PGC-1 пригнічує запалення NLRP3 через збереження життєздатності мітохондрій для захисту ниркового фіброзу
Dec 15, 2023
ВСТУП
Хронічна хвороба нирок(ХНЗ) є глобальною проблемою охорони здоров’я, і її поширеність зростає в усьому світі [1–3].Хворі на ХХНмають підвищений ризик прогресування до термінальної стадії захворювання нирок і смертності [4, 5]. Тому важливо знайти ефективні терапевтичні цілі для запобіганняпрогресування ХХН. Тубулоінтерстиціальний нирковийзапалення і фіброзє ключовими патологічними ознаками впрогресування ХХН[6–8]. Епітеліальні клітини ниркових канальців(RTEC) необхідні для підтримки гомеостазу рідини та електролітів і складають 90% маси нирок. RTEC забезпечують велику кількість мітохондрій і мають високий рівень пероксисомального проліфератор-активованого рецептора (PPAR) і пероксисомального проліфератор-коактиватора-1 (PGC-1), щоб задовольнити свої метаболічні та функціональні потреби в енергії [9]. Зростає кількість доказів того, що мітохондріальна дисфункція, яка характеризується зменшенням кількості та деполяризацією, набряком і руйнуванням крист, значною мірою сприяє фіброзу нирок [10, 11]. Пошкоджені мітохондрії не виробляють ефективно аденозинтрифосфат (АТФ) і вивільняють надмірнуактивні форми кисню(ROS) і мітохондріальної ДНК (мтДНК), які, як наслідок, викликають запальні реакції, що йдуть нижче, і призводять до загибелі клітин і пошкодження канальців.
Сімейство NOD-подібних рецепторів, що містить піриновий домен 3 (NLRP3), бере участь у різних вроджених імунних відповідях хазяїна на мікробні та немікробні стимули [12, 13]. Деякі патогени та ендогенні сигнали про небезпеку, що вивільняються з пошкоджених і вмираючих клітин, активують NLRP3 і призводять до утворення білкового комплексу, який називається «інфламмасома» [14]. Потім інфламмасома NLRP3 індукує автопроцесинг і активацію каспази-1, що призводить до розщеплення процитокінів до зрілого IL-1 та IL-18. Нещодавно інфламмасому NLRP3 залучили до патогенезу ураження нирок і фіброзу [15–17]. У різних тваринних моделях захворювання нирок активується шлях запалення NLRP3, і його кінцеві продукти, IL-1 та IL-18, можуть спричинити пошкодження ниркових канальців [16–19]. Цікаво, що внутрішні ниркові клітини, такі як RTEC і подоцити, експресують NLRP3, що свідчить про потенційну роль передачі сигналу запалення NLRP3 у пошкодженні клітин [20, 21]. Крім того, нещодавні дослідження продемонстрували потенційну взаємодію між мітохондріальною дисфункцією та активацією запалення NLRP3 на моделях ушкодження ниркових канальців [22–24]. Однак невідомо, чи може PGC-1, ключовий регулятор біогенезу мітохондрій, регулювати шлях NLRP3 шляхом модуляції мітохондріальної динаміки.
Таким чином, ми досліджували роль PGC-1 у регуляції активації запалення NLRP3 у RTEC. Зокрема, ми перевірили, чи може змінена життєздатність і динаміка мітохондрій, викликана активацією або пригніченням PGC-1, регулювати шлях запалення NLRP3, і таким чиномвпливають на пошкодження нирок.
Служба підтримки Wecistanche - найбільшого експортера cistanche в Китаї:
Електронна адреса:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Тел.:+86 15292862950
Зверніться в магазин, щоб дізнатися більше про технічні характеристики:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
ОТРИМАЙТЕ НАТУРАЛЬНИЙ ОРГАНІЧНИЙ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНХИ З 25% ЕХІНАКОЗИДУ ТА 9% АКТЕОЗИДУ ПРИ ІНФЕКЦІЇ НИРОК
МЕТОДИ
Культури клітин, обробка активатором TGF- 1, PGC-1 і трансфекція до первинних RTEC RTEC були виділені з мишей C57BL/6. Короткий метод описано в Додаткових методах. Субконфлюентні RTEC були обмежені FBS протягом 24 годин, а потім середовище було замінено на 1% середовище FBS DMEM для контрольної групи та таке ж середовище з TGF- 1 (5 нг/мл) (R&D Systems, Міннеаполіс, штат Міннесота). , США) для групи TGF- 1. RTEC збирали для аналізу РНК і білка через 48 годин після зміни середовища. Активатор PGC-1, метформін (1 мМ) обробляли як контрольну, так і TGF- 1 групи. Дози ліків були визначені на основі наших попередніх тестів. Крім того, клітини також трансфікували плазмідою Ppargc1a (1 мкг) (Addgene, Cambridge, MA, USA) і Ppargc1a малою інтерферуючою РНК (siRNA), використовуючи реагенти Lipofectamine 2000 і Plus (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Далі, через 6 годин після трансфекції, середовище замінювали на середовище, що не містить сироватки, і клітини інкубували протягом додаткових 48 годин. Щоб інгібувати експресію Drp1, ми руйнуємо ген Drp1 за допомогою лентивірусу, що містить Drp1, націлений на коротку шпилькову РНК (shRNA) для інфікування RTEC (люб’язно наданий доктором Ю Дж, Медичний коледж Університету Йонсей) [25]. Для подальшого вивчення зв’язку між запаленням NLRP3 і пошкодженням мітохондрій ми також отримали RTEC від мишей з нокаутом Nlrp3 (люб’язно подарованих доктором Ю Дж, медичний коледж Університету Йонсей).
Дослідження та лікування тварин
Самці мишей C57BL/6 (віком 6 тижнів, початкова вага 20 г) були придбані в лабораторії Джексона (Бар-Харбор, ME, США). Тварин утримували в кімнаті з контрольованою температурою (22 градуси) у 12-годинному циклі світло/темрява. Усі тварини були розподілені випадковим чином. Через тиждень після прибуття тварин розділили на дві групи та годували або нормальною дієтою (ND; n=10), або дієтою з 0,2% аденіну (Ade; n=10) протягом 4 тижнів. Обидві групи ND і Ade також щодня отримували внутрішньоочеревинну ін’єкцію метформіну (250 мг/кг) за тиждень до початку дієти. Через 4 тижні ND або Ade тварин умертвляли, а нирки витягували під час анестезії Zoletil (10 мг/кг) (Virbac, Carros, France). Короткий метод підготовки мишей з односторонньою обструкцією сечоводу (UUO) описаний у Додаткових методах. Потім зразки нирок негайно заморожували в рідкому азоті та зберігали при температурі -80 градусів до використання.
Кількісна полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі, вестерн-блот аналіз
Рівні транскриптів генів, включаючи Ppargc1a, шлях запалення NLRP3, мітохондріальну динаміку, протеїн 3, індукований фактором некрозу пухлини (TNFAIP3), маркер окисного стресу та профіброзні маркери, порівнювали за допомогою кількісної полімеразної ланцюгової реакції (qPCR). Послідовності праймерів, використані в цьому дослідженні, описані в Додатковій таблиці 1. Більш детальні методи описані в Додаткових методах. Рівні експресії білка PGC-1, шляху запалення NLRP3, TNFAIP3, маркера окисного стресу та профіброзних маркерів досліджували за допомогою Вестерн-блот аналізу. Детальні методи та інформація про антитіла описані окремо в Додаткових методах.
Аналіз збірки запалення NLRP3
Для визначення олігомеризації асоційованого з апоптозом плямистого білка, що містить домен рекрутування каспази (ASC), був проведений аналіз перехресного зв’язування, опосередкований дисукцинімідилсубератом (DSS) (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США). раніше [26]. Коротше кажучи, RTECS і клітини із зразків ниркових тканин були осаджені центрифугуванням і лізовані в 0.5 мл буфера для лізису, що містить 20 мМ Hepes KOH, рН7,5, 150 мМ KCl, 1% NP40, 0,1 мМ PMSF та суміш інгібіторів протеази на льоду. Лізати клітин центрифугували при 6000 об/хв при 4 градусах протягом 10 хв. Гранули двічі промивали PBS і потім ресуспендували в 500 мкл PBS. Ресуспендовані гранули зшивали свіжим DSS (2 мМ) протягом 30 хвилин, а потім осадили центрифугуванням при 6000 об/хв протягом 10 хвилин. Зшиті гранули ресуспендували в 30 мкл буфера для зразків SDS і фракціонували на 12% SDS поліакриламідному гелі з подальшим імуноблоттингом з антитілом ASC (Cell Signaling Technology, MA, США).
Вимірювання рівня окисного стресу
Рівні окислювального стресу (малонового діальдегіду [MDA]) вимірювали в RTEC і тканинах нирок за допомогою набору для аналізу MDA (Abcam, Cambridge, MA, USA). 10 мг RTEC гомогенізували на льоду в 300 мкл буфера для лізису MDA (Abcam, Cambridge, MA, USA), потім центрифугували (13,000 × g, 10 хв) для видалення нерозчинних матеріалів. 10 мл плазми змішували з 500 мкл 42 мМ H2SO4 і 125 мкл розчину фосфорновольфрамової кислоти при кімнатній температурі протягом 5 хв. Після центрифугування (13,000 × g, 3 хв) осад ресуспендували на льоду з 100 мкл подвійної дистиляції H2O. Потім 200 мкл розчину та 600 мкл 2-розчину тіобарбітурової кислоти інкубували при 95° протягом 60 хв перед охолодженням до кімнатної температури на крижаній бані протягом 10 хв. Інтенсивність поглинання при 532 нм була пропорційна рівню MDA.
Виділення мітохондрій
RTEC фракціонували на цитозоль і мітохондрії за допомогою набору для виділення мітохондрій (BioVision, Inc. CA, США) згідно з протоколом виробника. Коротше кажучи, клітини збирали та промивали 10 мл охолодженого PBS. Клітини центрифугували при 600 × g протягом 5 хвилин при 4 градусах і ресуспендували в 1,0 мл буфера для екстракції цитозолю 1 ×. Гомогенізацію проводили на льоду та центрифугували при 1200 × g протягом 10 хвилин при 4 градусах для видалення ядер та інтактних клітин. Зібраний супернатант центрифугували при 10,000 × g протягом 30 хвилин при 4 градусах. Отримані осадки ресуспендували в 1,0 мл буфера для екстракції цитозолю 1 × і центрифугували при 10,000 × g протягом 30 хвилин при 4 градусах для отримання мітохондрій. Отримані мітохондрії лізували в 30 мкл буфера для мітохондріального лізису і додавали до 100 мкл суміші ферментів (включеної в набір для виділення) зі 100 мкл абсолютного етанолу. Після центрифугування отриманий осад був мтДНК. Цитозольну мтДНК отримували з супернатанту після осадження етанолом. Концентрацію мтДНК визначали методом КПЦР.
Оцінка динаміки та функції мітохондрій
Для візуалізації мітохондріальної динаміки використовували імунофлуоресцентне фарбування мітохондрій MitoTracker Deep Red (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). RTEC фіксували в 4% параформальдегіді та блокували в DPBS, що містить 5% нормальної кролячої сироватки та 0.1% Твіну- 20. Потім клітини пофарбували анти-мишачим NLRP3, MitoTracker, а потім AlexaFluor594-кон’югованими козячими антикролячими антитілами (Jackson ImmunoResearch, Вест-Гроув, Пенсильванія), і, нарешті, слайди монтували за допомогою DAPI та зробили зображення. Далі ми досліджували мітохондріальну структуру за допомогою стандартної трансмісійної електронної мікроскопії. Первинні RTEC фіксували сумішшю 2% параформальдегіду та 2,5% глутарового альдегіду протягом ночі, промивали, зневоднювали та заливали в смолу відповідно до стандартних процедур. Мітохондрії досліджували під мікроскопом JEOL 1011 (JEOL, Токіо, Японія). Для оцінки швидкості дихання мітохондрій використовували аналізатор позаклітинного потоку Seahorse Bioscience × 24 (Seahorse Bioscience, Billerica, MA, США). Для вимірювання виробництва мітохондріальних АФК клітини ресуспендували у збалансованому сольовому розчині Хенка після відповідної обробки та фарбували MitoSOX (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США) при 37 градусах протягом 20 хвилин. Флуоресценцію клітин вимірювали проточним цитометром (FACSVerse, BD Biosciences, Сан-Хосе, Каліфорнія, США). Для аналізу потенціалу мітохондріальної мембрани використовувався набір для аналізу потенціалу мітохондріальної мембрани тетраметилродаміну (TMRE) (Abcam, Кембридж, Массачусетс, США).
РЕЗУЛЬТАТИ
Зміни в PGC-1, мітохондріальній динаміці та шляху запалення NLRP3 під час ушкодження нирок Спочатку ми дослідили експресію PGC-1, мітохондріальну динаміку та шлях NLRP3 у RTECs, оброблених TGF- 1 . У цих клітинах обробка TGF- 1 знизила рівень транскрипту та білка Ppargc1a (рис. 1A, B та додаткова рис. 1A). Відповідно, рівні експресії мРНК мітофузину (Mfn), пов’язаного з мітохондріальним злиттям гена, і мітохондріального фактора транскрипції A (Tfam), який представляє масу мітохондрій, були значно знижені, тоді як рівень експресії динамін-пов’язаного білка 1 (Drp1), мітохондріального гена, пов'язаного з поділом, було збільшено порівняно з контролем (рис. 1C). Крім того, лікування TGF- 1 активувало передачу сигналів інфламмасоми NLRP3, про що свідчить підвищений рівень експресії генів і білків, пов’язаних із шляхом запалення NLRP3 (рис. 1D, E та додаткова рис. 1B). Концентрації IL-1 та IL-18, кінцевих продуктів шляху NLRP3, в клітинних лізатах, оброблених TGF- 1-, виміряні за допомогою ELISA, були збільшені (рис. 1F). Крім того, рівні експресії фіброзних маркерів, включаючи фібронектин і колаген 1, і індекс апоптотичної клітинної смерті співвідношення Bax/bcl-2 і розщепленої каспази-3 також були підвищені (рис. 1G, H і додаткова рис. 1C). ). Ці висновки були подібними в моделі пошкодження нирок, спричиненого аденіном (рис. 2A–H і додатковий рис. 1D–F). Таким чином, під час пошкодження нирок відбуваються значні зміни в експресії PGC-1 і мітохондріальній динаміці разом з активацією шляху запалення NLRP3.
Рис. 1 Зміни в PGC-1, мітохондріальній динаміці та шляху запалення NLRP3 у RTECs, оброблених TGF- 1-. Рівні експресії мРНК і білка B PGC-1 були знижені в RTECs, оброблених TGF- 1-. Експресія C мРНК генів, пов’язаних з мітохондріальною динамікою, включаючи Mfn, Tfam і Drp1, була змінена в RTEC, оброблених TGF- 1-. Рівні експресії мРНК D і білка E на шляху запалення NLRP3 були підвищені в RTEC, оброблених TGF{{10}}. F Концентрації IL-1 та IL-18, оцінені за допомогою ELISA, були підвищені в RTECs, оброблених TGF- 1-. Рівні експресії G мРНК і H білка фіброзних маркерів, включаючи фібронектин і колаген 1, а також маркерів апоптотичної смерті клітин Bax/bcl-2 і розщепленої каспази-3 були підвищені в RTECs, оброблених TGF- 1-. Примітка: *P <0,05 порівняно з контролем. PGC-1 пероксисомний проліфератор-коактиватор-1 ; Сімейство NLRP3 NOD-подібних рецепторів, піриновий домен 3; ASC, асоційований з апоптозом плямистий білок, що містить домен рекрутування каспази; RTEC епітеліальна клітина ниркових канальців; Mfn мітофузин; Tfam мітохондріальний транскрипційний фактор А; Drp1 споріднений з динаміном білок 1; ІФА імуноферментний аналіз.
PGC-1 відновлює порушену динаміку та морфологію мітохондрій під час пошкодження нирок
Далі ми перевірили, чи може PGC-1, ключовий регулятор мітохондріального біогенезу, послабити мітохондріальну динаміку під час пошкодження нирок. Щоб модулювати експресію Ppargc1, ми додатково використовували плазміду Ppargc1a, siRNA проти Ppargc1 (siPGC-1) і метформін, непрямий активатор PGC-1. Як і очікувалося, порушені гени, пов'язані з мітохондріальною динамікою, були відновлені за допомогою надмірної експресії Ppargc1. Навпаки, нокдаун Ppargc1a за допомогою siPGC-1 зменшив експресію Mfn і Tfam, але збільшив експресію Drp1 (рис. 3A–C і додаткові рис. 2A, B). Ці висновки були підтверджені додатковими експериментами з метформіном (рис. 3D–F і додатковий рис. 2C, D). Такі поліпшення призвели до відновлення функції мітохондрій. Відновлення PGC-1 за допомогою плазміди Ppargc1a та метформіну значно покращило зниження потенціалу мітохондріальної мембрани та зниження швидкості споживання кисню в RTECs, оброблених TGF- 1 (додатковий рис. 3A–D). Відповідно до змін у PGC-1, експресія фосфо-AMP-активованої протеїнкінази (p-AMPK) була знижена в клітинах, оброблених TGF- -, тоді як лікування метформіном відновлювало ці експресії (рис. 3F і Додаткова рис. 2E). Однак метформін не підвищував рівні експресії мРНК і білка PGC-1 у RTECs із глушінням Ppargc1a. Ці результати свідчать про те, що AMPK опосередковує дію метформіну, а PGC-1 є наступним ефектором AMPK (додатковий рис. 2F, G, J). Сприятливий вплив метформіну на мітохондріальну динаміку також було скасовано шляхом придушення Ppargc1a (додатковий рис. 2H–J). In vivo лікування метформіном також відновлювало рівень транскрипту Ppargc1 і скасовувало змінену експресію генів, пов’язаних з мітохондріальною динамікою, у мишей, яких годували аденіном і UUO (рис. 3G–I і додаткова рис. 2K, L, 4A–E). Активність AMPK метформіну також була підтверджена in vitro на моделі з аденіном (рис. 3I та додаткова рис. 2M). Електронно-мікроскопічне дослідження також підтвердило втрату цілісності мітохондрій у RTEC мишей, які отримували аденін і UUO. Однак вони були значно покращені метформіном (рис. 3J і додаткова рис. 4F). Ці результати свідчать про те, що PGC-1 відновлює порушену динаміку, морфологію та функції в мітохондріях під час пошкодження нирок.
Пошкодження мітохондрій може призвести до загибелі ниркових клітин і фіброзу. Ми спостерігали підвищені рівні експресії фіброзних маркерів, включаючи фібронектин і колаген 1, і індекс апоптотичної клітинної смерті співвідношення Bax/bcl-2 і розщепленої каспази-3 в RTEC після лікування TGF- 1. Ці підвищені експресії маркерів клітинної смерті були послаблені надмірною експресією PGC-1 і метформіну, тоді як посилені siPGC-1 (рис. 4A–D і додаткові рис. 5A, B). Згідно з цими висновками, рівні експресії фіброзних маркерів та індекс апоптотичної клітинної смерті були значно підвищені у мишей, які отримували аденін та UUO. Навпаки, метформін змінив усі ці вирази (рис. 4E, F і додатковий рис. 5C, 6A, B). Трихромне фарбування за Массоном також підтвердило покращення фіброзу метформіном (рис. 4G). Примітно, що розширені маркери клітинної смерті та передача сигналів NLRP3 у RTECs, оброблених TGF-, були змінені Z-Asp-2,6- дихлорбензоїлоксиметилкетоном (Enzo Life Science, Фармінгдейл, Нью-Йорк, США), пан-каспазою інгібітор, що свідчить про те, що пошкодження, спричинене TGF- -, ймовірно, опосередковується пошкодженням мітохондрій і раннім апоптозом (додаткова рис. 7A–D). Ці результати разом свідчать про те, що активація PGC-1 послаблює пошкодження мітохондрій і зменшує загибель клітин і фіброз нирок.
PGC-1 модулює
Сигнальний шлях запалення NLRP3 Потім ми додатково дослідили зв’язок між PGC-1 і шляхом запалення NLRP3 у опосередкуванні пошкодження нирок. Коли надекспресію PGC-1 індукували за допомогою трансфекції плазміди Ppargc1a, рівні експресії NLRP3, ASC, IL-1 та IL-18 були знижені в RTEC, оброблених TGF- 1- ( 5A, B і додатковий рис. 8A). Концентрації IL-1 та IL-18 в клітинних лізатах, оброблених TGF- 1-, виміряні за допомогою ELISA, також були знижені після трансфекції плазміди Ppargc1a (рис. 5C). Лікування метформіном дало аналогічний результат (рис. 5D, E та додаткова рис. 8B). Однак нокдаун Ppargc1a призводив до підвищених рівнів експресії генів і білків, пов’язаних із шляхом запалення NLRP3 (рис. 5A, B і додаткова рис. 8A). Крім того, активація сигнального шляху запалення NLRP3 у мишей, які отримували аденін і UUO, була одночасно знижена метформіном (рис. 5F, G і додаткова рис. 6C, D, 8C). Концентрації IL-1 та IL-18 в RTEC та лізатах ниркової тканини були значно знижені під час лікування метформіном, виміряного за допомогою ELISA (рис. 5H).
Враховуючи здатність PGC-1 регулювати динаміку мітохондрій, ми перевірили роль Drp1 в активації запалення NLRP3. Інфламмасомна передача сигналів NLRP3 була значно знижена завдяки нокдауну Drp1. Однак у RTEC з нокдауном як Ppargc1a, так і Drp1 рівні експресії компонентів запалення NLRP3 не були знижені порівняно з такими в клітинах, оброблених TGF- 1-. У RTEC з надекспресією Ppargc1a та нокдауном Drp1 передача сигналів запалення NLRP3 була менш активованою (додаткова фіг. 9A, B). Ці результати показують, що Drp1 може частково опосередковувати активацію запалення NLRP3, але інші дії PGC-1 беруть участь у регуляції сигнального шляху NLRP3.
Ми далі перевірили, чи існує сигнал зворотного зв'язку від інфламмасоми NLRP3. З цією метою ми отримали RTEC шляхом первинної культури від мишей з нокаутом Nlrp3. У цих клітинах, оброблених TGF- 1, спостерігалася менша активація передачі сигналу NLRP3, ніж у аналогічних клітинах, що призвело до покращення мітохондріальної динаміки (додатковий рис. 10A–E). Відповідно, спостерігалися супутні покращення фіброзних змін і загибелі клітин за відсутності Nlrp3 (додатковий рис. 10F, G). Ці знахідки свідчать про можливий двонаправлений зв’язок між пошкодженням мітохондрій і передачею сигналів NLRP3.
Олігомеризація NLRP3 з адаптерним білком, ASC, є ключовим етапом утворення інфламмасомного комплексу. Таким чином, ми перевірили, чи впливає PGC- 1 на збірку інфламмасоми NLRP3. У RTEC, оброблених TGF- 1-, спостерігалося зв’язування ASC з NLRP3. Ця олігомеризація була значно знижена через надекспресію PGC-1 або метформіну, тоді як зв’язування було відновлено siPGC-1 (рис. 6A–C). У мишей, які отримували аденін, олігомеризація та активація NLRP3 були підтверджені зв’язуванням ASC з NLRP3, і це було скасовано метформіном (рис. 6D, E).
Нарешті, ми додатково дослідили вміст мітохондрій і супутню зміну експресії NLRP3. Конфокальне мікроскопічне дослідження виявило реципрокну зміну інтенсивності MitoTracker Red та експресії NLRP3 у RTEC з або без PGC-1. TGF- 1 зменшив інтенсивність фарбування MitoTracker, і це було відновлено за допомогою надмірної експресії PGC-1 і метформіну. І навпаки, підвищена експресія NLRP3 у RTECs, оброблених TGF- 1-, була знижена надмірною експресією PGC-1 і метформіном. Однак siPGC-1 змінив ці висновки (рис. 7). У сукупності ці результати вказують на те, що збірка інфламмасомного комплексу NLRP3 була індукована під час пошкодження нирок, а активація цього шляху була послаблена PGC-1.
Рис. 5 PGC-1 модулює сигнальний шлях запалення NLRP3. Рівні експресії мРНК і білка B інфламмасомного шляху NLRP3 були знижені в RTEC, оброблених TGF- 1-, з трансфекцією плазміди Ppargc1a, тоді як збільшені siPGC-1. C Концентрації IL- 1 та IL-18, оцінені за допомогою ELISA, були знижені в RTECs, оброблених TGF- 1-, із надмірною експресією Ppargc1a. Рівні експресії мРНК D і білка E на шляху запалення NLRP3 були послаблені в RTEC, оброблених TGF- 1- метформіном. Рівні експресії F-мРНК і G-білка шляху запалення NLRP3 і H-концентрації IL-1 і IL-18, оцінені за допомогою ELISA, були послаблені у мишей, які отримували аденін і метформін. Примітка: *P < 0.05 проти контролю; **P <0,05 порівняно з мишами, які отримували TGF- 1-, або мишами, яких годували аденіном. PGC-1 пероксисомний проліфератор-коактиватор-1 ; Сімейство NLRP3 NOD-подібних рецепторів, піриновий домен 3; ASC-асоційований з апоптозом плямистий білок, що містить домен рекрутування каспази; RTEC епітеліальна клітина ниркових канальців; ІФА імуноферментний аналіз; Адеаденін; Метформін.
Рис. 6 PGC-1 модулює олігомеризацію інфламмасоми NLRP3 під час пошкодження нирок. Олігомерні структури A–C ASC, аналізовані DSS-опосередкованим перехресним зшиванням, спостерігалися в RTEC, оброблених TGF- 1-, які були ослаблені надмірною експресією Ppargc1a та метформіну, тоді як посилені siPGC-1. D, E ASC олігомерні структури спостерігалися у мишей, яких годували аденіном, які були ослаблені метформіном. Примітка: *P < 0.05 проти контролю; **P <0,05 порівняно з мишами, які отримували TGF- 1-, або мишами, яких годували аденіном. PGC-1 пероксисомний проліфератор-коактиватор-1 ; Сімейство NLRP3 NOD-подібних рецепторів, піриновий домен 3; ASC-асоційований з апоптозом плямистий білок, що містить домен рекрутування каспази; DSS disuccinimidyl suberate; RTEC епітеліальна клітина ниркових канальців; Адеаденін; Метформін.
PGC-1 керує вивільненням мтДНК, окислювальним стресом і TNFAIP3 для регулювання запалення NLRP3
Для подальшого з’ясування механізму зв’язку між PGC-1 і шляхом запалення NLRP3 при пошкодженні нирок ми спочатку дослідили зміни в мтДНК після пошкодження клітини, яке відоме як тригер активації запалення NLRP3. Число копій мтДНК було зменшено у мітохондріальній фракції та збільшено у цитозольній фракції після обробки TGF- 1, що свідчить про те, що мтДНК вивільнилася з мітохондрій у цитозоль. Примітно, що ці зміни були відновлені після надлишкової експресії Ppargc1a (рис. 8A).
Потім ми досліджували окислювальний стрес, позитивний регулятор запалення NLRP3. У RTEC, оброблених TGF- 1-, окислювальний стрес був помітно вираженим порівняно з контролем, про що свідчить підвищення інтенсивності фарбування MitoSOX і підвищення рівня MDA. Обробка плазмідою Ppargc1a та метформіном послабила це надлишкове виробництво мітохондріальних АФК. Навпаки, нокдаун Ppargc1a ще більше підвищив рівень окисного стресу в RTEC, оброблених TGF- 1- (рис. 8B–D). Подібно до результатів дослідження in vitro, рівні MDA були значно підвищені у мишей, які отримували аденін і UUO. Посилений окислювальний стрес був зменшений метформіном (рис. 8E та додатковий рис. 6E).
Нарешті, ми додатково дослідили TNFAIP3, який регулюється PGC-1 і також відомий як негативний регулятор запалення NLRP3. TGF- 1 знижував рівні транскриптів Tnfaip3, і це зниження експресії Tnfaip3 було відновлено шляхом відновлення PGC-1. Навпаки, нокдаун Ppargc1a призвів до подальшого зниження експресії Tnfaip3 (рис. 8F, G і додатковий рис. 8D, E). Крім того, спостерігалося зниження експресії TNFAIP3 у мишей, які отримували аденін і UUO, і метформін відновив цю експресію (рис. 8H і додаткові рис. 6F, 8F). У сукупності ці результати свідчать про те, що PGC-1 може регулювати запалення NLRP3 шляхом модуляції вивільнення мтДНК, мітохондріальних ROS/оксидативного стресу та TNFAIP3.
Служба підтримки Wecistanche - найбільшого експортера cistanche в Китаї:
Електронна адреса:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Тел.:+86 15292862950
Зверніться в магазин, щоб дізнатися більше про технічні характеристики:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
