Фенілетанолглікозиди з Cistanche Tubulosa пригнічують активацію зірчастих клітин печінки та блокують проведення сигнальних шляхів у TGF-01/smad як потенційні засоби проти фіброзу печінки
Mar 05, 2022
Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com
Шу-Пінг Ю, Лун Ма, Цзюнь Чжао, Ши-Лей Чжан і Тао Лю
Анотація: Цистанка трубчастаце традиційний китайський фітопрепарат, який широко використовується для регуляції імунітету тафенілетаноїдні глікозиди(CPhGs) є одними з основних компонентів, відповідальних за цю діяльність. Попередні дослідження показали профілактичну та терапевтичну дію CPhG на фіброз печінки щурів, індукований бичачим сироватковим альбуміном (BSA). Метою дослідження було оцінити дію CPhG та мономерів проти фіброзу печінки.ехінакозидіактеозидшляхом інгібування активації зірчастих клітин печінки (HSC), блокування провідності сигнальних шляхів у трансформуючому факторі росту-p1 (TGF-p1)/smad, і визначити їхню гепатопротекторну активність in vitro. Проліферація HSC явно пригнічувалася після лікування CPhGs (100,50 ^г/мл)/ехінакозидом (500,250,125 ^г/мл)/актеозидом (6,3 ^г/мл), зі значеннями IC50 119,125,520,345 та 6,999 г/мл. мл, відповідно, в аналізі MTT. Різні концентрації CPhGs/ехінакозид/актеозидне впливав на клітинну токсичність HSC згідно з вимірюваннями лактатдегідрогенази (ЛДГ). Різні концентрації CPhGs/ехінакозид/актеозидпідвищував рівень мРНК і експресію білка smad7 і знижував рівні мРНК smad2, smad3 і експресію білка smad2, фосфо-smad2 (p-smad2), smad3, фосфо-smad3 (p-smad3) у HSC. Підсумовуючи, ці результати демонструють, що CPhGs/ехінакозид/актеозидможе блокувати проведення сигнальних шляхів у TGF-p1/smad та пригнічувати активацію HSC, що свідчить про те, щоC. tubulosaтому може бути потенційним фітопрепаратом для лікування фіброзу печінки.
Ключові слова: Цистанка трубчаста; фенілетанолглікозиди зЦистанхе(CPHGs);ехінакозид; актеозид; зірчасті клітини печінки (ЗСК); TGF-p1/smad
1. Введення
стають проліферативними та фіброгенними, згодом накопичують ECM і зрештою диференціюються у фіброгенні міофібробластоподібні клітини. Основним профіброгенним медіатором вважається трансформуючий фактор росту-.1 (TGF-p 1). Сигнальний шлях, пов’язаний із TGF-&1, є важливим механізмом фіброзу печінки, і він головним чином включає smad-залежну та smad-незалежну передачу сигналів, а smad-залежний шлях трансдукції сигналу вважається основним каналом передачі сигналу TGF-p1 . Таким чином, блокування сигнального шляху TGF-p1/smad може пригнічувати вироблення колагену та, зрештою, полегшувати фіброз печінки, що зробило цей шлях важливою мішенню в дослідженнях ліків проти фіброзу печінки в останні роки.
Незважаючи на високу захворюваність на фіброз печінки у всьому світі, загальноприйнятої антифіброгенної терапії немає [2–4]. Традиційні китайські трав’яні ліки (TCHM) представляють великий інтерес для лікування захворювань печінки, оскільки деякі з них можна використовувати в терапевтичних цілях для лікування та профілактики фіброзу печінки. В даний час багато досліджень зосереджені на потенційних антифіброгенних препаратах, які використовувалися як TCHM протягом тисяч років [5].
Cistanche tubulosa W (родина Orobanchaceae)fa, паразитична рослина, широко вирощується в південному регіоні Сіньцзян у Китаї [6]. Люди використовують його для активізації нирок, живлення крові, розслаблення кишечника та затримки старіння без побічних ефектів, і офіційно внесено до китайської фармакопеї [7]. C. tubulosa містить різноманітні активні компоненти, включаючи фенілетаноїдні глікозиди (CPhG), іридоїди та полісахариди. Серед багатьох активних компонентів у C. tubulous, CPhGs, які демонструють ряд біоактивностей (антиоксидант, проти втоми, радіорезистентність тощо), є основними характерними компонентами цієї рослини. Останніми роками повідомляється, що CPhGis мають надмірну гепатопротекторну дію Hent і можуть поглинати радикали дерев, захищати печінкові мембрани та виявляти імунорегуляторні ефекти, пригнічення апоптозу, пригнічення експресії поверхневого антигену гепатиту B (HBs Ag) і гепатиту B активність реплікації ДНК антигену (HBeAg) і вірусу гепатиту B (HBV) тощо. Рівень ДНК HBV є найбільш надійним показником, який безпосередньо відображає активність реплікації вірусу, що є ключовим фактором у визначенні природного перебігу хронічних інфекцій HBV, моніторинг ефекту ОП противірусної терапії та оцінка прогнозу гострої та хронічної інфекції ВГВ. Серологічні показники виявлення HBV включають переважно HBsAg, HBeAg тощо [8—11]. Проте в літературі є кілька повідомлень про антифіброзну дію CPhGs на печінку. Попередні дослідження показали профілактичну та терапевтичну дію CPhG на індукований бичачим сироватковим альбуміном (BSA) фіброз печінки у щурів, але антифіброгенну активність CPhG та його основних мономерів (ехінакозид і актеозид, рис. 1) ніколи не оцінювали in vitro.
органічні Cistanche tubulosa
2. Результати
2.1. Кількісне визначення CPhGs
ЦФГ вC. tubulosaмістить два глікозиди фенілетового спирту: ехінакозид і актеосид, і їх вміст у CPhGs було виявлено аналізом ВЕРХ (рис. 1) і становив 42,71 відсотка 土 0.42 відсотка та 14,27 відсотка 土 0.18 відсотків відповідно.
2.2. Інгібуюча активність CPhG, ехінакозиду та актеозиду на HSC-T6
CPhG, ехінакозид і актеозид (62.5-500 卩г/мл) пригнічували життєздатність клітин HSC залежно від концентрації. CPhG та актеозид показали помітну інгібіторну активність щодо клітин HSC, при цьому значення 50-відсоткового пригнічення активності росту клітин (IC50) становили 119,125 昭/мл та 6,999 昭/мл відповідно. Ехінакозид демонстрував помірну інгібіторну активність (IC50, 520,345 昭/мл; таблиця 1 і малюнок 2).
2.3. Клітинна токсичність CPhGs, Echin acoside та Acteorida на HSC
Лактатдегідрогеназа (ЛДГ), стійкий цитоплазматичний фермент, присутній у всіх клітинах, швидко вивільняється в супернатант клітинної культури після пошкодження плазматичної мембрани. Активність ферменту в супернатанті культури корелює з часткою лізованих клітин [12]. Як показано в таблиці 2, при лікуванні різними концентраціями C PhG, ехінакозиду та актеозиду, хоча активність ЛДГ показала незначне підвищення порівняно з групою клітинного коірконтролю, різниця не була статистично значущою (p > 0).05 ), що вказує на те, що більшість клітинних мембран зберігають свою цілісність, і інгібування CPhGs, ехінакозиду та актеозиду на HSC не є наслідком неспецифічної клітинної токсичності.
2.4. Вплив CPhGs, Echinacoside та Acteosde на проліферацію HSC, індуковану TGF-^i
Проліферація, активація та диференціювання HSC регулюються різними факторами. Серед різноманітних факторів, які беруть участь у фіброзі печінки, TGF{{0}} вважається найважливішим, оскільки він може активувати HSC, сприяти диференціюванню міофібробластів, збільшувати синтез ECM та пригнічувати деградацію ECM, вивільняти хемокіни та цитокіни, що беруть участь у фіброзі печінки [13]. У цьому дослідженні, за винятком контрольної групи, стаціонарні HSC стимулювали TGF-P1 in vitro для моделювання формування раннього фіброзу печінки та для дослідження впливу CPhG, ехінакозиду та актеозиду на TGF-p1- індукована проліферація HSC. Як показано в таблиці 3, порівняно з контрольною групою група TGF-61 значно сприяла проліферації HSC (p < 0.01).="" порівняно="" з="" групою="" tgf-p1,="" tgf-p1="" плюс="" cphgs="" (tc)="" (50,100="" 卩g/ml,="" p="">< 0,05),="" tgf{{18}="" }="" плюс="" ехінакозид="" (те)="" (125,="" 250,="" 500="" мкг/мл,="" р="">< 0,05),="" tgf-p1="" плюс="" актеозид="" (та)="" (3,0,="" 6,0="" мкг/мл,="" р="">< 0,05)="" —="" усі="" вони="" надзвичайно="" інгібували="" проліферацію="" hsc,="" індуковані="" tgf-|3="" 1="" різним="">
2.5. Експресія мРНК smad2)smad3 та smad7 після втручання CPhGs, ochmacoside та acteaside на HSCs
Smad3 і smad2 є ключовими нижніми ефекторами сигнального шляху TTGF-p [14,15], а smad7 є інгібітором сигналу smad. Теоретично, підвищена експресія smad7 або знижена експресія smad2/smad3 може блокувати проведення сигнальних шляхів у TGF-p 1/smad. Як показано на малюнку 3, кількісний ПЛР-аналіз у реальному часі показав, що експресія мРНК smad2 і smad3 вказує на нижчий рівень, тоді як smad7 вказує на більш високі рівні в контрольній групі порівняно з групою TGF-|31. У групі TC (25, 50, 75,100 |дг/мл) рівень мРНК smad2 (p < 0.{{37="" }}5)="" і="" smad3="" (p=""><0,01) були="" значно="" знижені="" порівняно="" з="" групою="" tgf-pf="" і="" навіть="" були="" подібними="" до="" контрольної="" групи;="" у="" той="" же="" час="" рівень="" мрнк="" smad7="" був="" значно="" підвищений="" у="" групі="" тс="" (50,="" 75="" 100="" мкг/мл)="" (p="">< 0,05,="" p="">< 0,05,="" p="">< 0,01="" відповідно).="" однак;="" експресія="" smad7="" вказує="" на="" тенденцію="" до="" зростання="" в="" групі="" тс="" 25="" мкг/мл="" порівняно="" з="" групою="" tgf-p1="" (рис.="">
Тим часом, порівняно з групою TGF-p1, експресія мРНК smad2 і smad3 була значно знижена в TE (62,5, 125, 250, 500 卩g). /мл) у групі (p < 0.01),="" а="" експресія="" мрнк="" smad7="" була="" значно="" збільшена="" в="" групі="" te="" (125,="" 250="" 500="" 昭/мл)="" (p="">< 0,01)="" (малюнок="" 4).="" .="" подібним="" чином,="" група="" та="" (0,75,="" 1,5,="" 3,0,="" 6,0="" мкг/мл)="" також="" показала="" ту="" саму="" тенденцію="" (рис.="">
2.6. Вплив CPhGs, Echinacoside та Ac)eosids на T GF-^i/smad сигнальний шлях у HSC
Сигнальний шлях TGF-p 1/smad залежить від smad2, smad3, фосфо-smad2 (p-smad2), фосфо-smad3 (p-smad3) і smad7, де p-smad2, p-smad3 є активованими формами smad2 і smad3. У цьому дослідженні були проаналізовані рівні білків omad2, smad3, p-smad2, p-smsd3 і smad7. Вестерн-блоттинг виявив підвищення рівнів smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 за допомогою TGF-p1 та інгібування цього підвищення за допомогою CPhGs, екхінакозиду та актеозиду; тим часом, Wesiern-blot аналіз виявив підвищення рівня smad7 за допомогою CPhG, ехінакозиду та актеозиду. (Рис. 6—8).
Як показано на малюнку 6, порівняно з групою c on2rol (експресія білка smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 була значно збільшена, а експресія білка smad7 була знижена в групі TGF-p1. У TC (25 , 50, 75, 100 昭/мл) груп препаратів, smad/ (Малюнок 6A), p-smad2 (Малюнок 6B), smad 3 (Малюнок 6C), p -smad3 (Рис. 6D) експресія була значно нижчою, ніж у групі TGF-p1 (卩 < 0,01), а експресія білка smad7 (Рис. 6E) була вищою, ніж у групі TGF-S1 (p < 0,01) (Рис. 6).
У той же час експресії білків smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 і smad7 вимірювали після втручання ехінакозиду та актеозиду на HSC. Як показано на малюнках 7 і 8, рівні експресії білка smad2, smad3, p-smad2 і p-smad3 були значно пригнічені (p < 0.05="" або="" p="">< 0).01="" ),="" рівень="" експресії="" білка="" smad7="" був="" підвищеним="" (p="">< 0,01),="" порівняно="" з="" групою="" tgf-="" p="" 1="" (рис.="" 7="" і="">
3. Обговорення
Фіброз печінки є однією з основних причин захворюваності та смертності в усьому світі, але наразі доступні дуже обмежені терапевтичні можливості для цього захворювання, тому для нас дуже важливо шукати потенційні мішені для терапевтичного втручання, щоб запобігти розвитку фіброзу печінки [ 16]. Нещодавно дослідники виявили, що різні рослинні лікарські засоби мають гепатопротекторну або антифіброзну дію. Багато TCHM, такі як таблетки Fufang Biejia Ruangan [17] і відвар Xiao-chai-hu (shosaiko to в Японії) [18,19] широко використовувалися для лікування фіброзу печінки в Китаї, Кореї та Японії протягом тисяч років. C. tubulosa містить різноманітні активні компоненти, включаючи CPhG, іридоїди та полісахариди. Як одна з ефективних матеріальних основ C. tubulosa, CPhG мають чудову гепатопротекторну дію, але є обмежена інформація про антифіброзну дію GPhC та його споріднених сполук. У цьому дослідженні ми досліджували, як CPhGs, ехінакозид і актеозид пригнічують активацію HSC і блокують проходження сигнального шляху в TGF-p1/snaad як потенційних агентів проти гепатичного фіброзу in vitro.
Ураження печінки будь-якої етіології зрештою призведе до активації ГСК, які піддаються трансдиференціації до фіброгенних міофібробластоподібних клітин [20]. Тобто міофібробласти
походять від активації та проліферації HSCss [21], і він розглядається як медіатор формування фіброзу печінки. З цієї причини ми провели дослідження in vitro, щоб порівняти показники життєздатності клітин HSC, які зазнали впливу CPhG, ехінакозиду та актеозиду. Результати показали, що інгібуюча дія актеозиду на HSC була найсильнішою, а дія CPhGs була кращою, ніж дія ехінакозиду. CPhGs, лікувальні сироватки з ехінакозидом і актеозидом інгібували проліферацію HSC залежно від дози.
ЛДГ є цитоплазматичним ферментом у живих клітинах, і він не може проникнути через клітинну мембрану за нормальних умов. Коли клітини пошкоджені, проникність мембрани збільшується, і ЛДГ вивільняється назовні клітини. Зазвичай LDH може визначити ступінь пошкодження клітин [{{0}}]. Дослідження показало, що активність ЛДГ CPhGs, ехінакозиду та актеозидної лікарської сироватки продемонструвала лише незначне збільшення порівняно з контрольною групою клітин, і різниця не була статистично значущою (p> 0,05), що вказує на те, що більша частина клітинної мембрани зберігає свою цілісність. , а інгібування HSC CPhG, ехінакозидом і актеозидом не є наслідком неспецифічної клітинної токсичності.
Коли відбувається пошкодження печінки, активовані гепатоцити можуть вивільняти TGF-pi, який, у свою чергу, активує HSC-T6, тому TGF-pi має тісний зв’язок із фіброзом [25-27]. У цьому дослідженні CPhG, ехінакозид і актеозид можна розглядати як привабливу терапевтичну стратегію для інгібування проліферації HSC після того, як HSC стимулювали wTGF-pi in vitro. Ми припускаємо, що CPhGs, ехінакозид і актеозид можуть використовуватися як свого роду лікування та/або профілактика фіброзу печінки та пригнічують утворення раннього фіброзу печінки. Формування фіброзу печінки є складним процесом багатофакторного та багатоклітинного залучення. У цьому патологічному процесі взаємодії клітина-клітина, клітина-цитокіни та клітина-матрикс утворюють громіздку мережу. У цій мережі розвиток фіброзу печінки може регулюватися різними сигнальними шляхами та засобами. TGF-pi є класичним активатором ГСК і ключовим медіатором у патогенезі фіброзу печінки [28]. CPhG, ехінакозид і актеозид можуть пригнічувати експресію мРНК і білків, пов’язаних із шляхом TGF-pi/smad, у HSC.
TGF-pi впливає на клітини через сигнальний шлях smad, і його вважають ключовим посередником у розвитку фіброзу та запалення печінки. Після зв’язування TGF-pi з рецептором TGF-p-типу II кіназа рецептора II типу фосфорилює домен GS рецептора TGF-p типу I, що призводить до активації рецептора I типу [29]. Завдяки дії p-smad2 і p-smad3 на два залишки серину в мотиві SSXS їх С-кінці, реакції вниз за течією сигнального шляху smad активуються активацією рецептора типу I [30]. P-smad2 і p-smad3 утворюють олігомерні комплекси з smad4, потім потрапляють в ядро і проявляють свою біологічну транскрипційну активність. Таким чином, білки smad передають сигнали безпосередньо від рецепторної кінази до ядра [3i]. З іншого боку, smad7 міцно поєднується з рецептором TGF-pi, що призводить до нездатності smad 2/3 активуватися, а також до інгібування шляхів передачі сигналу [32]. Smad7 може інгібувати p-smad2 і p-smad3, ядерну транслокацію активованих комплексів smad і активацію (CAGA) (9)-MLP-Luc, що призводить до зниження експресії колагену I та повного інгібування трансдукції сигналу TGF-p [33,34]. Наші результати показали, що CPhG, ехінакозид і актеозид можуть зменшувати експресію мРНК smad2 і smad3 і підвищувати експресію мРНК smad7; інгібують експресію білків smad2, p-smad2, smad3 і p-smad3, а також регулюють експресію білка smad7, що свідчить про те, що CPhGs, ехінакозид і актеозид також відіграють важливу роль в інгібуванні активації HSC і, таким чином, пригнічують фіброз печінки, підкреслюючи потенційний антифіброзний ефект механізм.
Показано, що послідовність гепатопротекторних ефектів трьох досліджуваних агентів така: актеозид > CPhG > ехінакозид. Для подальшого з’ясування причин відмінностей у механізмі, за допомогою якого CPhG, ехінакозид і актеозид захищають від фіброзу печінки, було проаналізовано їх хімічну структуру. Фрагмент глікозиду фенетилового спирту є важливою структурою для гепатопротекторного ефекту [35]. Актеозид (C29H36Oi5) є подвійним глікозидом, а ехінакозид (C35H46O20) є триглікозидом, тобто ехінакозид має у своїй структурі додатковий глікозид порівняно з актеозидом, що призводить до збільшення його просторових розмірів. Гепатопротекторна або інгібуюча активність HSC актеозиду є кращою, ніж ехінакозид, що може бути пов’язано з наявністю стеричних перешкод.
захистити печінку: екстракт цистанки
4. Експериментальна ділянка
4.1. Хімічні речовини та реагенти
TGF-pi був придбаний у Peprotech (Rocky Hill, NJ, USA). Лінія клітин HSC-T6 була придбана у Wuhan Procell Gene Bio-technology Co., Ltd. (Ухань, Китай). Диметилсульфоксид (ДМСО) був придбаний у Sigma Inc. (Сент-Луїс, Міссурі, США). Праймери Smad2, smad3 і smad7 були виготовлені компанією Shanghai Sangon Biological and Technological Company (Шанхай, Китай). Набір для синтезу кДНК першого ланцюга Revert Aid був придбаний у Thermo Scientific (Шанхай, Китай). Набір Quantifast SYBR green для ПЛР був придбаний у компанії QIAGEN GmbH (Гільден, Німеччина). Антитіло p-smad2 (ser465/467), мАт кролика Smad3 (C67H9) і мАт кролика p-smad3 (ser423/425) були придбані в Cell Signaling Technology (Бостон, Массачусетс, США). Антитіло Smad7 було придбано у Boster (Ухань, Китай). Поліклональне антитіло Smad2 і моноклональне антитіло до р-актину були придбані у Proteintech (Вухань, Китай). Виявлення первинних антитіл проводили за допомогою розчину антитіл 2 ступеня (кон’югованих Alk-Phos, антикролячих) і розчину антитіл 2 ступеня (кон’югованих Alk-Phos, антимишачих), придбаних у Invitrogen™ (Карлсбад, Каліфорнія, США). Набір для аналізу лактатдегідрогенази був отриманий від Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Нанкін, Китай).
4.2. Рослинний матеріал
C. tubulosa була зібрана в Тулуфані, в Сіньцзян-Уйргурському автономному регіоні Китаю, у травні 2006 р. Рослинні матеріали були ідентифіковані як C. tubulosa Цзян Хе, Інститут Materia Medica Сіньцзяну. Зразок ваучера було збережено в Інституті Materia Medica Сіньцзяну в Китаї.
4.3. Виділення та очищення ХФГ та його сполук
Висушені та нарізані кореневища C. tubulosa (6.0 кг) тричі послідовно екстрагували зі зворотним холодильником 70% етанолом (4,8 л), а потім із об’єднаних екстрактів видаляли розчинник, щоб отримати з отриманням етанольного екстракту (1,146 кг). Етанольні екстракти очищали смолою AB-8 для отримання неочищеного екстракту фенілетанолглікозидів (CPhGs). Після розчинення у воді екстракт очищали за допомогою адсорбційної хроматографії на макропористій смолі AB-8 для отримання загальної кількості фенілетанолглікосидів C. tubulosa (CPhGs, 210 г). CPhG наносили на колонку ODS OP{{10}} і послідовно елюювали сумішами MeOH—H2.(0:1 -^1:0). Елюати об'єднували в п'ять субфракцій відповідно до поведінки ТШХ з використанням системи розчинників CHCH-MeOH-H2 (6:4:0,5). Плями візуалізували після обприскування 1% FeCih. Різні фракції неодноразово очищали за допомогою колонкової хроматографії Sephadex LH-20 з метанолом як елюентом, і два глікозиди фенілетанолу виділяли з CPhG. Їхні структури були підтверджені як ехінакозид (C35H46O20) та актеозид (C29H36O15) за допомогою MS, 1H- та MC-ЯМР [35], чистота яких була визначена як 99,17 відсотка та 98,92 відсотка відповідно за допомогою УФ-ВЕРХ. Структури ехінакозиду та актеозиду показані на малюнку 9.
4.5. Кількісне визначення CPhGs
Рідинна хроматографія (ВЕРХ) (LC{{0}}прилад HPLC, Shimadzu Co., Кіото, Японія) була використана для аналізу вмісту ехінакозиду та ктеозиду в CPhG. Колонку Phenomenex Gemini ODS (250 x 4,6 мм, 5 |^м) використовували при 30°. Ізократичну рухому фазу, що складається з метанолу-ацетонітрилу -1 відсотків оцтової кислоти (15:10:75, об./об./об.), використовували протягом 40 хв циклу, при швидкості потоку 0,6 мл/хв, з УФ виявлення при 334 нм.
4.6. Культура клітин
Клітини HSC культивували в модифікованому Дульбекко середовищі Ігла (з високим вмістом глюкози) (DMEM, Пекін, Китай) з додаванням 10% фетальної бичачої сироватки (FBS, Gibco, Карлсбад, Каліфорнія, США), 10 0 МО/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину (HyClone, Logan, UT, США) у зволоженому інкубаторі при 37 градусах з 5 відсотками CO2. Ці клітини регулярно пересівали в 0,25% (1x) розчин трипсину (HyClone, Logan, UT, США), а середовище змінювали кожні 2 дні. Спочатку клітини культивували з DMEM, що містить 10 відсотків FBS, протягом 48 годин. Потім середовище замінювали на DMEM без FBS, щоб голодувати клітини протягом 12 годин. Ці клітини розмножували протягом 48 годин, а через 48 годин сироватку голодували 0,5% FBS протягом 12 годин перед додаванням 5 нг/мл TGF-&1,
4.7. Визначення значень IC50
Після інкубації протягом ночі в середовищі голодування, що містить {{0}}.5% FBS, клітини HSC висівали в 96-лунковий планшет при щільності 5 x 104 клітин/мл протягом 24 годин. Клітини HSC обробляли CPhG, ехінакозидом і актеозидом у різних концентраціях (0, 3,90625, 7,8125, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250 і 500 мкг/мл) протягом 48 годин. Кожна концентрація мала чотири лунки. Наприкінці обробки 20 мкл MTT [3-(4,5-диметилтіазол-2-іл)-2,5-дифенілтетразолію броміду] (Sigma; 5 мг/мл) додавали та клітини інкубували ще 4 години. ДМСО (200 мкл) додавали в кожну лунку після видалення супернатанту. Після струшування планшета протягом 10 хвилин на шейкері значення IC50 були отримані шляхом вимірювання поглинання при довжині хвилі 490 нм за допомогою приладу для мічення ферментів (Benchmark PLUS, Hercules, CA, США), цей аналіз проводили тричі. Значення IC50 CPhG, ехінакозиду та актеозиду становили 119,125, 520,345 та 6,999 Рг/мл відповідно.
4.8. Ефекти інгібування проліферації клітин і життєздатність клітин
Клітини HSC піддавалися впливу різних концентрацій CPhG (25, 50, 100 мкг/мл), ехінакозиду (125,250,500 мкг/мл) і актеозиду (1,5, 3, 6 мкг/мл). Різні концентрації CPhG, ехінакозиду та актеозиду наносили на планшет у чотири послідовні лунки та інкубували протягом 48 годин. Ефекти інгібування клітинної проліферації та рівень життєздатності клітин (на основі вимірювання активності ЛДГ, що виділяється з пошкоджених клітин у супернатант [36]), визначали за допомогою аналізу МТТ. Швидкість інгібування розраховували за формулою [37]:
Швидкість інгібування (відсоток) " [1 — (середнє поглинання експериментальної групи/середнє поглинання холостої контрольної групи)] x 100 відсотків
Відповідно до інструкції до набору,
LDH (U/L) {{0}} (Виміряний OD — контрольний OD)/(стандартний OD — порожній OD) x 0,2 ммоль/л x 1000
Наше попереднє дослідження показало, що CPhG, ехінакозид і актеозид не впливають на життєздатність клітин.
4.9. Антипроліферативна активність TGF-^1
Довгий час вважалося, що HSC, активована TGF-p1, пов’язана з фіброзом печінки, і інгібування росту HSC було запропоновано як метод лікування фіброзу печінки [36,38]. Антипроліферативні ефекти CPhG, ехінакозиду та актеозиду на HSC, активовані TGF-p1, визначали за допомогою аналізу MTT [39]. Використовуючи описані процедури та концентрації ліків,
Експериментальні групи включали контрольну групу, групу TGF-pi, TGF-pi плюс групи препаратів з різною концентрацією. Усі групи клітин, крім контрольної, культивували з DMEM, що містить 5.0 нг/мл TGF-p1 (без FBS) протягом 24 годин. Інгібуючу активність щодо проліферації клітин розраховували як 100 х (поглинання обробленої сполуки — поглинання фонового світла)/(поглинання моделі — поглинання фонового світла).
4.10. Зворотна транскрипція-полімеразна ланцюгова реакція (RT-PCR)
Рівень експресії мРНК smad2, smad3 і smad7 визначали методом ПЛР у реальному часі. Щоб визначити експресію мРНК у клітинах HSC, клітини (5 x 104 клітини) висівали в шестилункові планшети з 3.0 мл DMEM з 10% FBS та інкубували протягом ночі при 37 градусах і 5 відсотків CO2. Після заміни культурального середовища на DMEM, що не містить сироватки, до лунок додавали CPhG (100, 50, 25 мкг/мл), ехінакозид (500, 250, 125 мкг/мл) і актеозид (6, 3, 1,5 мкг/мл). Після інкубації протягом 48 годин із CPhG та мономерними композиціями загальну РНК екстрагували за допомогою реагенту TRIzol (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США) та енергійно перемішували хлороформом протягом 15 секунд. Після витримування при кімнатній температурі протягом 3 хвилин лізат центрифугували при 12 000 x g протягом 15 хвилин при 4 градусах. РНК у водній фазі осаджували ізопропанолом, а верхню водну фазу переносили в нову мікроцентрифужну пробірку. РНК осаджували додаванням 0,75% етанолу, після чого мікроцентрифужну пробірку центрифугували при 12,000 xg при 4 градусах не більше 5 хв. Супернатант видаляли, а РНК сушили при кімнатній температурі протягом 5-10 хв. Праймери (Sangon) були розроблені з використанням пакетного праймера 3 і наведені в таблиці 4. Результати були нормалізовані до мРНК гена p-актину господарювання як внутрішнього контролю та представлені як відносні рівні мРНК. Реакції проводили з 8 |^L iQ SYBR Green Supermix, парою праймерів 1 10 pM, 8,5 дистильованою водою та 2,5 rL кДНК.
Кожну полімеразну ланцюгову реакцію проводили за таких умов: 95 градусів протягом 3 хвилин, потім 40 циклів по 10 секунд при 95 градусах, 30 секунд при 55 градусах і 10 секунд при 55 градусах -95 градусів для розширення, після чого одне вимірювання флуоресценції. Кінцеві результати були описані за допомогою відносних значень (2_AACt). Розрахунок і аналіз проводилися за допомогою системи виявлення ПЛР в реальному часі iQ5.
4.11. Вестерн-блот аналіз
Цільноклітинні екстракти готували з використанням буфера для аналізу радіоімунопреципітації (RIPA) (Thermo Fisher Scientific, Inc.) з 1% суміші інгібіторів Halt протеази та 1% інгібіторів Halt фосфатази (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Загальний білок використовували для виявлення smad2, p-smad2, smad3, p-smad3 і smad7. Концентрацію білка вимірювали та кількісно визначали методом Бредфорда. Білок (10-30 Rg) відокремлювали на 10% гелі SDS-PAGE і переносили на мембрани з полівініліденфториду (PVDF) (Millipore, Бостон, Массачусетс, США). Мембрани блокували протягом 1 години при кімнатній температурі 5% бичачим сироватковим альбуміном і первинними антитілами (поліклональне антитіло smad2, антитіло p-smad2, мАт кролика smad3 і мАт кролика p-smad3, розведення 1:1000; мАт кролика smad7, 1 :200 розведення, моноклональне антитіло до р-актину, 1:5000 розведення) інкубували при 4 градусах протягом ночі. Відповідний Alk-Phos. кон'юговані вторинні антитіла інкубували при кімнатній температурі. Нарешті, мембрани тричі промивали 1 х трис-HCl фізіологічним розчином з 0,1 відсотком Tween 20, і сигнали сканували та візуалізували за допомогою GEL DOC XR Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, США). Денситометричний аналіз білків, що представляють інтерес, нормалізували на p-актин за допомогою програмного забезпечення GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). р-актин використовували як внутрішній контроль.
4.12. Статистичний аналіз
Дані були виражені як середнє 土 стандартне відхилення (SD). Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення SPSS 16.0 (Сіньцзянський медичний університет). Пробіт-аналіз використовувався для аналізу значень IC50. Достовірність різниці розраховували за допомогою одностороннього тесту ANOVA, а значення з p < 0,05="" вважали="" статистично="">
5. Висновки
Підсумовуючи, CPhG з C. tubulosa та його компонентів ехінакозид і актеозид демонструють значні антифіброзні ефекти. Серед них активність актеозиду є найпотужнішою, тоді як активність CPhG знаходиться між двома сполуками. Інгібування активації сигналізації TGF-p1/Smad може бути основним механізмом, за допомогою якого CPhG захищають від хронічного захворювання печінки, пов’язаного з фіброзом, а ехінакозид і актеозид є ефективною антифіброзною основою C. tubulosa.
Подяки:Це дослідження було підтримано Національним фондом природничих наук Китаю (81260624). Автори хотіли б висловити свою щиру подяку професору Тао Лю за його вдосконалення тексту в цій статті.
Авторські внески:TL, JZ, S.-PY, LM і S.-LZ задумали та розробили експерименти. S.-PY, TL та JZ проаналізували дані. S.-PY та JZ написали рукопис. TL, LM і JZ рецензували рукопис. Усі автори прочитали та схвалили остаточний рукопис.
Конфлікт інтересів:Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів.
Список літератури
1. Субрамоніам, А.; Пушпангадан, П. Розробка фітопрепаратів при захворюваннях печінки. Ind. J. Pharmacol. 1999, 31, 166-175.
2. Фрідман, С. Л. Механізми захворювання: Механізми фіброзу печінки та терапевтичні наслідки. Нац. Clin. Практ. Гастроентерол Гепатол. 2004, 1, 98-105. [CrossRef] [PubMed]
3. Фрідман С.Л.; Roll, FJ; Бойлз, Дж.; Bissell, DM Ліпоцити печінки: основні клітини нормальної печінки щурів, що виробляють колаген. Proc. Natl. акад. наук. США 1985, 82, 8681-8685. [CrossRef] [PubMed]
4. Фрідман С.Л.; Bansal, MB Зворотний розвиток фіброзу печінки一Факт чи фантазія? H叩atology 2006, 43, S82-S88. [CrossRef] [PubMed]
5. Ахмад, А.; Ахмад, Р. Розуміння механізму фіброзу печінки та потенційних терапевтичних підходів. Saudi J. Gastroenterol. 2012, 18, 155-167. [CrossRef] [PubMed]
6. Пітер, Х.; Ворон; Zhang, LB Orobanchaceae Ventenat. У Флора Китаю, 23-е вид.; Редакційний комітет Флори Китаю: Китайська академія наук, Пекін, Китай, 2013; стор. 1-16.
7. Комісія китайської фармакопеї Міністерства санітарії КНР. Китайська фармакопея; Частина 1; Видавництво Chemical Industry Publishing House: Пекін, Китай, 2010; стор. 126.
8. Лі, Дж.; Хуан, Д.; He, L. Вплив roucongrong (Herba Cistanches Deserticolae) на репродуктивну токсичність у мишей, індуковану глікозидом Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). Ж. Традит. Підборіддя. Мед. 2014, 34, 324-332. [CrossRef]
9. Xing, Y.; Ляо, Дж.; Тан, Ю.; Чжан, П.; Тан, К.; Національний інститут охорони здоров'я США.; Ву, X.; Лі, Н.; Jia, X. АПФ та інгібітори агрегації тромбоцитів з Tamarix hohenackeri Bunge (рослина-господар Herba Cistanches), що росте в Сіньцзяні. Pharmacogn. Маг. 2014,10, 111-118. [PubMed]
10. Цзя, Ю.; Гуань, К.; Цзян, Ю.; Салх, Б.; Го, Ю.; Ту, П.; Du, C. Полегшення коліту, індукованого декстрансульфатом натрію, у мишей за допомогою збагаченого ехінакозидом екстракту Cistanche tubulosa. Фітотер. рез. 2014, 28, 110-119. [CrossRef] [PubMed]
11. Вонг, HS; Ko, KM Herba Cistanches стимулює окисно-відновний цикл клітинного глутатіону за допомогою активних форм кисню, що утворюються в результаті мітохондріального дихання в кардіоміоцитах H9c2. фарм. Biol. 2013, 51, 64-73. [CrossRef] [PubMed]
12. Мартін, А.; Clynes, M. Кисла фосфатаза: кінцева точка для тестів на токсичність in vitro. Vitro Cell. Dev. Biol. 1991, 27, 183-184. [CrossRef]
13. Лечуга К.Г.; Ернандес-Назара, ZH; Домінгес Росалес, JA; Морріс, ER; Рінкон, Арканзас; Рівас-Естілья, AM; Естебан-Гамбоа, А.; Ройкинд, М. TGF-01 модулює експресію матриксної металопротеїнази-13 в зірчастих клітинах печінки за допомогою складних механізмів, що включають p38MAPK, PI3-кіназу, AKT і p70S6k. Am. J. Physiol. Шлунково-кишковий аналіз печінки. 2004, 287, G974-G987. [CrossRef] [PubMed]
14. Нгуєн, Дж.; Тан, С.Й.; Нгуєн, Д.; Alliston, T. Load регулює формування кісткової тканини та експресію склеростину через TGFp-залежний механізм. PLoS ONE 2013, 8, e53813. [CrossRef] [PubMed]
15. Песса, М.; Маре, Ж.; Пруньє, К.; Ферран, Н.; Лаллеманд, Ф.; Мовіель, А.; Atfi, A. C-Jun асоціюється з онкобілком Ski і пригнічує транскрипційну активність Smad2. J. Biol. Chem. 2002, 277, 29094-29100. [CrossRef] [PubMed]
16. Дінь, Н.; Ю, РТ; Субраманіам, Н.; Шерман, MH; Вілсон, К.; Рао, Р.; Леблан, М.; Коултер, С.; Він, М.; Скотт, К.; та ін. Рецептор вітаміну D/геномна ланцюг SMAD блокує фіброзну відповідь печінки. Комірка 2013,153, 601-613. [CrossRef] [PubMed]
17. Ян, FR; Ікло, BW; Lou, JS Вплив таблеток Fufang Biejia Ruangan на фіброз печінки in vivo та in vitro. World J. Gastroenterol. 2013, 19, 5326-5333. [CrossRef] [PubMed]
18. Сакайда І.; Хіронака, К.; Кімура, Т.; Терай, С.; Ямасакі, Т.; Okita, K. Фітотерапія Sho-saiko-to (TJ-9) збільшує експресію матричних металопротеїназ (MMP) зі зниженою експресією тканинного інгібітора металопротеїназ (TIMP) у зірчастих клітинах щурів. Life Sci. 2004, 74, 2251-2263. [CrossRef] [PubMed]
19. Чен, М.; Чен, Дж.; Цай, К.; Ван, В.; Чанг, Д.; Ту, ДГ; Hsieh, HY Роль TGF-01 і цитокінів у модуляції фіброзу печінки Sho-saiko-to в моделі лігованих жовчних проток щурів. J. Етнофармакол. 2005, 97, 7-13. [CrossRef] [PubMed]
20. Болярін Д.М.; Azinge, EC Біохімічні маркери, позаклітинні компоненти при фіброзі та цирозі печінки. Nig. QJ Hosp. Мед. 2007, 17, 42-52. [CrossRef] [PubMed]
21. Конг, Д.; Чжен, С.; Lu, Y. Джерело та роль міофібробластів у фіброзі печінки. Підборіддя. Pharmacol. Бик. 2011, 27, 297-300.
22. Де Лавор, MSL; Бінда, Н.С.; Фукусіма, FB; Калдейра, FMC; Да Сілва, Дж. Ф.; Сілва, CMO; де Олівейра, КМ; Мартінс Бде, К.; Торрес, Б.Б.; Росадо, І.Р.; та ін. Модель ішемії-реперфузії в спинному мозку щурів: дослідження життєздатності клітин і сигналізації апоптозу. Міжн. Дж. Клін. Exp. патол. 2015, 8, 9941-9949. [PubMed]
23. Бахадар, Х.; Макбул, Ф.; Ніяз, К.; Абдоллахі, М. Токсичність наночастинок і огляд сучасних експериментальних моделей. Іран Біомед. J. 2016, 20, 1-11. [PubMed]
