Частина 1: Вербаскозид захищає клітини підшлункової залози від ER-стресу

Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Алессандра Галлі 1, плюс , Паола Марчіані 1, плюс , Альгерта Марку 1, Сільвія Гісланцоні 1, Федеріко Бертуцці 2, Рафаелла Россі 3, Алессія Ді Джанкамілло 3, Мікела Кастанья 1 і Карла Перего 1,*

Анотація:

Суттєві епідеміологічні дані вказують на те, що дієта, багата поліфенолами, захищає від розвитку діабету 2 типу. Фенілетаноїдний глікозидвербаскозид/актеозид, широко поширена поліфенольна рослинна сполука, має кілька біологічних властивостей, включаючи сильну антиоксидантну, протизапальну та нейропротекторну дію. Метою цього дослідження було перевірити можливі ефективербаскозидна клітини підшлункової залози, мішень, яку раніше ніколи не тестували. Клітини миші та людини інкубували звербаскозид(0.8–16 мкМ) протягом до п’яти днів і комбінацію біохімічних методів і методів візуалізації використовували для оцінки виживання та функціонування β-клітин у нормальних умовах або в умовах стресу ендоплазматичного ретикулуму (ER). Ми виявили дозозалежний захисний ефектвербаскозидпроти окислювального стресу в клональних і людських клітинах. Механічні дослідження показали, що поліфенол захищає -клітини від дисфункцій, опосередкованих ER-стресом, модулюючи активацію гілки РНК-подібної кінази ендоплазматичного ретикулуму протеїнкінази (PERK) реакції розгорнутого білка та сприяючи динаміці мітохондрій. В результаті в цих клітинах було виявлено підвищену життєздатність, функцію мітохондрій і вміст інсуліну. Ці дослідження надають докази тоговербаскозидпосилює здатність β-клітин справлятися з ER-стресом, що є важливим фактором дисфункції β-клітин та збою при діабеті, і підтримує терапевтичний потенціал вербаскозиду при діабеті.

Ключові слова:

вербаскозид; поліфеноли; клітини, що виробляють інсулін; діабет; УНР; окислювальний стрес; ER-стрес; ПЕРК; протизапальний; мітохондрії

1. Введення

Цукровий діабет є хронічним розладом, яким страждають сотні мільйонів людей [1]. Різна етіологія характеризує цукровий діабет 1 типу (T1D) і діабет 2 типу (T2D), обидва характеризуються нестачею інсуліну [2]. Інсулін регулює концентрацію глюкози в плазмі, стимулюючи поглинання глюкози в м'язових і жирових клітинах і модулюючи метаболізм глюкози в печінці. Доступність поживних речовин, гормонів і нервових надходжень регулюють секрецію інсуліну підшлунковою залозою та підтримують концентрацію глюкози в крові в межах фізіологічного діапазону [3–5]. Таким чином, дисфункція β-клітин призводить до діабету, що характеризується гіперглікемією натще.

СД 2 типу є прогресуючим станом, при якому резистентність до інсуліну та збій у функціонуванні β-клітин пов’язані разом, і нещодавно отримані докази підвищили інтерес до критичної первинної ролі β-клітин у гіперглікемічному статусі [6,7]. У осіб без діабету з ожирінням клітини компенсують резистентність до інсуліну підвищеною секрецією гормону. Однак у деяких суб’єктів, коли їхній стан погіршується, інсулінемія падає, а рівень глюкози підвищується до гіперглікемії [8,9].

Глюкоза є найважливішим модулятором функцій клітин. Стимуляція глюкози впливає на регуляцію генів і експресію білків, які беруть участь у багатьох клітинних функціях, таких як гліколіз, синтез і секреція інсуліну [10]. Секреція інсуліну, індукована глюкозою, залежить від окислювального метаболізму для виробництва аденозинтрифосфату (АТФ), і фізіологічно виробляється низький рівень активних форм кисню (АФК). Однак β-клітини не надто добре оснащені ферментами-поглиначами, і ця слабкість робить їх дуже чутливими до окислювального стресу [11,12]. Коли окислювальний стрес зростає, вироблення інсуліну клітинами знижується, а клітини виробляють цитокіни, які викликають пошкодження клітин через запалення та апоптоз [13]. Цікаво, що хоча зменшення маси клітин раніше приписували загибелі клітин, останні дослідження показують, що важливу роль відіграє дедиференціація клітин [14,15]. Стало зрозуміло, що до T2D веде кілька етапів. Метаболічні та окислювальні порушення спричиняють стрес ендоплазматичного ретикулуму (ER), який призводить до зниження синтезу та секреції інсуліну, запальні процеси супроводжуються вивільненням цитокінів і втратою клітин через апоптоз та дедиференціацію. Ці знання є основоположними для розробки відповідних стратегій лікування, оскільки можна протидіяти окислювальному стресу та запаленню, а пластичність клітин підшлункової залози дозволяє перетворити стовбурові клітини на -клітини, як було доведено на мишах [16].

Нещодавно вразливість -клітин до окислювального стресу успішно спонукала до використання дієтичних антиоксидантів для запобігання діабету [17]. Серед найцікавіших антиоксидантів оливкова олія відома своїми корисними властивостями ще з часів стародавніх греків. Оливкова олія містить велику кількість мононенасичених жирних кислот (MUFA) і кілька поліфенолів, таких як тирозол, гідрокситирозол, олеуропеїн і вербаскозид.

Вербаскозид, також відомий як актеозид, є фенілетаноїдним глікозидом, екстрагованим з Olea europea, рослин виду Verbascum та 23 інших родин рослин [18–20]. Його також можна отримати з побічних продуктів оливкової олії (її збагачують у стічних водах оливкового заводу, отриманих від переробки оливкових плодів) або виробляти за допомогою підходів метаболічної інженерії та синтетичної біології [21].

Даних щодо біодоступності вербаскозиду у людей поки що немає. Дослідження, проведені на мишах, клітинах SKBR3 і Caco-2, свідчать про те, що вербаскозид, що не метаболізується, може подолати кишковий бар’єр, циркулювати в плазмі крові та проявляти антиоксидантну дію [20,22,23]. На відміну від більшості рослинних поліфенолів, вербаскозид в основному діє на клітини через модуляцію транскрипції генів різноманітних ферментів і регуляторних факторів, виявляючи антиоксидантну та протизапальну дію [24–30].

Хоча відомо багато корисних ефектів вербаскозиду для здоров’я людини, немає даних про його вплив на клітини підшлункової залози. Оскільки окислювальний стрес і запалення лежать в основі патогенезу СД2, ми досліджували, чи може лікування вербаскозидом покращити життєздатність клітин і

функціонує в умовах, що викликають ER-стрес, і ми охарактеризували молекулярні механізми його дії. Наші дані показують, що вербаскозид запобігає окислювальному стресу та запаленню клітин, модулюючи активацію реакції розгорнутого білка та сприяючи динаміці мітохондрій, що призводить до підвищення життєздатності клітин та вмісту інсуліну.

2. Матеріали та методи

2.1. Культура клітин і матеріали

Клітини tc3 миші (люб’язно надані професором Ханаханом — Департаментом біохімії та біофізики Каліфорнійського університету, Сан-Франциско, Каліфорнія [31]) культивували в середовищі RPMI 1640 (Euroclone SpA, ECB90 0, Pero MI, Італія) з додаванням 10 відсотків (об’єм/об’єм) інактивованої теплом фетальної телячої сироватки (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Італія), 1 відсотка (об’єм/об’єм) пеніцилін-стрептоміцину (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, Італія) та 1% (об’єм/об’єм) L-глутаміну (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Італія). Людські острівці Лангерганса були виділені в Мілані (Niguarda Ca' Granda) від трупних мультиорганних донорів відповідно до процедури, описаної Ricordi et al. [32]; їх культивували в культуральному середовищі RPMI, що містило 5,5 ммоль/л глюкози, 10 відсотків термоінактивованої фетальної бичачої сироватки, 0,7 мМ глутаміну, 50 одиниць/мл пеніциліну та 50 мкг/мл стрептоміцину (EuroClone, SpA, Pero MI, Італія). Використовували чотири різні препарати острівців, чистота острівців становила 80 ± 10 відсотків. Виділення острівців і дослідження острівців були схвалені Комітетом з етики лікарні Niguarda Ca' Granda в Мілані (11.12.2009). клітини tc3 обробляли 0,8, 1,6 і 16 мкМ вербаскозидом (Carbosynth, OV08034, Комптон, Великобританія), кофеїновою кислотою та гідрокситирозолом (люб’язний подарунок професора Делл'Аглі, Департамент фармакологічних і біомолекулярних наук, Університет дельї Студі ді Мілано, Мілан, Італія) у повному середовищі RPMI протягом 5 днів, тоді як людські острівці з 16 мкМ вербаскозидом. Клітини, оброблені метанолом/етанолом, використовували як контроль. Щоб викликати окислювальний стрес, клітини обробляли H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, USA) 500 мкМ у повному середовищі RPMI протягом 20 хвилин перед аналізом, одночасно обробляючи тунікаміцином 2 мкг/мл (T7765, Sigma Aldrich). ) протягом 7 годин проводили для індукції ER стресу.

2.2. Виявлення життєздатності клітин за допомогою тесту MTT

Клітини поміщали в 96 багатолункових планшетів і через п’ять днів після обробки вербаскозидом їх інкубували з 0.5 мг/мл MTT (3-(4,5-диметилтіазол{{7}) }yl)-2,5-дифенілтетразолію бромід) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, USA) протягом 4 годин у зволоженій атмосфері, що містить 5 відсотків CO2, при 37 oC. Після інкубації клітини обережно ресуспендували в 100 мкл ДМСО (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Італія) і визначали поглинання при 540 нм за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів (Benchmark, пристрій для зчитування мікропланшетів, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, США) [33]. Експерименти проводили в трьох примірниках, і дані виражали як кратне збільшення порівняно з контрольними зразками.

2.3. Виявлення загибелі клітин за допомогою проточної цитометрії

Через п'ять днів після інкубації з 16 мкМ вербаскозидом клітини відокремлювали шляхом 7-хвилинної інкубації з трипсином/EDTA, збирали та центрифугували; осад обережно ресуспендували у фосфатно-сольовому буферному розчині з низьким вмістом солей. Клітини фарбували реагентом для підрахунку та життєздатності MuseTM (Millipore, MCH100102, Burlington MA, США) відповідно до протоколу виробника та аналізували за допомогою проточної цитометрії. Експерименти проводили в трьох примірниках, і дані виражали у відсотках мертвих клітин від загальної кількості.

2.4. Генерація ROS

Внутрішньоклітинні АФК оцінювали за допомогою DCFDA (2/,7/-дихлорофоресцеїну діацетату) (Sigma Aldrich, D6883, Сент-Луїс, Міссурі, США), мембранно-проникного зонда, який стає флуоресцентним, коли прив’язаний до АФК [34]. Клітини tc3 попередньо завантажували 15 мкМ DCFDA у буфері Кребса–Рінгера (125 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1,2 мМ MgSO4, 1,2 мМ KH2PO4, 25 мМ HEPES-NaOH рН 7,4 і 2 мМ CaCl2)

з додаванням 11 мМ глюкози протягом 1 години при 37 oC. Вміст АФК визначали протягом 30 хвилин як в базових умовах, так і в умовах стресу за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів (485/528 нм Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Швейцарія). Середні значення та стандартні відхилення базувалися на трьох незалежних експериментах.

2.5. Вестерн-блоттинг

Клітини tc3 збирали та солюбілізували в буфері RIPA (150 мМ NaCl, 50 мМ Tris HCl рН 7,6, 1 мМ EDTA, 1% TERGITOLw NP40, 0,5% дезоксихолату) з додаванням апротиніну (Sigma Aldrich, A4529, St. Louis, MO, USA), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, USA) та інгібітори Roche (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, USA) протягом 40 хв при 4 oC. Концентрацію білка визначали за допомогою аналізу Бредфорда [35] за допомогою реагенту Бредфорда (Sigma Aldrich, B6916, Сент-Луїс, Міссурі, США), 30 мкг білків розділяли 10-відсотковим SDS-PAGE і переносили на нітроцелюлозні мембрани (Millipore, Burlington). Массачусетс, США). Первинні антитіла наносили на 2 години в блокуючий буфер з 5% знежиреним молоком або 5% розчинами BSA; були використані такі первинні антитіла: мишачий анти- -актин (Novus International Inc., NB600501, Сент-Луїс, Міссурі, США), мишачий анти-акролеїн (Abcam, ab48501, Кембридж, Великобританія), мишачий анти-BIP (люб'язний подарунок проф. Боргезе Ніка, Інститут нейронауки, CNR, Мілан, Італія), кролячий анти-HNE (-diagnostic International Inc., HNE11S, Сан-Антоніо, Техас, США), мишачий анти-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc. ., C92F3A-5, Фармінгдейл, Нью-Йорк, США), кролячий анти-фосфо-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Денверс, Массачусетс, США), мишачий анти-IKB (Cell Signaling Technology Inc. ., 4814, Денверс, Массачусетс, США), кролячий анти-фосфо-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Денверс, Массачусетс, США), кролячий анти-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Денверс Массачусетс, США), овечий анти-SOD1 (Merck, KGaA, Дармштадт, Німеччина), кролячий анти-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Денверс, Массачусетс, США), кролячий анти-eIF2 (Cell Signaling Technology Inc., 5324, Денверс, Массачусетс, США) та кролячий анти-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Денверс, Массачусетс, США). Вторинні антитіла, кон’юговані з HRP (Dako Agilent, Санта-Клара, Каліфорнія, США), використовували в розведенні 1:5000. Білки були виявлені за допомогою системи виявлення ECL (Euro-Clone SpA, Pero MI, Італія) за допомогою системи Odyssey Fc Image (LI-COR Biotechnology GmbH, Бад-Гомбург, Німеччина), а щільність смуги була кількісно визначена програмним забезпеченням Image Studiow Lite (LI -COR Biosciences, Лінкольн, штат Небраска, США) [36]. Експерименти проводили в трьох примірниках, і дані виражали як кратне збільшення порівняно з контрольними зразками.

2.6. Потенціал мітохондріальної мембрани

tc3 клітини та людські острівці Лангерганса інкубували з 100 нМ MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Мілан, Італія) або 100 мкМ MitoSpyw Green FM (BioLegend, 424805, Campoverde Srl, Мілан, Італія) протягом 30 хвилин при 37 oC; Інтенсивність флуоресценції визначали за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів TECAN Infinite⑧ F500 (551/576 нм Ex/Em для MitoSpyw Orange CMTMRos; 490/516 нм Ex/Em для MitoSpyw Green) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Швейцарія). Клітини інкубували з 500 мкМ H2O2 протягом 20 хвилин і визначали інтенсивність флуоресценції, як описано раніше. Середні значення та стандартні відхилення базувалися на трьох різних експериментах.

2.7. Мітохондріальна морфологія та динаміка

Клітини tc3 попередньо завантажували 100 нМ MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Мілан, Італія) у 11 мМ буфері Кребса–Рінгера з глюкозою при 37 oC протягом 30 хв. Зразки поміщали в камеру для візуалізації та знімали зображення випадкових полів за допомогою роданового фільтра мікроскопа Axio Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen Німеччина). Щоб оцінити морфологію мітохондрій, за допомогою програмного забезпечення аналізатора частинок ImageJ аналізували наступні параметри: площа (um2), округлість (4mArea2/Perimeter2) і максимальний діаметр Фере (um) [37].

Для експериментів із сповільненою зйомкою зображення однієї клітини проводили зі швидкістю 1 кадр на секунду протягом 30 секунд під контролем або в умовах окисного стресу. Щоб виміряти мітохондріальну кумулятивну відстань (um2), зображення спочатку були скориговані для висвітлення фото, а потім відео були проаналізовані за допомогою існуючого плагіна Image-Pro Plus (відстеження об’єктів) (Media Cybernetics, Роквіль, Меріленд, США). До дванадцяти

клітини були зображені в трьох незалежних експериментах, і дані були представлені як середні значення та стандартні відхилення.

2.8. Секреція інсуліну

Людські ізольовані острівці Лангерганса висівали в 96-лунковий планшет із щільністю 20 острівців на лунку, і через 5 днів лікування вимірювали вміст і секрецію інсуліну в базальному (3,3 мМ глюкози) і стимульованому (16,7 мМ глюкоза) ) за допомогою імуноферментного аналізу ELISA (Mercodia, 10-1113-01, Упсала, Швеція).

2.9. Статистичний аналіз

Усі статистичні аналізи проводили за допомогою GraphPad Prism 8.0 на незалежних біологічних репліках. Середні значення між двома групами оцінювали за допомогою двостороннього t-критерію Стьюдента, а p-значення < 0.05="" було="" прийнято="" як="" доказ="" статистичної="" значущості.="" середні="" значення="" між="" трьома="" або="" більше="" групами="" порівнювали="" за="" допомогою="" дисперсійного="" аналізу="" (anova)="" з="" подальшим="" множинним="" ретроспективним="" (тукі)="" порівняльним="" тестом.="" використаний="" статистичний="" тест,="" точні="" значення="" p="" і="" кількість="" реплік="" (n)="" вказані="" в="" окремих="" легендах="" до="" фігур.="" смуги="" похибок="" на="" малюнках="" відображають="" середнє="" значення="" ±="" sd="" або="" середнє="" значення="" ±="" se,="" як="">

3. Результати

3.1. Вербаскозид покращує життєздатність клітин

Оскільки не було даних про вплив вербаскозиду на -клітини, ми провели тест MTT для оцінки життєздатності клітин і, як показано на малюнку 1A, спостерігалася позитивна дозозалежна тенденція. Отже, для подальших досліджень ми вибрали концентрацію 16 мкМ, яка статистично підтвердила ефективність для підвищення життєздатності β-клітин. За допомогою проточної цитометрії ми досліджували вплив п’ятиденної інкубації вербаскозиду на виживання β-клітин у базальних умовах і після 2{{21} } хв попередньої обробки 500 мкМ H2O2. У базальному стані вербаскозид не впливав на виживання клітин, що свідчить про те, що підвищена життєздатність клітин, яка спостерігається в аналізі MTT, може бути наслідком покращеної мітохондріальної активності. У той час як після експозиції H2O2 попередня обробка вербаскозидом 16 мкМ суттєво зменшила загибель клітин, спричинену окислювальним стресом (рис. 1B, C). Вербаскозид є складною молекулою, яку можна модифікувати гідролізуючими ферментами [18]. Щоб перевірити, чи можуть метаболіти вербаскозиду відповідати за спостережуваний захисний ефект, клітини tc3 обробляли гідрокситирозолом і кофеїновими кислотами (0,8 і 16 мкМ) протягом 5 днів. Обидва метаболіти не підвищували життєздатність клітин, навпаки, цитотоксичний ефект, більш актуальний після впливу H2O2, був виявлений для концентрації 16 мкМ (рис. S1). Це відкриття доводить, що вербаскозид, а не його метаболіти, справляє захисну дію на лікування H2O2.

3.2. Вербаскозид регулює окисно-відновний гомеостаз і має протизапальну дію на клітини

Ми вперше підтвердили в клітинах tc3 протизапальну та антиоксидантну дію вербаскозиду, що спостерігається в інших типах клітин [24,29,34]. Активність поглинання АФК вербаскозидом оцінювали за допомогою клітин tc3, мічених клітинним проникним зондом, специфічним для АФК DCFDA (2/,7/-дихлорофуоресцеїну діацетат). Як показано на малюнку 2A, було виявлено значне зниження вмісту АФК після попередньої обробки вербаскозидом як в умовах базального, так і в умовах окисного стресу.

Вестерн-блоттинг виявив значне зниження експресії маркерів окисного стресу акролеїну та 4-гідроксиноненалу (HNE) у клітинах, оброблених вербаскозидом. Крім того, ми виявили збільшення експресії супероксиддисмутази (SOD1), що свідчить про те, що вербаскозид проявляє свою антиоксидантну активність, ймовірно, за допомогою двох різних механізмів: безпосередньо як поглинач АФК і опосередковано, індукуючи експресію антиоксидантних ферментів (рис. 2B, C).

Протизапальний ефект вербаскозиду на β-клітини оцінювали шляхом оцінки активації шляху NFKB, найважливішого прозапального шляху в цих клітинах [38]. За допомогою вестерн-блот-аналізу ми виявили знижену експресію інгібітора ядерного фактора каппа В (IKB) і підсилювача легкого ланцюга ядерного фактора каппа (NFKB), а також значне зниження фосфорилювання NFKB у попередньо оброблених клітинах, що підтверджує гіпотезу про ефективність вербаскозиду для зменшення клітинного запалення (рис. 2D, E).

3.3. Вербаскозид модулює розгорнуту білкову відповідь -клітин

Потім ми детально проаналізували молекулярний механізм, за допомогою якого вербаскозид виконує антиоксидантну та протизапальну роль, зосередившись на ендоплазматичному ретикулумі, який стає ключовим датчиком метаболічних і стресових сигналів у клітинах. В умовах стресу органела викликає гомеостатичну відповідь, відому як розгорнута білкова відповідь (UPR), спрямовану на відновлення функції ER; однак надмірна активація цього шляху призводить до апоптозу [39,40].

Маркерами підвищеного стресу ER є активація білків шаперонів і активація відповіді UPR. Вестерн-блоттинг клітин, оброблених вербаскозидом, виявив зниження рівня двох шаперонінів, протеїну теплового шоку 70 (HSP70) і білка зв’язуючого імуноглобуліну (BIP) (рис. 3A, B). Крім того, було виявлено значне зниження експресії протеїнкінази РНК-подібної ERK-кінази (PERK) і зниження фосфорилювання її нижнього ефектора, еукаріотичного фактора ініціації трансляції 2 (eIF2).

Натисніть тут, щоб переглянути частину 2