Механізми активації меланоцитів і раціональне терапевтичне лікування сонячних лентиго

Анотація:Щоб охарактеризувати патобіологію сонячних лентиго (SL), аналізи за допомогою напівкількісної RT-PCR, вестерн-блоттингу та імуногістохімії виявили підвищену експресію рецепторів ендотеліну (EDN)-1/ендотеліну B (EDNBR), фактора стовбурових клітин (SCF). )/c-KIT і фактор некрозу пухлини (TNF) в ураженому епідермісі, що контрастує зі зниженою експресією інтерлейкіну (IL) 1 . Ці знахідки переконливо підтверджують гіпотезу про те, що попереднє повторне опромінення ультрафіолетом B спонукає кератиноцити постійно виробляти TNF. Потім TNF стимулює секрецію EDN і виробництво SCF аутокринним способом, що призводить до постійної меланогенної активації сусідніх меланоцитів, що викликає SLs. Клінічне дослідження 36 пацієнтів із СЛ протягом шести місяців, які отримували екстракт M. Chamomilla з потужною здатністю скасовувати індуковане EDN1-збільшення синтезу ДНК і меланізацію людських меланоцитів у культурі, виявило значне покращення показників пігменту і колірні відмінності, виражені як значення L. Інше клінічне дослідження з використанням aтирозиназаінгібітор L-аскорбат-2-фосфат 3 Na (ASP) продемонстрував, що значення L шкіри, обробленої тестовим лосьйоном (6 відсотків APS), суттєво зросли в SL і в шкірі без пошкоджень зі значно вищим значенням ∆L у SL, коли порівняно зі шкірою без пошкоджень. Сума цих результатів переконливо свідчить про те, що комбіноване місцеве лікування блокаторами сигналу EDN ітирозиназаінгібітори є бажаним терапевтичним вибором для SLs.

Ключові слова: сонячне лентиго; ендотелін; фактор стовбурових клітин; фактор росту кератиноцитів; інтерлейкін-1; фактор некрозу пухлини; внутрішньоклітинна сигналізація; мобілізація кальцію; блокатор сигналізації; M. chamomilla; аскорбат-фосфат Na; відбілюючий засіб; інгібітор тирозинази

Цистанхе є інгібітором тирозинази.

Клацніть, щоб цистанчеві ефекти для інгібування тирозинази

1. Введення

Найчастішим епідермальним гіперпігментним розладом шкіри азіатів є сонячні лентиго (SL), які зазвичай виникають на обличчі та на тильній поверхні рук. На відміну від гіперпігментації, спричиненої ультрафіолетовим випромінюванням (меланоз ультрафіолетового випромінювання), який, залежно від віку суб’єкта, зникає протягом двох тижнів або кількох місяців після припинення впливу ультрафіолетового випромінювання, СЛ розвиваються на шкірі, яка піддається впливу сонця, особливо на обличчі, і ніколи не зникають через можливе пошкодження ДНК в кератиноцитах, викликане повторним опроміненням УФВ ураженого епідермісу. Загалом, гіперпігментні розлади, як правило, є мішенню антипігментних агентів і включають UVB-меланоз, SLs та мелазму. Виходячи з частоти остаточного діагнозу для пацієнтів з різними пігментними розладами в Японії, SLs мають найвищу частоту, що виникає приблизно у 60 відсотків усіх пацієнтів з гіперпігментними розладами, тоді як мелазма та постзапальна гіперпігментація (включаючи UVB-меланоз) зустрічаються у лише 5,2% і 3,3% пацієнтів відповідно [1]. Це свідчить про те, що SL є переважною мішенню засобів проти пігментації для азіатської шкіри. Однак було мало опублікованих робіт про клінічні ефекти антипігментних агентів на SL, оскільки багато антипігментних агентів служатьтирозиназаінгібітори, і це не очікуєтьсятирозиназаінгібування буде достатнім для полегшення гіперпігментації SLs. Крім того, здається складним раціонально розробити ефективне терапевтичне місцеве лікування СЛ, оскільки мало відомо про механізми активації меланоцитів в ураженому епідермісі. У цій оглядовій статті ми характеризуємо патобіологію СЛ відповідно до місцевого лікування СЛ, оскільки мало відомо про механізми активації меланоцитів в ураженому епідермісі. У цій оглядовій статті ми характеризуємо патобіологію СЛ відповідно до відомих мереж меланогенних паракринних цитокінів і на основі виявлених механізмів активації меланоцитів в ураженому епідермісі СЛ ми представляємо раціональні клінічні підходи до місцевого лікування СЛ для полегшення гіперпігментації. рівень.

2. Клінічна характеристика

СЛ клінічно розвиваються як плоскі, чітко обмежені ділянки шкіри різного кольору та розміру, які часто з’являються на обличчі та тильній поверхні рук (рис. 1а) [2]. Гістохімія пошкоджень SL, пофарбованих гемоксиліном і еозином, виявила легкий акантоз і пігментацію вздовж базального шару клітин (рис. 1b) [2]. Існують дві моделі з точки зору гістопатологічних особливостей СЛ на обличчі: одна картина демонструє сплощений епідерміс з базальним меланозом, а інша картина показує епідермальну гіперплазію з подовженими сітчастими гребнями, що складаються з глибоко пігментованих базалоїдних клітин [3].

3. Механізми активації меланоцитів у сонячному лентиго на основі меланогенної паракринної цитокінової мережі

3.1. Кількість меланоцитів і експресія тирозинази

Хоча були деякі аргументи щодо збільшення кількості меланоцитів у СЛ, імуногістохімічний аналіз із застосуванням меланоцит-специфічного маркера MART-1 виявив збільшення кількості меланоцитів у сонячному лентиго [5–7]. Однак фактична щільність меланоцитів вздовж кордону між дермою та епідермісом у SLs подібна до такої в контрольній шкірі навколо ураження через підвищену проліферацію кератиноцитів [7]. Імуногістохімія з використанням анти-тирозиназавиявив, щотирозиназа-позитивні меланоцити були значно збільшені в 2-рази в ураженому епідермісі SLs [4]. Аналіз генів за допомогою напівкількісної RT-PCR виявив, що рівень експресії мРНК тирозинази значно підвищується в 23-рази в ураженому епідермісі [4]. Наведені вище результати підтверджують можливість того, що існує стимуляція як проліферації, так і меланізації в пошкоджених меланоцитах SL. Таким чином, ми припустили, що злегка проліферуючі кератиноцити в SLs викликають активацію сусідніх меланоцитів шляхом секреції цитокінів, що стимулюють меланоцити.

3.2. Меланогенні паракринні цитокінові мережі

Ми та інші групи з’ясували, що між клітинами шкіри є кілька важливих мереж меланогенних паракринних цитокінів (рис. 2). В основному це ендотелін (EDN)-1 [8–15], мембранозв’язаний фактор стовбурових клітин (mSCF) [16], проопіомеланокортин (POMC) [17–20], простагландин E2 [21], гранулоцитарний макрофаг фактор стимуляції колоній (GM-CSF) [22], основний фактор росту фібробластів [23], пов’язаний з ростом онкоген [24] і фактор росту кератиноцитів (KGF) [25,26], що беруть участь у взаємодії кератиноцитів/меланоцитів і розчинному SCF [27] ], фактор росту гепатоцитів (HGF) [8,10,27–29] і KGF [30], що беруть участь у взаємодії фібробластів/меланоцитів. На основі з’ясованих мереж меланогенних паракринних цитокінів, включаючи їх відповідні рецептори, важливо визначити, які мережі меланогенних паракринних цитокінів залучені та специфічно активуються in vivo в механізмах гіперпігментації в ураженому епідермісі SLs.

3.3. Основні паракринні цитокіни та рецептори, відповідальні за активацію меланоцитів у SL

Серед наведених вище меланогенних цитокінів і відповідних їм рецепторів ми вперше визначили роль основного фактора росту фібробластів (bFGF) і пов’язаного з ростом онкогену (GRO) в епідермісі SL. Було виявлено, що основний FGF надмірно експресується в кератиноцитах людини, які піддавалися ультрафіолетовому випромінюванню, гомогенати якого мали чіткий потенціал для стимуляції меланогенезу та проліферації меланоцитів людини в культурі, хоча кофактори зі здатністю підвищувати рівні циклічного АМФ в основному необхідні для меланогенної стимуляції [23]. ]. Наша дослідницька група ідентифікувала GRO як меланогенний цитокін, який відіграє важливу роль у гіперпігментації, спричиненій фенілазонафтолом, після алергічної реакції на коричнево-жовту шкіру морської свинки [24,31]. Напівкількісна RT-PCR виявила відсутність змін у рівнях експресії генів bFGF і GRO в пошкодженому епідермісі SL порівняно з епідермісом без пошкоджень [2]. Відповідно до рівня експресії мРНК bFGF і GRO, імуногістохімія виявила відсутність різниці в інтенсивності імунного фарбування анти-bFGF (рис. 1c, d) і анти-GRO (рис. 1e, f) між ураженням SL і без ураження епідерміс [2]. Ці результати вказують на відсутність участі bFGF або GRO як внутрішніх меланогенних цитокінів у механізмі активації меланоцитів у SL.

У біологічному механізмі гіперпігментації, спричиненої UVB, експресія EDN1, вазоконстрикторного пептиду, спочатку виділеного з ендотеліальних клітин свиней [32], і mSCF [16] посилюється аутокринним способом під дією стимульованого UVB вивільнення інтерлейкіну ( IL)-1 через утворення активних форм кисню (АФК) [15]. Ці цитокіни змушують сусідні меланоцити посилювати експресію критично важливих меланінсинтезуючих ферментів тирозинази [14,33], EDNBR [34] і матриксного протеїну меланосоми PMEL17 [34], а також пов’язаних із проліферацією ферментів, таких як циклічна залежна кіназа (CDK)2. [34], які призводять до гіперпігментації на шкірі, яка піддається ультрафіолетовому випромінюванню. На основі основних меланогенних цитокінів, які, по суті, беруть участь в UVB-меланозі, далі ми визначили роль EDN1 у механізмі активації меланоцитів в епідермісі SL. Характеристика рівня експресії мРНК EDN1 в епідермісі за допомогою напівкількісного аналізу RT-PCR показала помітне збільшення експресії в середньому в 32-рази в епідермісі SL пошкодження порівняно з епідермісом без пошкоджень [4]. У відповідності з підвищеним рівнем експресії гена EDN1 спостерігалося посилення імунного фарбування анти-EDN1 в усьому епідермісі ураження SL (рис. 1g,h) [4].

На додаток до EDN1, далі ми визначили роль рецепторів EDN у механізмі активації меланоцитів, що лежить в основі SL. Зв’язування EDN з його рецептором є першим кроком у головному паракринному зв’язку між кератиноцитами та меланоцитами, який посилює пігментацію шкіри [11,14,35,36]. Рецептори EDN — це семитрансмембранні G-білкові рецептори, з’єднані з двома ізоформами (A і B), які специфічно взаємодіють з EDN1 і з усіма формами EDN (EDN1, EDN2 і EDN3) відповідно [37]. Що стосується інгібуючої дії антагоністів рецепторів EDN на EDN-стимульовану проліферацію меланоцитів людини в культурі, значний інгібувальний ефект виникав лише в присутності BQ 788, антагоніста рецептора анендотеліну B (EDNBR), але не BQ123 або BQ610, ендотеліну. Антагоніст рецептора (EDNAR) [9], який вказує на те, що сигналізація рецептора EDN1/EDN опосередковується через EDNBR. Напівкількісний RT-PCR аналіз експресії мРНК EDNBR показав, що серед різних типів клітин шкіри меланоцити є єдиним істотним типом клітин, які експресують EDNBR. Оскільки ми вже продемонстрували, що EDN1, що секретується кератиноцитами, запускає активацію внутрішньоклітинної протеїнкінази C (PKC) через EDNBR [35], ми визначили, чи був рівень експресії EDNBR також підкреслений у меланоцитах в пошкодженому епідермісі SL. Напівкількісний RT-PCR аналіз EDNBRmRNA в епідермісі SL продемонстрував помітне збільшення експресії в середньому в 68-разів в ураженому епідермісі SL [4]. Відповідно до підвищеної експресії мРНК EDNBR спостерігалося посилення імунного фарбування за допомогою анти-EDNBR, локалізованого в меланоцитах в ураженому епідермісі SL (рис. 1i,j) [4]. Сума цих результатів переконливо свідчить про узгоджене збільшення експресії EDN1 та його рецепторного зв’язку в ураженому епідермісі SL.

Базуючись на основних меланогенних цитокінах, залучених до UVB-меланозу, ми далі визначили роль SCF у механізмі активації меланоцитів в ураженому епідермісі SL. Ми вже повідомляли, що ультрафіолетове опромінення культивованих кератиноцитів людини, а також епідермісу людини значно стимулює експресію SCF як на генному, так і на білковому рівнях [15,16]. Напівкількісний RT-PCR аналіз мРНК SCF в епідермісі SL продемонстрував помітне збільшення експресії в середньому в 39-рази в епідермісі SL з ушкодженнями порівняно з епідермісом без уражень [2]. Вестерн-блоттинг SCF на шкірі шести пацієнтів із СЛ продемонстрував суттєве збільшення в середньому в 1.6-разів білка SCF в епідермісі SL з ушкодженнями порівняно з епідермісом без уражень [2].

Відповідно до підвищеного рівня експресії генів і білка SCF спостерігалося посилення імунного фарбування анти-SCF в ураженому епідермісі SL (рис. 1k,l) [2]. Існували суперечки щодо того, чи SCF, активований на рівні білка в ушкодженому епідермісі, є розчинним типом чи мембранно-зв’язаним типом. Якщо проникний через базальну мембрану розчинний SCF посилено регулюється в епідермісі, тучні клітини, присутні в дермі, повинні активуватися для проліферації та збільшення кількості. Оскільки фарбування толуїдиновим синім у SLs не показало жодного збільшення кількості тучних клітин у пошкодженій дермі SL [2], цілком імовірно, що тип SCF, активований у SLs, є мембранозв’язаним типом.

Окрім SCF, далі ми визначили роль рецептора SCF c-KIT у механізмі активації меланоцитів, що лежить в основі SL. Ми вже повідомляли, що ультрафіолетове опромінення культивованих меланоцитів людини, а також епідермісу людини значно стимулює експресію c-KIT як на генному, так і на білковому рівнях [15,38]. Крім того, у стимульованій UVB пігментації коричнево-жовтої шкіри морської свинки блокуюче антитіло до c-KIT значно скасувало збільшення кількості допа-позитивних меланоцитів, а також гіперпігментацію на ранній фазі індукованого UVB процесу пігментації [16] , що переконливо вказує на те, що зв’язування SCF з c-KIT відіграє важливу роль у активації меланоцитів, викликаній UVB, що призводить до гіперпігментації. Одночасно зі збільшенням експресії SCF на генному та білковому рівнях, рівень експресії генів його рецептора c-KIT також збільшувався в середньому в 214-рази в пошкодженому епідермісі SL [2]. Відповідно до підвищеної експресії мРНК c-KIT спостерігалося посилення імунного фарбування антитілом c-KIT, локалізованим у меланоцитах в ураженому епідермісі SL (рис. 1m, n) [2]. Це свідчить про скоординоване збільшення експресії SCF та його рецептора c-KIT в ураженому SL епідермісі.

З іншого боку, інші групи висунули гіпотезу про те, що фактор росту кератиноцитів (KGF)/рецептор KGF (KGFR) відіграють важливу роль в ініціації утворення SL та у підвищенні пігментації лише в епідермісі на ранніх стадіях SL [25]. В ушкодженому епідермісі [30] та/або дермі [25] SL експресія KGF підвищується лише на рівні імунного фарбування, хоча необхідні подальші дослідження експресії його генів і білка для будь-яких остаточних висновків щодо нього як внутрішнього цитокіну, що спричиняє SL. Хоча відомо, що IL-1 змушує кератиноцити стимулювати вироблення KGF, залишається незрозумілим, як експресія KGF регулюється в епідермісі ураження, де експресія IL-1 значно знижена [2]. Звичайно, слід визначити, чи TNF (який посилено регулюється в ураженому епідермісі) має здатність стимулювати виробництво KGF. Оскільки експресія KGF у шкірі в основному обмежується дермальними фібробластами, вірогідно, що підвищена експресія KGF дермальними фібробластами в пошкодженій дермі SL [25] пов’язана як із збільшенням проліферації кератиноцитів, так і зі стимульованим меланогенезом. Таким чином, ймовірно, що дермальні фібробласти постійно активуються під впливом ультрафіолетового випромінювання для вивільнення KGF, який діє прямо чи опосередковано через кератиноцити, модулюючи експресію SCF, сприяючи гіперпігментації SL [25].

Далі ми визначили біологічні механізми, за допомогою яких секреція EDN1 регулюється в ураженому епідермісі SL. Добре відомо, що біологічні фактори, пов’язані зі стимуляцією секреції EDN кератиноцитами людини, включають IL-1, фактор некрозу пухлини (TNF) і ендотелінперетворюючий фермент (ECE)-1. Наші висновки щодо стимуляції аутокринних цитокінів, пов’язаної з меланозом UVB, показали, що підвищення регуляції IL-1 головним чином відповідає за стимуляцію виробництва EDN1 і SCF в кератиноцитах людини, які піддаються впливу UVB [12,16]. Таким чином, було виявлено, що IL-1 і є потужними стимуляторами секреції EDN із затримкою піку в кератиноцитах людини в культурі, що нагадує схему секреції EDN, спричиненої УФВ [11]. Також добре відомо, що ультрафіолетове опромінення значно стимулює вивільнення IL-1, але не IL-1 у культивованих кератиноцитах людини, і що блокуюче антитіло до IL-1 значно скасовує підвищену секрецію EDN1 [11], який вказує на те, що гіперпігментація, спричинена ультрафіолетовим випромінюванням, опосередковується через активацію епідермальних меланоцитів у результаті підвищеної секреції EDN1 кератиноцитами, які піддаються впливу ультрафіолетового випромінювання. Крім того, виявлено, що експресія білка mSCF значно стимулюється обробкою IL-1 у кератиноцитах людини в культурі [16]. Таким чином, далі ми визначили, чи IL-1 також регулювався для стимуляції експресії EDN1 та/або SCF в ураженому епідермісі SL. Цікаво, що напівкількісний аналіз RT-PCR показав, що експресія мРНК IL-1 є досить зниженою в ураженому епідермісі [16]. Згідно з цим аналізом RT-PCR, імуногістохімія з антитілами до IL-1 виявила слабше імунне фарбування в ураженому епідермісі, ніж в неураженому епідермісі (рис. 1o,p) [2], що свідчить про те, що IL{ {33}} не відповідає за підвищену експресію EDN1 і SCF в ураженому епідермісі SL.

Стосовно механізмів, що лежать в основі підвищеної експресії EDN1 у SL, на додаток до IL-1 Tsuboiet et al. бути потужним стимулятором (у 10-раз) секреції EDN культивованими кератиноцитами людини [39]. Що стосується механізму, що лежить в основі підвищеної експресії SCF в SL, далі ми досліджували вплив TNF на експресію SCF у культивованих кератиноцитах людини. Вестерн-блоттинг з використанням анти-SCF-антитіл продемонстрував, що TNF значно стимулює продукцію mSCF [15]. Таким чином, далі ми визначили, чи регулюється TNF, щоб стимулювати експресію EDN1 та/або SCF в ураженому епідермісі SL. Цікаво, що напівкількісний RT-PC-аналіз показав, що експресія мРНК TNF значно посилюється в ураженому епідермісі SL [2]. Відповідно до аналізу RT-PCR, імуногістохімія з антитілом проти TNF виявила сильніше імунне фарбування в ураженому епідермісі SL, ніж у неураженому епідермісі (рис. 1q,r) [2]. Таким чином, можна було припустити, що підвищена експресія TNF головним чином відповідає за підвищену експресію EDN1 і SCF в ураженому епідермісі SLs.

Що стосується механізму, який бере участь у посиленні експресії EDN1, ми потім визначили, чи активується ECE-1 в ураженому епідермісі SL. Оскільки в цей час жодне дослідження не описувало експресію ECE-1 в кератиноцитах людини, ми охарактеризували ECE-1 у культивованих кератиноцитах людини порівняно з ендотеліальними клітинами. Аналіз активності ECE-1 в різних типах клітин шкіри показав, що кератиноцити людини, а не меланоцити людини, мають активність ECE-1, яка спостерігається в меншій мірі, ніж в ендотеліальних клітинах [40]. Вестерн-блоттинг із використанням антитіл, які ми підготували до ECE-1, продемонстрував, що білок ECE-1 існує в ендотеліальних клітинах людини, фібробластах людини та кератиноцитах людини, але не в меланоцитах людини [40]. Аналіз активності ECE-1 у супернатантах після імунопреципітації антитілом ECE-1 продемонстрував, що ендотеліальні клітини та кератиноцити людини мають активність ECE-1, яку можна виявити при pH 6,8, що добре корелює з ECE{ {15}} імунопреципітованих нашим антитілом до ECE-1 [40]. Напівкількісний RT-PCR аналіз рівнів мРНК ECE-1 показав, що IL-1, але не TNF, мав незначний стимулюючий ефект на експресію гена ECE-1 у культивованих кератиноцитах людини [40]. Відповідно до аналізу RT-PCR, вестерн-блоттинг показав, що IL-1, але не TNF, стимулював експресію білка ECE-1 у культивованих кератиноцитах людини [40]. Нарешті, ми визначили, чи ECE-1 також посилено регулюється, щоб стимулювати експресію EDN1 в пошкодженому епідермісі SL. У зв’язку з відсутністю стимулюючого ефекту TNF, який посилюється в SL, не було різниці в рівні експресії мРНК ECE-1 між пошкодженим і неушкодженим епідермісом SL [2], що свідчить про те, що ECE-1 не відповідає за підвищену секрецію EDN1 у SL.

Фігура 3 показує підсумок аутокринної стимуляції кератиноцитів людини в культурі. Що стосується біологічних механізмів, що призводять до активації сигнальних каскадів EDN і SCF [9], наші дослідження in vitro свідчать про цікавий контраст, що хоча регуляція IL-1 головним чином відповідає за стимуляцію виробництва EDN1 і SCF в UVB- меланозу, активація TNF в основному пов’язана зі стимульованим виробництвом тих самих двох цитокінів у SL.

3.4. Синергічні стимулюючі ефекти комбінації EDN1 і SCF

Ми вже повідомляли, що існує синергія в стимульованому синтезі ДНК у культивованих меланоцитах людини, що вимірюється за включенням 14C-тимідину у спільній присутності SCF та EDN1 [41]. Також спостерігався подібний синергізм у стимуляції синтезу меланіну, як виміряно за включенням 14C-тіоурацилу в культивовані меланоцити людини за спільної присутності SCF та EDN1 [41]. Навпаки, не було такої синергії між EDN1 і колонієстимулюючим фактором гранулоцитарних макрофагів (GM-CSF) або HGF [13,42]. Що стосується сигнальних механізмів, залучених до цих синергічних ефектів, ми виявили, що перехресна передача сигналів SCF і EDN1 була ініційована через тирозинфосфорилювання c-KIT, яке опосередковано стимулюється активованим PKC, що посилює утворення Shc-Grb{ {18}}Комплекс SOS, який, у свою чергу, призводить до синергічної активації кіназної петлі Ras/Raf-1/MEK/MAP [41].

3.5. Взаємодія між EDN/EDNBR та SCF/c-KIT

Далі ми визначили, чи викликає підвищене виробництво SCF експресію EDNBR або його спорідненість з лігандом EDN у меланоцитах людини на додаток до його стимулюючого ефекту на їх проліферацію. Вестерн-блоттинг показав, що SCF може стимулювати експресію білка EDNBR у культивованих меланоцитах людини [43]. Коли спорідненість EDNBR до його ліганду оцінювали в культивованих меланоцитах людини за допомогою аналізу зв’язування ліганду, виявилося, що зв’язування EDN1, міченого 125I, з EDNBR значно посилюється через два дні після інкубації з SCF [43]. У сукупності ці результати вказують на те, що SCF, експресований на ранній фазі, може посилювати експресію EDNBR, що спричиняє підвищення чутливості меланоцитів до пізнішої секреції EDN1. З іншого боку, коли культивовані меланоцити людини обробляли протягом 48 годин EDN1 у концентрації 10 нМ, аналіз зв’язування ліганду з використанням 125I-SCF показав, що EDN1 помітно посилює афінність зв’язування SCF з рецептором c-KIT [43].

4. Резюме патобіології СЛ

У таблиці 1 наведено зведення паракринних цитокінових мереж, які виникають при різних епідермальних гіперпігментних розладах. Що стосується цих мереж, SL дуже схожі на UVB-меланоз, за ​​винятком причинних цитокінів, таких як TNF, для збільшення виробництва EDN1 і SCF.

Щодо біологічних механізмів, що призводять до посилення активності сигнальних каскадів EDN і SCF, наші дослідження in vitro показали, що, хоча активація IL-1 головним чином відповідає за стимулювання виробництва EDN1 і SCF при УФ-меланозі, активація TNF пов'язаний зі стимульованим виробництвом тих самих двох цитокінів у SL. На рисунку 4 показаний підсумок складних взаємозв’язків між зв’язками SCF і EDN1 в епідермісі SL. Це включає синергізм між SCF і EDN1, а також активацію EDNBR і c-KIT SCF і EDN1 відповідно. Вивільнення TNF кератиноцитами симулює вироблення SCF і EDN аутокринним способом, обидва з яких виявляють синергетичний ефект на активацію меланоцитів, а також стимулюючий ефект на експресію їхніх відповідних рецепторів, c-KIT і EDNBR. Ці синергетичні та міжклітинні взаємодії сприяють активації меланоцитів більшою мірою в ушкодженому епідермісі SL, ніж в епідермісі, підданому ультрафіолету B, що призводить до більш інтенсивної гіперпігментації SL.

У сукупності наші результати свідчать про те, що два сигнальні каскади, EDN1/EDNBR і mSCF/c-KIT, відіграють внутрішню та скоординовану роль, підкреслюючи мітогенез і меланогенез меланоцитів у гіперпігментованому епідермісі SL. На малюнку 5 показано біологічну послідовність механізмів гіперпігментації, залучених до СЛ, де невідомі пухлиногенні фактори внаслідок кумулятивного пошкодження ДНК у далекому минулому змушують кератиноцити виробляти та секретувати TNF. Таким чином, TNF змушує кератиноцити надмірно виробляти меланогенні цитокіни, такі як SCF і EDN1, аутокринним способом, запускаючи сусідні меланоцити для стимуляції синтезу меланіну, що призводить до епідермальної гіперпігментації.

5. Терапевтичні підходи до місцевого лікування

Базуючись на скоординованій меланогенній паракринній мережі та активованих сигнальних механізмах, що призводять до активації меланоцитів в пошкодженому епідермісі SL, блокування необхідної меланогенної внутрішньоклітинної сигналізації є бажаним терапевтичним підходом для досягнення антипігментних ефектів на SL. Такий підхід може спричинити гіпопігментацію, але не повинен бути ефективним на шкірі без пошкоджень, де такі сигнальні каскади не активуються в меланоцитах. З іншого боку, інгібування активності тирозинази є ще одним підходом до полегшення гіперпігментації в SLs, хоча це може спричинити гіпопігментацію і також може бути ефективним для шкіри без пошкоджень.

5.1. Блокування основної меланогенної внутрішньоклітинної передачі сигналів

Оскільки майже всі мутації, що призводять до генетичних гіпопігментних розладів, відбуваються в осі EDN1/EDNBR і SCF/c-KIT [44] і оскільки існує синергетичний стимулюючий ефект EDN1/SCF на клітинну проліферацію та меланізацію в культивованих меланоцитах людини, можна припустити, що блокування передача сигналів EDN1/EDNBR або SCF/c-KIT може запобігти гіперпігментації внаслідок координовано підвищеної експресії EDN1 та SCF, оскільки синергічний стимулюючий ефект не відбувається. Тому ми спробували досягти антипігментних ефектів на SL шляхом блокування сигнальної лінії EDN/EDNBR.

EDN-активований внутрішньоклітинний сигнальний шлях складається зі зв’язування з EDNBR, активації PKC, каскаду MAP-кінази та каскаду cAMP/PKA [34,35,41]. Таким чином, ці клітинні дії ініціюються зв’язуванням EDN1 з G-білком EDNBR, що супроводжується послідовними процесами передачі сигналів, що складаються в основному з PKC і MAPK. Після зв’язування зі своїм рецептором EDN1 запускає гідроліз поліфосфоінозитиду шляхом активації фосфоліпази С, яка генерує інозитол-трисфосфати (IP3) і діацилгліцерин, мобілізуючи внутрішньоклітинний Ca плюс плюс і активуючи PKC відповідно. Активація PKC досягається шляхом її транслокації з цитозолю на плазматичну мембрану та активує Raf-1 шляхом фосфорилювання. Таким чином, Raf-1 є точкою конвергенції між шляхами PKC і MAPK. Активація Raf-1 призводить до активації ряду проміжних сполук шляху MAPK, що складаються з MEK, ERK і RSK. Фосфорильований Raf-1 активує MEK шляхом фосфорилювання, а активований MEK фосфорилює ERK. Потім активована ERK фосфорилює асоційований з мікрофтальмією транскрипційний фактор (MITF) на серині 75, що призводить до залучення коактиватора для регуляції експресії генів кількох меланогенних факторів [41]. Одночасно активований MAPK призводить до активації RSK, який фосфорилює CREB, що призводить до транскрипції MITF. З іншого боку, активований PKC взаємодіє з каскадом аденілциклази для отримання цАМФ [8], що призводить до активації PKA, який також активує CREB шляхом фосфорилювання, що призводить до посилення експресії MITF. Підвищений рівень білка MITF стимулює експресію специфічних для меланоцитів генів, включаючи тирозиназу, PMEL17, EDNBR, c-KIT і CDK2.

Оскільки кілька внутрішньоклітинних сигнальних шляхів призводять до стимульованого меланогенезу в меланоцитах, а сигнальний каскад EDN специфічно пов’язаний із шляхом PKC, який включає мобілізацію кальцію з ендоплазматичного ретикулуму [13], ми використали аналіз мобілізації кальцію для скринінгу антагоністів EDNBR з різних екстрактів трав. Мобілізація кальцію з ендоплазматичного ретикулуму відбувається після генерації IP3 і діацилгліцерину внаслідок гідролізу поліфосфоінозитиду через активовану фосфоліпазу С. Коли людські меланоцити обробляють у культурі за допомогою EDN1, мобілізація кальцію, що виявляється за допомогою реагенту fura-2AM, викликає флуоресценцію після зв’язування з вивільненим кальцієм, про що свідчить швидка поява жовтого кольору, який можна виміряти в реальному часі за допомогою мікроскопія цифрового зображення. Перевіривши багато рослинних екстрактів, ми виявили, що попередня інкубація з екстрактом Matricaria chamomilla перериває мобілізацію кальцію, викликану EDN1 [1], що свідчить про те, що він може служити ефективним антагоністом проти EDNBR. M. chamomilla, широко відома як ромашка, є однорічною рослиною складної родини Asteraceae. M. chamomilla є найпопулярнішим джерелом рослинного продукту ромашки, хоча інші види також використовуються як ромашка.

На підставі інгібуючої дії зразків, фракціонованих з екстракту M. chamomilla, на EDN{{0}}індуковану мобілізацію кальцію в культивованих меланоцитах людини, ми визначили спіроефір як його активну сполуку з сильною здатністю переривати мобілізацію кальцію (рис. 6). ) [1]. Існує два ізомери спіроефіру (E і Z), і Е-ізомер спіроефіру може повністю скасувати мобілізацію кальцію при концентраціях понад 1 мкМ. Обробка E-ізомером спіроефіру в концентраціях 0.2 і 1,0 відсотка значно зменшила пігментацію, спричинену UVB, на коричнево-жовтій шкірі морської свинки, що оцінювалося за значенням ∆L, що вказує на блокування опосередкованого EDN сигнального каскаду ефективний у запобіганні гіперпігментації, спричиненої UVB. Це важливий доказ in vivo, який демонструє внутрішню участь каскаду EDN в УФ-B-меланозі. З іншого боку, як і очікувалося, при попередньому або спільному інкубуванні в культурі меланоцитів екстракт M. chamomilla мав потужну здатність скасовувати EDN1-індуковане збільшення синтезу ДНК (як виміряно за включенням 14C-тимідину), а також синтезу меланіну (як виміряно за включенням 14C-тіоурацилу) культивованими меланоцитами людини. У паралельному дослідженні з використанням культивованих кератиноцитів людини ми підтвердили, що екстракт M.chamomilla не має інгібуючої дії на індуковану IL-1 -секрецію EDN1 [1]. Крім того, використовуючи тирозинази, отримані з меланоцитів людини, ми підтвердили, що екстракт M. chamomilla не має інгібіторної дії на активність тирозинази in vitro на відміну від чітких інгібіторних ефектів добре відомих відбілюючих агентів, койєвої кислоти та арбутину [1]. Коли екстракт M. chamomilla наносили щодня місцево на коричнево-жовту шкіру морської свинки протягом двох тижнів відразу після опромінення UVB, інтенсивність пігментації, викликаної UVB, значно зменшилася порівняно з лікуванням 10-відсотковим арбутином або лише носієм [1].

У клінічному дослідженні на людях було виявлено, що місцеве нанесення екстрактів M. chamomilla на шкіру передпліччя людини, яка була піддана ультрафіолетовому випромінюванню, протягом шести тижнів відразу після опромінення значною мірою запобігає гіперпігментації, спричиненій ультрафіолетовим випромінюванням, що вимірюється вимірювачем різниці кольорів і виражається як ∆ значення L.

Використовуючи віск типу палички, що містить екстракт M. chamomilla, ми перевірили клінічний вплив на пігментацію в SL. У цьому клінічному дослідженні кожну пігментовану пляму досліджували на предмет зміни кольору, а також оцінювали ступінь клінічного покращення та валідність. Клінічна оцінка, проведена в Токійському жіночому медичному університеті, показала, що двомісячне лікування екстрактом M.chamomilla призвело до помітного покращення у 48 відсотків суб’єктів і незначного покращення у 40 відсотків [1]. У змінах рівня пігментації, виміряних за значеннями ∆L, у всіх пацієнтів із СЛ спостерігалося чітке збільшення значення ∆L більше двох разів, що є помітним рівнем, після лікування протягом 2–3 місяців. Було значне зниження рівня пігментації, що вимірюється значеннями ∆L між 0, 1 і 2 місяцями після лікування (рис. 7). Загалом, клінічна оцінка протягом трьох місяців показала, що лікування екстрактом M. chamomilla призвело до помітного покращення у 42 відсотків суб’єктів, у 12 відсотків – помірного покращення, а у 25 відсотків – незначного. Інше клінічне випробування, проведене в двох споріднених дерматологічних лікарнях у Токіо, продемонструвало, що лікування екстрактом M. chamomilla поступово зменшувало пігментацію та через шість місяців призвело до більш ніж незначного покращення приблизно у 70 відсотків суб’єктів, у тому числі 10 відсотків із зникненням і 15 відсотків із помітним покращенням. . Було два випадки, коли SL повністю зникли приблизно через шість місяців лікування, при цьому значення ∆L зросли до 8,4 і 6,9 після шести місяців лікування (рис. 8) [1].

На завершення, щодо терапевтичних підходів для SLs шляхом блокування основної меланогенної внутрішньоклітинної передачі сигналів, наведені вище клінічні дослідження показують, що блокування EDN1/EDNBR-асоційованої сигналізації є ефективним терапевтичним лікуванням для SLs без будь-яких ефектів гіпопігментації.

5.2. Пригнічення активності тирозинази

Інгібування активності тирозинази є ще одним підходом до полегшення гіперпігментації в SLs, який має можливі недоліки гіпопігментації, але потенційну користь також ефективний на шкірі без пошкоджень. Оскільки відбілювачі, як правило, призначені для лікування УФ-B-меланозу, клінічних подвійних сліпих досліджень потенційних антипігментних ефектів відбілюючих агентів на SLs не проводилося. Ми провели подвійне сліпе дослідження половини обличчя за участю 27 японських жінок-добровольців із СЛ. У цьому клінічному дослідженні лосьйони з 6-відсотковим вмістом L-аскорбат-2-фосфату 3 Na (APS) або без нього (тестовий лосьйон/лосьйон плацебо відповідно) наносили місцево на обличчя двічі на день протягом 24 тижнів [45]. Репрезентативні фотографії облич суб’єктів № 012 і № 016 до та після лікування показали, що рівень пігментації оброблених тестовим лосьйоном SL трохи зменшився разом із незначним зменшенням шкірних покривів без пошкоджень, оброблених тестовим лосьйоном [ 45]. Навпаки, рівень пігментації SL, оброблених плацебо-лосьйоном, і шкіра без пошкоджень залишилися незмінними. Тоді як значення L у досліджуваних SL, оброблених лосьйоном, значно зросли після 24 тижнів лікування, значення L у SL, оброблених плацебо-лосьйоном, залишилися незмінними (рис. 9) [45]. Порівняння значень oL до та після лікування виявило значно вищі значення oL у досліджуваних SL, оброблених лосьйоном, ніж у SL, оброблених лосьйоном плацебо (рис. 9). Ці висновки свідчать про те, що тестовий лосьйон, що містить APS, мав значно сильніший антипігментний ефект на SL, ніж лосьйон плацебо. У той час як значення L у тестовій шкірі без пошкоджень, обробленої лосьйоном, значно підвищилися після лікування протягом 24 тижнів, значення L у шкірі без пошкоджень, обробленої плацебо-лосьйоном, залишилися незмінними. Порівняння значень oL до та після лікування виявило значно вищі значення oL у тестовій шкірі без пошкоджень, обробленої лосьйоном, ніж у шкірі без пошкоджень, обробленій лосьйоном плацебо [45]. Ці результати свідчать про те, що досліджуваний лосьйон мав значно сильніший відбілюючий ефект на неушкоджену шкіру, ніж плацебо-лосьйон. Порівняння антипігментних ефектів між SL і шкірою без пошкоджень показало, що, хоча між до та після лікування тестовим лосьйоном у SL були значно вищі значення oL, ніж у шкірі без пошкоджень, значення oL мали подібний рівень у СЛ та шкірі без пошкоджень без будь-якої істотної різниці між ними [45].

Цистанхе пригнічує активність тирозинази.

Співвідношення між значеннями L та індексами меланіну для всіх вимірювань під час цього клінічного дослідження виявило значну кореляцію між ними обома. Цей результат показав, що значення 2.0 ∆L було приблизно еквівалентним індексу меланіну 20 ∆ із 10-разово вищою чутливістю індексу меланіну, ніж значення L. Порівняння між значеннями L та індексами меланіну для кожного вимірювання на тижні 0 і 24 на SL виявило значні кореляції. Ці порівняння між значеннями L та індексами меланіну показали, що спостерігався помітний зсув розподілу в бік світлішого кольору, такий як більше значення L і менший індекс меланіну в SL, оброблених тестовим лосьйоном, тоді як такого чіткого зсуву розподілу в лосьйоні плацебо не було. -оброблені SLs [45].

Підсумовуючи, щодо терапевтичного підходу до СЛ з використанням інгібітору тирозинази, сума наведених вище висновків переконливо вказує на те, що АФС має слабкий, але значний антипігментаційний ефект на СЛ і значний ефект відбілювання навіть на здоровій шкірі нормального кольору, без будь-якого ефекту гіпопігментації.

6. Висновки

На завершення, щодо механізмів активації меланоцитів і терапевтичного місцевого лікування СЛ, ґрунтуючись на наведених вище висновках щодо механізму активації меланоцитів у СЛ, а також клінічної ефективності, отриманої за допомогою блокатора сигналу EDN та інгібітора тирозинази, настійно припущено, що комбіноване лікування Блокатор сигналу EDN та інгібітор тирозинази є бажаним терапевтичним засобом лікування СЛ.

таблетки цистанхи

Для отримання додаткової інформації натисніть на зображення.