегшення пошкодження кишечника.

Лі та ін. (2005) виявили, що харчовий b-глюкан може підвищувати рівень експресії мРНК IL-8 і TGF-b у кишковому тракті свиней. Механізм імуномодулюючої дії b-глюкану не ясний. Кім та ін. (2010) показали, що b-глюкан сприяє дозріванню дендритних клітин шляхом посилення експресії CD40, CD80 і CD86. Крім того, Lee and Kim (2014) і Su et al. (2020) повідомили, що b-глюкан активує рецептори розпізнавання образів, такі як рецептор Dectin-1, Toll-подібний рецептор і CR3 (Baert et al., 2015). Селезінка є критично важливим органом для ініціювання імунної відповіді та відіграє важливу роль як у вродженому, так і в набутому імунітеті (Bronte and Pittet, 2013). Однак існує лише невелика кількість досліджень, заснованих на аналізі РНК-seq експресії мРНК у селезінці після перорального введення дріжджових полісахаридів. У цьому дослідженні аналіз шляхів Кіотської енциклопедії генів і геномів припустив, що ці гени в основному згруповані в 2 шляхи, включаючи «нейроактивну взаємодію ліганд-рецептор» і «сигнальний шлях MAPK». Рецептори для розпізнавання образів, націлені на b-глюкан, були збагачені на поверхні імунних клітин (Goodridge et al., 2009). Після розпізнавання b-глюкану ці рецептори стимулювали тирозинкіназу та ядерний фактор kappaB (NF-kappaB), що призводило до індукції прозапальної секреції цитокінів та активації імунних відповідей (Kankkunen та ін., 2010; Masuda та ін. ., 2012; Сю та ін., 2016; Боде та ін., 2019). MAPK, як сімейство серин-треонін протеїнкіназ, відіграє вирішальну роль у запаленні та виробленні цитокінів у курей. Бюн та ін. (2016) продемонстрували, що b-глюкан підвищує вироблення інтерферону-g та інтерлейкіну-2 та викликає значно вищі рівні фосфорилювання MAPK p38 у перитонеальних макрофагах. Wang та ін. (2014) повідомили, що b-глюкан послаблює запальні реакції в клітинах THP-1 шляхом інгібування активації p38 MAPK. У цьому дослідженні 13 DEG, включаючи DUSP4, CACNA2D1, PDGFD, PTPRR, ENSGALG00000006351, FAS, MAP2K3, MYC, DUSP5, MAX, SRF, PRKCB і EGFR, були ідентифіковані в сигнальному шляху MAPK, що свідчить про те, що b-глюкан може регулювати імунну відповідь селезінки через MAPK у курей. MAPK є консервативним класом Ser/Thr кіназ у клітинах, які в основному беруть участь у клітинних відповідях, таких як імунна відповідь, апоптоз і проліферація. Сімейство MAPK включає щонайменше 3 підродини: N-кінцеву кіназу c-Jun (JNK), p38 MAPK і позаклітинну сигнал-регульовану кіназу (ERK) (Hong та ін., 2020; Zhang та ін., 2021a). DUSP4 і DUSP5 є фосфатазами подвійної специфічності, які специфічно пригнічують активність членів сімейства MAPK, таких як p38, JNK і ERK, відіграючи важливу регуляторну роль у запобіганні надмірній запальній реакції та сприянні регресії запалення в організмі (Imasato et al. ., 2002; Talreja та ін., 2021). Крім того, повідомлялося, що мала некодуюча РНК під назвою gga-miR-200a-3p пригнічує експресію прозапальних факторів і, таким чином, регулює аутоімунну реакцію хазяїна, негативно регулюючи шлях MAPK і його сигнальні молекули (Pham et al., 2017). У цьому дослідженні аналіз RT-qPCR показав, що експресія мРНК P38, JNK і ERK зменшилася, а експресія мРНК DUSP4 і DUSP5 збільшилася у курей, яких годували b-глюканом (G70). Ці результати свідчать про те, що ефект посилення імунітету b-глюкану (G70) на вакцину проти хвороби Ньюкасла може бути пов’язаний з регуляцією негативного зворотного зв’язку прозапальних факторів, опосередкованих через MAPK. Крім того, FAS є важливою речовиною, яка опосередковує апоптоз і життєво важлива для імунного гомеостазу (Krueger et al., 2003; Guegan and Legembre, 2018). Тим часом CACNA2 є залежною від напруги субодиницею кальцієвого каналу, яка сприяє проліферації, міграції та інвазії клітин (Sun et al., 2020). У цьому дослідженні FAS і CACNA2 були значно знижені у курчат, яким додавали b-глюкан (G70), що вказує на те, що b-глюкан (G70) посилює імунітет, головним чином пригнічуючи апоптоз імунних клітин і врівноважуючи аутоімунітет. Ці висновки є теоретичною довідкою для використання b-глюкану (G70) як підсилювача імунітету в клінічних умовах. Однак механізм посилення b-глюканом імунної відповіді через ефект негативного зворотного зв’язку шляху MAPK потребує подальших доказів. Цікаво відзначити, що гени, що кодують кателіцидин, включаючи CATH3, CATH1, CATH2, і гени, що кодують b-дефензин, включаючи AvBD6, AvBD7, AvBD1 і AvBD4, були помітно знижені у порівнянні H (вакцина групи G70 +). порівняно з контролем (групова вакцина). Пептиди захисту хазяїна (HDP) — це ефекторні молекули, які відіграють вирішальну роль у вродженій імунній системі (Cuperus et al., 2013). Ці пептиди були виявлені у різних видів тварин, від ссавців до птахів. У курчат є 4 кателіцидини, які складаються з CATH1, CATH2, CATH3 і CATHB1, які ефективно вбивають різні бактерії (Hamad et al., 2017). Пташині бета-дефензини (AvBD), альтернативно названі gallinacean, є невеликими катіонними пептидами з 3 цистеїн-дисульфідними зв’язками між їхніми залишками цистеїну та виконують важливу роль у вродженій імунній системі (Yoshimura, 2015). Зменшення експресії кателіцидинів і бета-дефензину, можливо, пояснюється регуляцією зворотного зв’язку, коли бактеріальні та парабактеріальні популяції зменшуються полісахаридами клітинної стінки дріжджів (Bi et al., 2020). Подібні результати були виявлені в інших дослідженнях. Шао та ін. (2016) за допомогою кількісного ПЛР-аналізу в режимі реального часу показали, що додавання b-глюкану дріжджів у курчат-бройлерів пригнічує інфекцію Salmonella та знижує експресію HDP. У цьому дослідженні продукт G70, що в основному складається з b-глюкану, підвищив рівень специфічних проти NDV антитіл у сироватці крові, збільшив індекс стимуляції NDV лімфоцитів периферичної крові та кишкових лімфоцитів і сприяв диференціюванню Т-лімфоцитів периферичної крові в CD{{ 123}} Т-клітини. Крім того, аналіз RNA-seq показав, що G70 посилює експресію мРНК, пов’язану з рецептором серотоніну, пов’язаним з G-білком, і поліпептидом MHC класу I, і знижує експресію мРНК, пов’язану з кателіцидином і бета-дефензином. Враховуючи посилений вплив G70 на вакцину ND у курей, вплив G70 на інші вакцини для домашньої птиці, такі як вакцина проти пташиного грипу, можна додатково вивчити.

Рисунок 6. Аналіз шляху KEGG.

Рисунок 7. Підтвердження RT-qPCR вибраних кандидатів на DEG. Дані виражені як середнє § SE.

Рисунок 8. Відносна експресія мРНК у селезінці. Загальну РНК екстрагували з селезінки. Курячий b-актин служив геном внутрішнього контролю. Дані виражені як середнє § SE.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

Берт, К., Е. Сонк, Б. М. Годдіріс, Б. Девріендт і Е. Кокс. 2015. Специфічні відмінності клітинного типу в розпізнаванні та передачі сигналів у клітинах вродженого імунітету свиней. Dev. комп. Immunol. 48: 192-203.

Болл К., А. Форрестер, А. Херрманн, С. Лем’єр і К. Ганапаті. 2019. Порівняльний захисний імунітет, що забезпечується живими вакцинами проти вірусу хвороби Ньюкасла або метапневмовірусу птахів при спільному введенні разом із класичними та варіантними штамами вірусу інфекційного бронхіту у добових курчат-бройлерів. Вакцина. 37: 7566-7575.

Bi, S., J. Zhang, Y. Qu, B. Zhou, X. He та J. Ni. 2020. Продукт клітинної стінки дріжджів підсилив реакцію кишкового IgA та змінив види мікрофлори сліпої кишки після пероральної вакцинації у курей. птиця. Sci. 99:6576-6585.

Бі, С., Дж. Чжан, Л. Чжан, К. Хуан, Дж. Лі та Л. Цао. 2022. Клітинна стінка дріжджів активізувала клітинно-опосередковану імунну відповідь на вакцину проти вірусу хвороби Ньюкасла. птиця. Sci. 101: 101712–101721.

Боде, К., Ф. Буджупі, К. Лінк, Т. Хайн, С. Циммерманн, Д. Пейріс, В. Жаке, Б. Лепеніс, Х. Вейд і П. Х. Краммер. 2019. Дектин-1, що зв’язується з анексинами на апоптичних клітинах, індукує периферичну імунну толерантність через НАДФН-оксидазу-2. Стільниковий. Відповідь 29:4435–4446.

Богацова П., Я. Коссл, М. Гайкова, Б. Германкова, В. Голан та Е. Яворкова. 2021. Різниця між стимульованими мітогеном В- і Т-клітинами в неспецифічному зв’язуванні антитіл, кон’югованих з R-фікоеритрином. J. Immunol. методи. 493: 113013-113023.

Бояка, П. Н., А. Тафаро, Р. Фішер, К. Фуджіхаші, Е. Джірілло та Дж. Р. МакГі. 2003. Терапевтична маніпуляція імунною системою: посилення вродженого та адаптованого імунітету слизової оболонки. Curr. Pharm. Дизайн. 9:1965–1972.

Бронте В. та М. Дж. Піттет. 2013. Селезінка в місцевій та системній регуляції імунітету. Імунітет. 39:806-818.

Бюн Е., С. Парк, Б. Джанг, Н. Сунг та Е. Бюн. 2016. Гамма-опромінений b-глюкан індукує імуномодуляцію та протипухлинну активність через шляхи MAPK та NF-kB. J. Sci. харчування. агр. 96:695-702.

Чень, X., X. Чень, С. Цю, Ю. Ху, Ч. Цзян, Д. Ван, К. Фан, Ч. Чжан, Ю. Хуан, Ю. Ю, Х. Ян, Ч. Лю, З Гао, Р. Хоу та X. Лі. 2014. Вплив епімедіум полісахарид-прополіс флавон пероральної рідини на імунітет слизової оболонки у курчат. Міжн. J. Biol. Macromol. 64:6–10.

Цуй, X., Y. Wang, R. Guan, M. Lu, L. Yuan, W. Xu та S. Hu. 2020. Посилення імунної відповіді за допомогою протеомного аналізу сироватки овець hu на вакцину проти ящуру, емульговану в ад’юванті рослинної олії. Вакцини. 8:180–197

Куперус, Т., М. Кооренс, А. ван Дейк і Х. П. Хаагсман. 2013. Пептиди захисту пташиного господаря. Dev. комп. Immunol. 41:352-369.

Гудрідж, Г. С., А. Дж. Вулф і Д. М. Андерхілл. 2009. Розпізнавання бета-глюкану вродженою імунною системою. Immunol. Одкр. 230:38–50.

Guegan, J. і P. Legembre. 2018. Ненапоптотичні функції Fas/CD95 в імунній відповіді. FEBS J 285:809–827.

Го, Ю., Р. А. Алі та М. А. Куреші. 2003. Вплив бета-глюкану на імунну відповідь у курчат-бройлерів. Імунофарм. Immunol. 25:461–472.

Хамад, С.К., С. Кім, С.В. Ель-Каді, Е.А. Вонг і Р.А. Даллул. 2017. Порівняльна експресія захисних пептидів господаря в індичат. птиця. Sci. 96:2083-2090.

Хастед, Т., С. Шаріф, П. Бурлін і М. С. Діарра. 2021. Імуностимулюючий потенціал фруктів та їх екстрактів у птиці. Фронт. Immunol. 12: 641696.

Хонг, Ю., Дж. Лі, Т. Х. Ву, С. Лі, Х. С. Ліллехой та Ю. Х. Хонг. 2020. Курячий пташиний b-дефензин 8 модулює імунну відповідь за допомогою сигнальних шляхів протеїнкінази, що активується мітогеном, у лінії клітин курячих макрофагів. птиця. Sci. 99: 4174-4182.

Горст, Г., Р. Левін, Р. Чік і К. Хофакре. 2019. Вплив бета- 1,3-глюкану (AletaTM) на відповідь на вакцинацію у курчат-бройлерів. птиця. Sci. 98:1643-1647.

Imasato, A., C. Desbois-Mouthon, J. Han, H. Kai, ACB Cato, S. Akira та J. Li. 2002. Інгібування p38 MAPK глюкокортикоїдами через індукцію MAPK фосфатази-1 посилює індуковану впливом Haemophilus нетипову експресію toll-подібного рецептора 2. J. Biol. Chem. 277: 47444-47450.

Канккунен, П., Л. Тейріла, Дж. Рінтахака, Х. Аленіус, Х. Вольф і С. Матікайнен. 2010. (1,3)-бета-глюкани активують як дектин-1, так і NLRP3 запалення в макрофагах людини. J. Immunol. 184: 6335-6342.

Кім, Х.С., Дж.Й. Кім, Х.К. Лі, М.С. Кім, С.Р. Лі, Дж.С. Канг, Х.М. Кім, К. Лі, Дж.Т. Хонг, Ю. Кім та С. Хан. 2010. Активація дендритних клітин глюканом, виділеним з umbilicaria esculenta. Імунна. Netw. 10:188-197.

Крюгер А., С. К. Фас, С. Бауманн і П. Х. Краммер. 2003. Роль CD95 у регуляції апоптозу периферичних Т-клітин. Immunol. Об. 193:58–69.