Екстракт насіння Phoenix Dactylifera L. виявляє антиоксидантну дію та послаблює меланогенез

Хуей-Чун Хуан1 , Шр-Шіуань Ван2, Цан-Чі Цай3, Ван-Пінг Ко3 і Цон-Мін Чанг2,*

Анотація:Довідка: Механізм дії екстракту насіння Phoenix dactylifera в догляді за шкірою ніколи не досліджувався. Методи: Насіння P. dactylifera L. екстрагували ультразвуковою екстракцією. Антиоксидантні характеристики екстракту визначали 2,2-дифеніл-1-пікрилгідразил (DPPH) та 2,2′-азино-ді-(3-етилбензтіазолінсульфонова кислота) (ABTS plus ) аналізи та методи очищення. Були також досліджені загальний вміст фенолів, відновлювальна здатність, хелатування іонів заліза (II) і здатність поглинати внутрішньоклітинні активні форми кисню (АФК). Вплив екстракту насіння P. dactylifera L. на меланогенез оцінювали спектрофотометрично за допомогою аналізу активності тирозинази грибів, визначення активності внутрішньоклітинної тирозинази та вмісту меланіну. Рівні експресії білків, пов'язаних з меланогенезом, аналізували методом Вестерн-блот. Результати: Результати показали, що P.dactylifera L.Екстракт насіння виявляв очевидну антиоксидантну здатність і значно знижував внутрішньоклітинний вміст АФК у концентраціях {{0}}.245 і 0,49 (мг/мл). Крім того, екстракт зменшив експресію рецептора меланокортину 1 (MC1R), фактора транскрипції, пов’язаного з мікрофтальмією (MITF), тирозинази, білка, пов’язаного з тирозиназою-1 (TRP1), і білка, пов’язаного з тирозиназою-2 ( TRP2) і інгібував меланогенез у клітинах B16F10. Висновки. Наші результати показали, що екстракт насіння P. dactylifera L. послаблює меланогенез у клітинах B16F10 шляхом зниження регуляції сигнальних шляхів протеїнкінази A (PKA). Отже, екстракт можна використовувати як засіб для відбілювання шкіри в продуктах по догляду за шкірою.

Ключові слова: Phoenix dactylifera;тирозиназа; меланін; ROS; PKA

cistanche pharma specialє різновидом засобу для відбілювання шкіри.

1. Введення

Антиоксиданти широко застосовуються для запобігання або лікування розладів, пов’язаних з окислювальним стресом, у косметичній та дерматологічній сферах. Протягом останніх кількох десятиліть антиоксиданти також використовувалися в косметичній промисловості для запобігання або уповільнення старіння шкіри. Повідомляється, що вільні радикали та активні форми кисню (АФК) пов'язані з кількома захворюваннями, такими як старіння та захворювання, пов'язані з віком [1]. Цікаво, що вільні радикали на шкірі, спричинені стресом УФ-опромінення та АФК, відіграють важливу роль у процесі фотостаріння шкіри [2,3]. Повідомляється, що антиоксиданти втручаються в процес окислення шляхом поглинання вільних радикалів і АФК або хелатування каталітичних окислення металів [4]. Таким чином, відбулося різке збільшення кількості застосувань антиоксидантів або антиоксидантних харчових добавок для зменшення окисного стресу або спричиненого окисним стресом пошкодження в організмі [5,6]. Проте було показано, що деякі хімічні антиоксиданти, включаючи аскорбат натрію, трет-бутилгідроксіанізол (BHA), ериторбат натрію та трет-бутилгідрокситолуол (BHT), сприяють канцерогенному впливу на здоров’я людини [7]. Таким чином, за останні десятиліття спостерігається швидке зростання досліджень природних антиоксидантів рослинного походження. Важливо, що було виявлено, що підвищення рівня ROS може прискорити пігментацію шкіри. Серед АФК, отриманих з меланоцитів і кератиноцитів, оксид азоту, NO, стимулює синтез меланіну шляхом підвищення рівнів експресії білка тирозинази та спорідненого з тирозиназою білка 1 (TRP1) [8,9]. Вплив АФК на вироблення меланіну вивчався з використанням різних антиоксидантів, таких як N-ацетилцистеїн, щоб скасувати дію УФВ-індукованого меланоцитстимулюючого гормону (-МСГ) [10].

Меланін виробляється і секретується меланоцитами, які розподіляються в базальному шарі епідермісу шкіри [11]. Першими двома етапами шляху меланогенезу в людини є гідроксилювання L-тирозину до 3-4-дигідроксифенілаланіну (L-DOPA) та окислення L-DOPA до о-допахінону. Тирозиназа (EC 1.14.18.1) є лімітуючим швидкість ферментом, який каталізує обидві перші дві реакції під час меланогенезу [12]. Меланін відіграє важливу роль у захисті шкіри від сонячного ультрафіолету (УФ), а також відповідає за фарбування волосся, шкіри та очей. Повідомлялося про різноманітні дерматологічні розлади, такі як пігментні плями, мелазма, постзапальна меланодермія, веснянки та ділянки актинічних ушкоджень, що є результатом накопичення надмірного рівня епідермального меланіну [13]. Інгібітори синтезу меланіну все частіше застосовуються в продуктах по догляду за шкірою для лікування або профілактики розладів гіперпігментації шкіри [14,15]. Крім того, антиоксиданти, такі як арбутин або койєва кислота [16], використовувалися для лікування гіперпігментації [17]. Останнім часом косметика для відбілювання шкіри займає значну частку косметичної продукції. Не тільки жінки зі смаглявою шкірою, але й ті, хто намагається впоратися з темними плямами на шкірі, які виникають від ультрафіолету, вагітності або похилого віку, широко використовують ці засоби для відбілювання шкіри.

Меланогенез регулюється багатьма факторами. Наприклад, повідомляється, що споріднений з тирозиназою білок-1 (TRP1), асоційований з мікрофтальмією транскрипційний фактор (MITF) і пов’язаний з тирозиназою білок-2 (TRP2) регулюють вироблення меланіну [18–20]. ]. Рецептор меланокортину 1 (MC1R) також відіграє важливу роль у -MSH-індукованому синтезі меланіну [21]. У виробництві меланіну бере участь кілька сигнальних шляхів. Серед різних сигнальних шляхів, що регулюють вироблення меланіну, опосередкована циклічним АМФ (цАМФ) активація протеїнкінази А (PKA) відіграє вирішальну роль у регуляції меланогенезу [22]. У сигнальному шляху cAM-PKA cAMP індукує активацію PKA [23], за якою слідує фосфорилювання білка, що зв’язує елемент відповіді cAMP (CREB). CREB є внутрішньоклітинним фактором транскрипції, який стимулює експресію гена фактора мікрофтальмії (MITF), який є важливим у меланогенезі. MITF є фактором транскрипції, який зв’язується з промоторними ділянками меланогенних генів тирозинази, TRP1 і TRP2, посилюючи їх експресію [24, 25]. Після цього внутрішньоклітинний вміст меланіну зростає [26]. Повідомлялося, що -MSH підвищує рівень цАМФ і зазвичай застосовується для активації фосфорилювання CREB, а потім для підвищення рівня білка MITF [27].

Експресія MITF регулюється кількома сигнальними шляхами. N-кінцева кіназа c-Jun (JNK) і p38 мітоген-активована протеїнкіназа (MAPK) беруть участь в активації експресії MITF і, як наслідок, підвищеній експресії тирозинази. Сигнали активації позаклітинної чутливої ​​кінази (ERK) також збільшують фосфорилювання CREB і подальшу експресію MITF, яка модулює синтез меланіну [28,29]. Таким чином, повідомлялося, що кілька агентів, що відбілюють шкіру, пригнічують транскрипційну активність MITF шляхом зниження рівнів експресії білка тирозинази, TRP1 і TRP2 через зниження регуляції фосфорилювання MITF, опосередкованого p38MAPK. Крім того, було описано, що шлях ERK бере участь у регуляції MITF під час меланогенезу [30,31]. Активація ERK фосфорилює MITF, що призводить до деградації MITF, що призводить до зменшення вмісту меланіну [32,33].

Окислювальний стрес може бути результатом надлишкового виробництва АФК або зниження антиоксидантного захисту [1]. Пошук і застосування природних антиоксидантів залишається в центрі уваги численних дослідницьких груп у всьому світі. Останнім часом зростає інтерес до досліджень і розробки фітохімічних речовин, таких як природні антиоксиданти та фенольні сполуки з різних природних джерел, які можна використовувати як нутрицевтики, косметичні засоби проти старіння та лікарські засоби [34]. Phoenix dactylifera L. є однією з основних плодових культур, що вирощуються на Близькому Сході та в Північній Африці [35,36]. Попередні дослідження показали, що плоди P. dactylifera L. виявляють антиоксидантну, поглинаючу вільні радикали, антимікробну та протизапальну дію [37,38]. Функціональні ефекти P. dactylifera L. обмежуються не лише самими плодами, а й їх насінням, яке є свого роду побічним продуктом плодів [39,40]. Завдяки своїм антиоксидантним властивостям екстракти насіння P. dactylifera L. можуть служити джерелом антиоксидантних речовин, які діють проти окисного стресу [41–43]. Однак мало досліджень було проведено щодо застосування насіння P. dactylifera L. для розробки космецевтичних продуктів. Ці насіння зазвичай викидають як відходи, але тут підкреслюється їхнє значення як функціонального косметичного інгредієнта. На сьогоднішній день не було повідомлень про механізм дії екстракту насіння P. dactylifera L. у сфері косметики для догляду за шкірою або про вплив екстракту насіння на вироблення меланіну. У центрі уваги цього дослідження було визначення потенціалу екстракту насіння P. dactylifera L. як інгібітора меланогенезу для косметичної промисловості.

Механізми, що лежать в основі інгібуючої дії екстракту насіння P. dactylifera L. на меланогенез, ще не досліджені. Метою поточного дослідження було дослідити антиоксидантні характеристики та потенційні механізми дії екстракту насіння P. dactylifera L. на меланогенез шляхом вивчення регуляторів транскрипції MITF і фосфорилювання регуляторів сигнальних шляхів MAPK і PKA.

свіжа цистанка

2. Матеріали та методи

2.1. Хімічні речовини та реагенти

Хімічні реагенти, використані в дослідженні, були придбані у Sigma-Aldrich Chemical Co. (Сент-Луїс, штат Массачусетс, США). Антитіла були від Santa Cruz Biotech (Санта-Крус, Каліфорнія, США), а реагент ECL був від Millipore (Billerica, MA, США).

2.2. Підготовка та екстракція екстракту насіння P. dactylifera

Висушені плоди P. dactylifera L. були зібрані в 2019 році з традиційних сховищ, розташованих у місті Медіна, Саудівська Аравія. Насіння P. dactylifera L. повністю промивали, виставляли на сонячне світло, сушили на повітрі протягом одного дня, а потім сушили при 80 ◦C протягом 2 годин у духовці. Зневоднене насіння подрібнювали до дрібного порошку (№ 50 меш) за допомогою спеціального млина (Retsch Ultra Centrifugal Mill and Sieving Machine, Type ZM1, Haan, Німеччина). Порошок збирали в закриту скляну пляшку і зберігали при 25 ◦C до використання. Подрібнений висушений порошок насіння P. dactylifera L. (2 г) поміщали в екстракційний стакан, що містить 10 мл дистильованої води. Далі було проведено ультразвукову екстракцію за допомогою моделі ULTRAsonikTM 57H (250 Вт, C і A Sales Industrial Supplies, Юкайпа, Каліфорнія, США). Робоча частота 45 кГц протягом 30 хв. Після екстракції зразки центрифугували при 4500 об/хв протягом 50 хв при 25 ◦C за допомогою Eppendorf Centrifuge 5810 R (Гамбург, Німеччина). Супернатанти збирали та фільтрували за допомогою нейлонового фільтра (розмір пор: 0,45 мкм), а фільтрат концентрували до 9,8 мг/мл.

2.3. Аналіз екстракту насіння P. dactylifera та ферулової кислоти за допомогою ультраефективної рідинної хроматографії (UPLC)

Екстракт насіння P. dactylifera аналізували за допомогою ACQUITY UPLC H класу з фотодіодним детектором (Waters, Milford, MA, USA). Колонка представляла собою колонку ACQUITY UPLC BEH C18, 130 Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 100 мм. Рухома фаза A була 0,5% оцтової кислоти, а рухома фаза B була ацетонітрилом. Для моментів часу 0 і 5 хвилин процентне співвідношення A/B становило 95/5; протягом 20 хв процентне співвідношення А/В становило 5/95; для моментів часу 21 і 25 хвилин процентне співвідношення A/B становило 95/5. Ферулову кислоту (1 ppm) використовували як позитивний стандарт.

2.4. Аналіз активності поглинання DPPH

У цьому аналізі вітамін С ({{0}}.5 мг/мл) і BHA (0.1 мг/мл) використовувалися як антиоксидантні стандарти. Екстракт насіння P. dactylifera L. у різних концентраціях (0.0049, 0,0245 і 0,049 мг/мл) додавали до 2,9 мл розчину DPPH (60 мкМ). Антиоксидантні компоненти в екстракті насіння можуть віддавати водень DPPH і перетворювати DPPH у відновлену форму. Результуюче зменшення поглинання при 517 нм було зареєстровано за допомогою UV-Vis спектрофотометра [44].

2.5. ABTS плюс аналіз здатності до очищення

Здатність екстракту насіння P. dactylifera L. ABTS плюс поглинання порівнювалася з показниками вітаміну С ({{0}}.9 мг/мл) і BHA ({{10}}). 9 мг/мл). Для цього аналізу використовувався ABTS plus. Спочатку катіон був отриманий шляхом взаємодії розчину ABTS (7 мМ) з персульфатом калію (2,45 мМ), і суміші давали постояти в темряві протягом щонайменше 6 годин перед використанням. Оптичну густину при 734 нм вимірювали через 10 хв після змішування різних концентрацій екстракту насіння (0,0098, 0,049 і 0,098 мг/мл) з 1 мл розчину ABTS plus [45].

2.6. Визначення загального вмісту фенолів

Загальний вміст фенолів визначали за допомогою реактиву Фоліна–Чокальте [46], а як позитивний стандарт використовували галову кислоту (2 мкг/мл). Різні концентрації екстракту насіння P. dactylifera L. (0.{0196, 0.098 і 0,196 мг/мл) готували у 80% метанолі; 100 мкл екстракту переносили в пробірку, додавали 0,5 мл реагенту Фоліна–Чокальтеу (попередньо розведеного 10-кратно деіонізованою водою) і перемішували. Суміш залишали стояти при кімнатній температурі протягом 5 хв; Додавали 1,5 мл 20% карбонату натрію. Після витримування при кімнатній температурі протягом 2 годин абсорбцію зчитували при 760 нм за допомогою спектрофотометра UV-Vis.

2.7. Визначення відновної ємності

Вітамін С ({{0}}.008 мг/мл) або BHA (4,8 мг/мл) використовувалися як позитивні стандарти в цьому аналізі. Відновну здатність екстракту насіння визначали згідно з методом, описаним Oyaizu [47]. Різні концентрації екстракту насіння P. dactylifera L. (0.0073, 0,036, 0,073 мг/мл) змішували з фосфатним буфером (2,5 мл, 0,2 М, pH 6,6). ) і фериціанід калію [K3Fe (CN)6] (2,5 мл, 1% мас./об.). Суміш інкубували при 50 ◦C протягом 20 хв. Трихлороцтову кислоту (2,5 мл, 10% мас./об.) додавали до суміші, яку потім центрифугували при 1000 × g протягом 10 хв. Верхній шар розчину (2,5 мл) змішували з дистильованою водою (2,5 мл) і FeCl3 (0,5 мл, 0,1% мас./об.) і вимірювали поглинання при 700 нм.

2.8. Вимірювання хелатної здатності іонів заліза (II).

Для вимірювання хелатної здатності Fe2 плюс -іонів екстракту насіння P. dactylifera L. EDTA (0.02, 0.{04 та { 10}}.08 мг/мл) використовували як позитивний стандарт. Різні концентрації екстракту насіння (0.0196, 0,098 і 0,196 мг/мл) додавали до розчину FeCl2 (0,05 мл, 1 мМ). Реакційну суміш вводили в реакцію з ферозином (0,1 мл, 1 мМ), потім суміш доводили кількісно до 1 мл метанолом та інкубували при 25 ◦C протягом 10 хвилин. Поглинання реакційної суміші вимірювали при 562 нм [48].

2.9. Аналіз життєздатності клітин

Дослідження життєздатності клітин проводили методом МТТ [49]. Клітини піддавали впливу різних концентрацій екстракту насіння P. dactylifera L. (0.049, 0.245 і 0,49 мг/мл) протягом 24 годин при 37 ◦C і 5 відсотків CO2 у зволоженому інкубаторі, і розчин МТТ додавали в лунки. Нерозчинну похідну МТТ солюбілізували етанолом-ДМСО (розчин суміші 1:1). Поглинання лунок при 570 нм вимірювали за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів. Клітини B16F10 (BCRC60031) були отримані з Центру збору та дослідження біоресурсів (BCRC), місто Синьчу, Тайвань. Клітини зберігалися в DMEM (Hyclone, Logan, UT, США) з додаванням 10% фетальної бичачої сироватки та 1% антибіотиків. Крім того, вплив насіння P. dactylifera L. на життєздатність клітин B16F10 також оцінювали за допомогою методу виключення трипанового синього. Після обробки екстрактом насіння клітини обробили трипсином і центрифугували для збору осаду. Осад клітин повторно суспендували в 300 мкл середовища для культури клітин DMEM. Невелику аліквоту клітинної суспензії (20 мкл) обережно змішували з 10 мкл трипанового синього (4 відсотки в PBS). Кількість клітин підраховували (нежиттєздатні клітини були блакитними, а життєздатні — незабарвленими) за допомогою гемоцитометра під мікроскопом.

2.10. Вимірювання активності тирозинази грибів

Розчин грибної тирозинази (10 мкл, 200 одиниць) додавали до 96-лункового мікропланшету. Реакційна суміш містила 5 мМ L-DOPA, розчиненого у фосфатно-сольовому буфері (PBS) (50 мМ, pH 6,8), і екстракт насіння P. dactylifera L. (0.049, 0.245 і 0,49 мг/мл), койєву кислоту (200 мМ; 0,03 мг/мл) або арбутин (2 мМ; 0,54 мг/мл). Суміш для аналізу інкубували при 37 ◦C протягом 30 хвилин і вимірювали поглинання утвореного допахрому при 490 нм. Вимірювання активності тирозинази грибів проводили, як описано раніше [50].

2.11. Визначення вмісту меланіну

Клітини B16F10 обробляли -MSH (100 нМ) протягом 24 годин, а потім обробляли або екстрактом насіння P. dactylifera L. (0,0245–0,147 мг/мл) або арбутин (0,54 мг/мл) протягом додаткових 24 год. Після обробки осад клітин солюбілізували в розчині NaOH (1N) при 60 ◦C протягом 60 хв. Вміст меланіну було виявлено при 405 нм, як описано раніше Tsuboi [51].

Цистанхе пригнічує вироблення меланіну.

2.12. Вимірювання активності внутрішньоклітинної тирозинази

Активність внутрішньоклітинної тирозинази визначали, як описано раніше [52]. Клітини обробляли -MSH (100 нМ) протягом 24 годин, а потім екстрактом насіння P. dactylifera L. (0.0245–0,147 мг /мл) або арбутин (0,54 мг/мл) протягом 24 год. Після обробки клітинні екстракти (100 мкл) змішували зі свіжоприготованим розчином L-DOPA (0,1 відсотка в PBS) і інкубували при 37 ◦C, і вимірювали поглинання при 490 нм.

2.13. Вестерн-блотінг

Клітини обробляли екстрактом насіння P. dactylifera L. ({{0}}.0245, 0.0368, 0.{ {14}}49 і 0.147 мг/мл) або арбутин (0,54 мг/мл), а потім лізують у PBS, що містить недієтичний P-40 (1 відсоток), дезоксихолат натрію (0,5 відсотка), додецил натрію сульфат (SDS, 0,1 відсотка), апротинін (5 мкг/мл), фенілметилсульфонілфторид (100 мкг/мл), пепстатин А (1 мкг/мл) і ЕДТА (1 мМ) при 4 ◦C протягом 20 хв. Загальні лізати кількісно визначали за допомогою набору micro BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Білки (30 мкг) розділяли електрофорезом у SDS-поліакриламідному гелі та електрофоретично переносили на полівініліденфторидну мембрану. Мембрану блокували в 5% знежиреному молоці в PBST (PBS з 0,05% Tween-20) та інкубували при 4 ◦C протягом ночі з такими первинними антитілами, розведеними в PBST: MITF Ab (1:1000), TRP1 Ab (1:6000), TRP2 Ab (1:1000), MC1R Ab (1:500), GAPDH Ab (1:1500), тирозиназа Ab (1:2000), p-p38 Ab (1:500), p38 Ab (1:500), p-JNK Ab (1:500), JNK Ab (1:500), p-ERK Ab (1:500), ERK Ab (1:500), p-CERB Ab (1: 500) і CERB Ab (1:200), усі від Santa Cruz Biotech (Даллас, Техас, США)). Зв'язані антитіла були виявлені за допомогою вторинного антитіла, кон'югованого з пероксидазою хрону (Amersham Corp.), з подальшою системою виявлення ECL (Amersham) відповідно до інструкцій виробника.

2.14. Аналіз інгібітора PKA

Клітини обробляли -MSH (100 нМ) протягом 24 годин з наступним додаванням 10 мкМ PKA регулятора H89 протягом 1 години. Після обробки до клітин додавали екстракт насіння P. dactylifera L. (0,147 мг/мл) і H89 та інкубували ще 23 години. Вміст меланіну визначали, як описано вище.

2.15. Статистичний аналіз

Статистичний аналіз проводився за допомогою тесту Tukey, який використовувався для порівняння виміряних даних, за допомогою статистичного програмного забезпечення Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) версії 22.0 (SPSS Inc., Чикаго, Іллінойс, США). * p < 0.05="" вважалося="" значущим,="" **="" p="">< 0,01,="" ***="" p=""><>

3. Результати

3.1. Аналіз UPLC екстракту насіння P. dactylifera L

Результати аналізу UPLC показані на малюнках 1A, B. На малюнку 1A зображено перекритий пік екстракту насіння P. dactylifera L. і ферулової кислоти при 330 нм. На малюнку 1B показано аналогічні спектри сканування між 220 і 500 нм для екстракту насіння P. dactylifera L. і ферулової кислоти.

3.2. Антиоксидантні характеристики екстракту насіння P. dactylifera L

Антиоксидантна активність екстракту насіння P. dactylifera L. in vitro показала наявність антиоксидантного потенціалу. У аналізі DPPH вітамін С ({{0}}.05 мМ; 0,53 мг/мл) і трет-бутилгідроксіанізол (ВНА) (0 .1 мг/мл) використовували як позитивні антиоксидантні стандарти. Здатність екстракту поглинати DPPH становила 49,97 ± 2,9 відсотка, 81,36 ± 0.56 відсотка та 78,53 ± 3,83 відсотка від контролю для концентрації 0 в екстракті.0{{ 31}}49, 0,0245 і 0,049 (мг/мл), відповідно. Для порівняння, поглинальна здатність вітаміну С і BHA становила 90,12 ± 0,31 відсотка і 90,44 ± 0,49 відсотка відповідно (рис. 2A).

Цей катіон-радикал ABTS має синій колір і реагує на більшість антиоксидантів. Під час цієї реакції синій катіон-радикал ABTS перетворюється назад у безбарвну нейтральну форму. Реакцію контролювали спектрофотометрично. ABTS плюс поглинальна здатність екстракту становила 5,69 ± 1,36 відсотка, 18,81 ± 0.68 відсотка та 66,82 ± 8,51 відсотка від контролю в концентраціях 0.0{{16 }}98, 0.{{20}}49 і 0.098 мг/мл відповідно. Навпаки, ABTS плюс здатність поглинати вітамін С (0,9 мг/мл) і ВНА (0,9 мг/мл) становили 95,52 ± 0,12 відсотка і 40,3 ± 0,83 відсотка відповідно. Результати на малюнку 2B показують, що екстракт насіння поглинає значну кількість ABTS плюс радикал.

Для визначення загального вмісту фенолів в екстракті насіння P. dactylifera L. як позитивний стандарт використовували галову кислоту (2 мкг/мл). Результати на малюнку 2C показують, що загальний вміст фенолів у 0.{0196, 0.{{20}}98 і 0. 196 (мг/мл) екстракту становили 33,43 ± 2,33 відсотка, 117,22 ± 7,81 відсотка та 195,4 ± 10,91 відсотка відповідно. Еквіваленти галової кислоти (GAE) вищезазначених концентрацій екстрактів насіння становили 0.068 ± 0,01, 0,365 ± 0,01 і 0,642 ± 0,03 відповідно (рис. 2C).

3.3. Інгібуюча дія екстракту насіння P. dactylifera L. на меланогенез

Результати, показані на малюнку 4A, демонструють, що 0.049 мг/мл екстракту насіння P. dactylifera L.не справляв інгібуючої дії на активність тирозинази грибів. З іншого боку, відсоток інгібування ферменту становив 8,34 ± 2,67 відсотка та 33 ± 2,36 відсотка від контролю для 0.245 та 0.49 мг/млОбробка екстрактом насіння P. dactylifera L. відповідно. Крім того, відсоток інгібування тирозинази койєвої кислоти (200 мкМ; 0.03 мг/мл) і арбутину (2 мМ; 0,54 мг/мл) ) становили 56,26 ± 5,06 відсотка та 64,56 ± 2,88 відсотка від контролю відповідно (рис. 4A). Таким чином, більш високі концентрації екстракту насіння P. dactylifera L. (0,245 і 0,49 мг/мл) можуть представляти інгібіторний рівень тирозинази грибів.

На малюнку 4B результати показали, що лише 0.147 мг/мл екстракту насіння P. dactylifera L. може значно знизити вміст меланіну в клітинах меланоми B16F10. Після лікування вміст меланіну в клітинах B16F10 становив 80.66 ± 5,43 відсотка від контролю. Для позитивного стандарту, арбутину (0.54 мг/мл), залишковий внутрішньоклітинний вміст меланіну становив 61,19 ± 8,17 відсотка від контролю. Результати показали, що 0,147 мг/мл екстракту насіння P. dactylifera L. продемонстрував менший ефект, ніж арбутин. Решта значень активності внутрішньоклітинної тирозинази становила 85,1 ± 8,1 відсотка та 73,7 ± 11,9 відсотка для 0,098 та 0,147 мг/мл екстракту насіння P. dactylifera L. відповідно. Решта активності внутрішньоклітинної тирозинази становила 64,3 ± 14,9 відсотка від контролю після обробки клітин арбутином (рис. 4C). Результати показали, що вищі концентрації екстракту насіння P. dactylifera L. все ще виявляли менший інгібуючий ефект на -MSH-індуковану активність тирозинази в клітинах B16F10, ніж арбутин.

3.4. Екстракт насіння P. dactylifera L. пригнічує рівні експресії білків, які беруть участь у меланіногенезі

Вестерн-блоти використовували для дослідження рівнів експресії білків, пов’язаних з меланогенезом, у клітинах B16F10 (рис. 5A). Результати показують, що обробка різними концентраціями екстракту насіння P. dactylifera L. призвела до зниження рівнів MC1R, MITF, тирозинази, TRP1 і TRP2. Інгібуючий ефект екстракту на експресію білка був очевидним при концентрації {{10}}.147 мг/мл. Кратна зміна рівня експресії білка для MC1R становила 0.74 ± 0.02; для MITF це було {{20}}.51 ± 0.03; для тирозинази це було 0.54 ± 0.26; для TRP-1 – 0,57 ± 0,15; і для TRP-2 він становив 0,49 ± 0,1 (рис. 5B).

Рівні експресії пов'язаних з меланогенезом сигнальних білків досліджували за допомогою Вестерн-блоттингу (Фігура 5C). Результати показують, що 0.147 мг/мл обробки екстрактом насіння P. dactylifera L., очевидно, призвело до зниження рівнів p-p38, p-JNK, p-ERK і p-CREB. Кратна зміна рівня експресії білка для p-p38 становила 0.88 ± 0.15; для p-JNK це було 0.68 ± 0.39; для p-ERK це було 0.65 ± 0.23; а для p-CREB це було 0.44 ± 0.07 (рис. 5D).

3.5. Екстракт насіння P. dactylifera L. не впливає на експресію генів тирозинази, TRP1, TRP2 або MITF

Рівні експресії генів пов'язаних з меланогенезом білків, таких як тирозиназа, TRP1, TRP2 і MITF, досліджували за допомогою кількісної полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі (RT-PCR). Відносні нормалізовані рівні експресії тирозинази/GAPDH для 0.{0367, 0.049 і 0.147 мг/мл P. лікування екстрактом насіння dactylifera L. становило 3,51 ± 0.52, 2,38 ± 0.24 і 1,64 ± 0.55 відповідно. Для TRP-1/GAPDH відносні нормалізовані рівні експресії для 0.0367, 0.049 і {{4{{{43} }}}.147 мг/мл екстракту насіння P. dactylifera L. було 1,64 ± 0.2, 1,15 ± 0.02 і 0. 89 ± 0.07 відповідно. Відносні нормалізовані рівні експресії TRP-2/GAPDH для 0.{0367, 0.049 і 0.147 мг /мл екстракту насіння P. dactylifera L. становили 1.08 ± 0.13, 0.85 ± 0.01 і 0.7 ± 0.05 відповідно. Для MITF/GAPDH відносні нормалізовані рівні експресії для 0,0367, 0,049 і 0,147 мг/мл екстракту насіння P. dactylifera L. становили 1,48 ± 0,19, 1,03 ± 0,02 і 0,74 ± 0,05 відповідно (рис. 6).

4. Обговорення

Повідомлялося, що меланогенез збільшує клітинний окислювальний стрес. Крім того, кілька антиоксидантів, поглиначів АФК, поглиначів інгібіторів та інгібіторів можуть пригнічувати опосередкований ультрафіолетом синтез меланіну [54]. Тому антиоксиданти, поглиначі АФК та ​​інгібітори меланогенезу все частіше застосовуються в косметиці для відбілювання шкіри для запобігання небажаній гіперпігментації шкіри [14]. Також було виявлено, що стимуляція металотіонеїну, ендогенного антиоксиданту, може пригнічувати меланогенез у меланоцитах [55]. Людська шкіра часто піддається впливу окислюючих забруднювачів навколишнього середовища або УФ-променів і пошкоджується зовнішніми факторами навколишнього середовища. Зокрема, повідомляється, що УФ-опромінення індукує генерацію АФК у шкірі та сприяє перекисному окисленню ліпідів клітинних мембран [56]. Для протидії окислювальному стресу шкіра оснащена спеціальними антиоксидантними системами [57].

Щоб з’ясувати антиоксидантну активність екстракту насіння P. dactylifera L., DPPH і ABTS плюс активність поглинання радикалів, загальний вміст фенолів, відновлювальну здатність і здатність екстракту хелатувати іони металів визначали, як описано раніше [47,48]. Екстракт насіння P. dactylifera L. виявляв значну антиоксидантну активність у всіх вищезазначених аналітичних дослідженнях. Результати показали антиоксидантний потенціал екстракту насіння P. dactylifera L. у різних діапазонах із відмінною ефективністю. Активність поглинання DPPH екстракту насіння, показана на малюнку 2A, відрізнялася від активності ABTS plus, показаної на малюнку 2B, що, можливо, було результатом інших механізмів взаємодії антиоксидантів і радикалів. Крім того, стехіометрія реакцій між антиоксидантними компонентами в екстракті насіння може змінюватися, що призводить до різниці в здатності поглинати вільні радикали [58]. Потенційні антиоксиданти в екстракті насіння P. dactylifera L. можуть перетворювати комплекс Fe3 плюс/фериціанід у форму двовалентного заліза, а відновлювальна здатність служила індикатором антиоксидантної активності екстракту насіння, показаного на малюнку 2D. Було виявлено, що койєва кислота [59] діє як інгібітор тирозинази, оскільки койєва кислота діє як хелатор металу, утворюючи хелат іонів міді та інгібуючи проникнення цих іонів в активний центр тирозинази. Таким чином, антиоксиданти в екстракті насіння можуть утворювати нерозчинні металеві комплекси з іонами двовалентного заліза, а потім пригнічувати взаємодію між іонами металів і ліпідами. Вища здатність екстракту насіння до хелатування іонів металів вказує на його потенційну антиоксидантну активність і можливі інгібуючі ефекти на активність тирозинази (рис. 2E).

Принцип аналізу внутрішньоклітинних АФК полягає в тому, що DCFH-DA дифундує через клітинну мембрану та ферментативно гідролізується до DCFH естеразою; потім DCFH реагує з АФК (наприклад, H2O2), утворюючи DCF. Швидке збільшення DCF вказує на окислення DCFH внутрішньоклітинними радикалами [60]. Ідея пошуку нових антиоксидантів для відбілювання шкіри полягає в гіпотезі про те, що окислювальний стрес, спричинений УФ-опроміненням, може сприяти стимуляції синтезу меланіну. Повідомлялося, що УФ-опромінення викликає АФК у шкірних тканинах, що може індукувати вироблення меланіну шляхом активації тирозинази [61]. Крім того, повідомлялося, що деякі відбілювачі шкіри можуть пригнічувати меланогенез шляхом взаємодії з іонами міді в активному центрі тирозинази або з о-хінонами, щоб блокувати полімеризацію проміжних продуктів у шляху синтезу меланіну [62]. Крім того, вітамін С або вітамін Е можуть зменшити окислення вже існуючих частинок меланіну. Таким чином, ці вітаміни широко застосовуються в продуктах для відбілювання шкіри [63]. Цікаво, що наші результати продемонстрували антиоксидантні властивості екстракту насіння P. dactylifera L., вказуючи на те, що екстракт насіння P. dactylifera L. може діяти як інгредієнт для відбілювання шкіри в косметиці.

Аналіз МТТ — це добре відомий колориметричний аналіз, який вимірює активність клітинних НАДН/НАДФН-залежних ферментів оксидоредуктази, які відновлюють МТТ до барвників формазан фіолетового кольору. Цей аналіз можна застосувати для вивчення потенційної цитотоксичності лікарських засобів і токсичних матеріалів, оскільки ці речовини посилюють або пригнічують життєздатність клітин. Результати, показані на малюнку 3A, відповідали результатам аналізу виключення трипанового синього на малюнку 3B, який показує, що екстракт насіння P. dactylifera L. не мав цитотоксичної дії на життєздатність клітин меланоми B16F10.

Грибна тирозиназа зазвичай використовується як цільовий фермент для скринінгу потенційних інгібіторів меланогенезу. Вперше було виявлено, що діапазон дозування ({{0}}.049–0,49 мг/мл) екстракту насіння P. dactylifera L. може пригнічувати активність тирозинази грибів. Результати, наведені на малюнку 4A, вказують на те, що екстракт насіння демонстрував менший інгібуючий вплив на активність тирозинази грибів, ніж койєва кислота. Тирозиназа відіграє головну роль на перших двох етапах шляху меланогенезу. Щоб з’ясувати справжню інгібіторну дію екстракту насіння P. dactylifera L. на вироблення меланіну, було визначено вміст меланіну B16F10 та внутрішньоклітинну активність тирозинази. Результати, представлені на малюнку 4B, показують, що більш висока концентрація екстракту насіння P. dactylifera L. справляла очевидний інгібуючий ефект на утворення меланіну. Дані показали, що екстракт насіння P. dactylifera L. справді блокує меланогенез у клітинах меланоми. Таким чином, результати, показані на малюнку 4C, відповідали результатам, показаним на малюнку 4B. У вищезгаданих клітинних експериментах -MSH використовувався як індуктор для стимуляції синтезу меланіну. Повідомлялося, що -MSH зв'язує рецептор меланокортину 1 (MC1R) і активує внутрішньоклітинну аденілатциклазу, яка, у свою чергу, каталізує АТФ до цАМФ і активує цАМФ-залежний PKA. Результати на малюнку 5A показали, що екстракт насіння P. dactylifera L. пригнічує експресію MC1R, тим самим блокуючи вироблення меланіну, викликане опосередкованою -MSH внутрішньоклітинною активацією цАМФ. Крім того, сигнальний шлях PKA, опосередкований цАМФ, був інактивований, а меланогенез пригнічувався. Щоб підтвердити висновок, ми провели експерименти з інгібітором PKA, і дані, показані на малюнку 4D, показали, що інгібуючий ефект екстракту насіння P. dactylifera L. (0,147 мг/мл) на меланогенез у клітинах B16F10 пригнічувався H{{ 24}}лікування. H89 (N-[2-p-бромциннаміламіноетил]-5-ізохінолінсульфонамід) є селективним і потужним інгібітором PKA. Результати показують, що екстракт насіння P. dactylifera L. впливав на передачу сигналів PKA, опосередковану цАМФ.

Тирозиназа, TRP1 і TRP2 є трьома основними ферментами, які регулюють синтез меланіну в клітинах ссавців [64]. Крім того, MITF є основним регулятором транскрипції тирозинази, TRP1 і TRP2, а також найважливішим регулятором пігментації меланоцитів [65]. Результати на малюнку 5A вказують на те, що екстракт насіння P. dactylifera L. знижує рівні експресії білка цих білків, пов’язаних з меланогенезом, пригнічує активність тирозинази та знижує вміст меланіну в клітинах B16F10.

У цьому дослідженні екстракт насіння P. dactylifera L. пригнічував фосфорилювання CREB і активацію PKA. Ці дані свідчать про те, що шлях cAMP-PKA може відповідати за індукований екстрактом насіння P. dactylifera L. антимеланогенез (рис. 5C).

Повідомлялося, що MAPK модулюють меланогенез [66]. Сімейство MAPK включає три типи протеїнкіназ, включаючи позаклітинну чутливу кіназу (ERK), N-кінцеву кіназу c-Jun (JNK) і p38 MAPK. p38 MAPK може активувати білок, що зв’язує елемент відповіді цАМФ (CREB, а CREB активує експресію MITF, що позитивно впливає на синтез меланіну [67]. Результати на малюнку 5C свідчать про те, що екстракт насіння P. dactylifera L. може інактивувати CREB, JNK і p38, у свою чергу, пригнічують експресію MITF (рис. 5A). Ці результати свідчать про те, що антимеланогенний ефект, індукований екстрактом насіння Dactylifera L., може бути опосередкований пригніченням шляхів PKA. Крім того, повідомлялося, що ультрафіолетове опромінення грає роль є помітною ознакою в ініціації кількох захворювань шкіри, включаючи лущення, зморшки та гіперпігментацію [68].Результати показали, що екстракт насіння P. dactylifera L. знижує вироблення меланіну, що можна пояснити виснаженням внутрішньоклітинних АФК.

Щоб оцінити вплив екстракту насіння P. dactylifera L. на виробництво клітинного меланіну, ми визначили рівні мРНК у клітинах B16F10, оброблених -MSH та екстрактом насіння P. dactylifera L. Клітини, оброблені -MSH, продемонстрували підвищені рівні MITF, тирозинази, TRP-1 і TRP-2, як і очікувалося. Цікаво, що клітини, оброблені екстрактом насіння P. dactylifera L., продемонстрували зниження експресії мРНК цих генів, пов’язаних з меланогенезом. Однак статистично значущої різниці між колонками не виявлено, що свідчить про те, що екстракт насіння P. dactylifera L. не впливає на рівні експресії генів MITF, тирозинази, TRP1 і TRP2.

Це наш продукт.

Для отримання додаткової інформації натисніть тут.

Повідомлялося, що основною фенольною кислотою, знайденою в насінні P. dactylifera L., є ферулова кислота [69]. Було показано, що ферулова кислота ефективно пригнічує синтез меланіну в клітинах меланоми В16 шляхом інгібування індукованого казеїнкіназою 2-фосфорилювання тирозинази залежно від дози [70]. Ці звіти підтверджують наші результати, показані на малюнку 1: ферулова кислота у водному екстракті насіння P. dactylifera L. сприяла пригніченню меланогенезу в клітинах B16F10. Безумовно, інші функціональні компоненти екстракту насіння повинні бути досліджені найближчим часом.

Наші результати показали, що екстракт насіння P. dactylifera L. пригнічує меланогенез у клітинах B16F10 шляхом зниження регуляції сигнальних шляхів PKA. Отже, екстракт насіння P. dactylifera L. можна використовувати як ефективний засіб для відбілювання шкіри.

5. Висновки

Це перший звіт про механізм дії водного екстракту насіння P. dactylifera L. на синтез меланіну. Це дослідження продемонструвало участь шляху cAMP/PKA/CREB у депігментуючому ефекті екстракту насіння P. dactylifera L. Наші результати показали, що екстракт насіння P. dactylifera L. пригнічує меланогенез у клітинах B16F10 шляхом зниження регуляції сигнальних шляхів PKA. Отже, екстракт насіння P. dactylifera L. можна використовувати як новий дерматологічний засіб проти меланогенезу та ефективний засіб для відбілювання шкіри.