Частина 1: Гераніол полегшує опосередковане доксорубіцином пошкодження нирок через зміну антиоксидантного статусу, запалення та апоптозу: потенційні ролі NF-kB і Nrf2/Ho-1

Для отримання додаткової інформації. контактtina.xiang@wecistanche.com

Анотація: Доксорубіцин-опосередкованийпорушення роботи нирокє серйозною проблемою в лікуванні раку. Відповідно, ця робота досліджувала здатність гераніолу модулювати індукований доксорубіциномураження нирокза допомогою моделі щура. Щурів випадковим чином розподілили на чотири групи: контроль, доксорубіцин (20 мг/кг, внутрішньоочеревинно, внутрішньовенно), доксорубіцин плюс 100 мг/кг гераніолу та доксорубіцин плюс 200 мг/кг гераніолу. Одноразова ін’єкція доксорубіцину викликала порушення функції нирок, про що свідчать зміни в рівнях креатиніну сироватки, азоту сечовини крові та альбуміну; це також викликало гістологічні зміни в архітектурі нирок. Крім того, доксорубіцин посилював перекисне окислення ліпідів, одночасно знижуючи відновлений глутатіон, активність каталази та експресію глутатіонпероксидази та супероксиддисмутази. Цікаво, що попереднє лікування гераніолом врятувало індуковані доксорубіцином зміни антиоксидантних параметрів нирок, ферментативної активності та експресії генів і білків, що опосередковують запалення та апоптоз. Крім того, профілактичне лікування гераніолом зберігало більшість гістологічних характеристик нирок залежно від дози. Ці результати підтверджують, що гераніол може захищати від опосередкованого доксорубіциномпорушення роботи нирок. Проте необхідні подальші дослідження, щоб з’ясувати механізми захисної дії гераніолу проти опосередкованої доксорубіцином дисфункції нирок.

Ключові слова: доксорубіцин; запалення; окислювальний стрес; апоптоз; ураження нирок; гераніол

1. Введення

З моменту свого відкриття антрацикліновий протираковий препарат доксорубіцин (Dox) широко використовувався проти солідних пухлин і гематологічних злоякісних новоутворень. Серед його найпоширеніших побічних ефектів — нефротоксичність, яка описується як порушення функції нирок зі зниженою фільтрацією, реабсорбцією та екскрецією, що пов’язано зі значним ризиком захворюваності та смертності. Близько 60 відсотків хворих на рак, які отримують хіміотерапію, розвивають нефротоксичність, що обмежує терапевтичну ефективність Dox [5,6]. Хоча фундаментальні процеси, які спричиняють Dox-опосередковану нефротоксичність, залишаються невідомими, література припускає, що ймовірні внески включаютьокислювальний стрес, запалення, іапоптоз. Зокрема, дані вказують на те, що зниження Dox-асоційованоокислювальний стрес, запалення, а апоптоз може допомогти зменшити ниркову токсичність препарату.

Ядерний фактор (еритроїдного походження 2)-подібний 2 (Nrf2) є окисно-відновним фактором транскрипції з антиоксидантною, протизапальною та цитопротекторною здатністю, який підтримує клітинні захисні системи. Після окисного стресу Nrf2 вивільняє свій цитоплазматичний білок-інгібітор, який потрапляє в ядро ​​та активує декілька генів, залучених до антиоксидантного захисту, таких як гемоксигеназа-1(Ho-1), глутатіонпероксидаза (GPx), каталаза( CAT) і супероксиддисмутаза (SOD) [14-19]. Показано, що лікування Dox знижує експресію як мРНК, так і білка Nrf2 і, отже, нижчих антиоксидантних генів і білків, що призводить до ниркової токсичності.

Ядерний фактор-kB (NF-kB) є фактором транскрипції, який регулює експресію багатьох запальних генів; як центральна фігура шляху NF-kB, який активується активними формами кисню (АФК), він може викликати запальну реакцію та, як наслідок, пошкодження тканин [8,22,23]. Численні дослідження показали, що Dox викликає запалення та збільшує вироблення прозапальних цитокінів, таких як інтерлейкін-6(IL-6), інтерлейкін-1 бета (L-1), і фактор некрозу пухлини-альфа (TNF-) [11,13]. Крім того, було показано, що збільшення виробництва АФК після пошкодження нирок, опосередкованого Dox, відіграє ключову роль в активації внутрішнього апоптотичного шляху через мітохондріальну нестабільність. Ключовими детермінантами цього шляху є асоційовані з мітохондріями білки Bax і Bcl-2; збалансоване співвідношення Bcl-2 і Bax запобігає апоптозу, тоді як дисбаланс призводить до підвищення проникності мембрани та витоку цитохрому с у цитозоль, що активує каспазу-9(Casp-9) і каспазу{ {21}} (Casp-3). Така активація зазвичай призводить до фрагментації ДНК і загибелі клітини.

Дуже цікаво максимізувати клінічне використання хіміотерапевтичних препаратів при мінімізації їх негативних ефектів. Відповідно, було вжито заходів для вивчення використання різних агентів у поєднанні з Dox для послаблення його несприятливих ефектів [13,30,31]. Трав’яні екстракти та їхні біологічно активні інгредієнти давно визнані своєю здатністю зменшувати опосередковану лікарськими засобами токсичність. Гераніол — це ациклічний монотерпеновий спирт, який міститься майже у всіх ефірних оліях, наприклад, імбирній, трояндовій, апельсиновій, лавандовій та лимонній [32,33]. Численні дослідження показали, що гераніол має різні корисні властивості, такі як противиразкові, протиракові [35], антидепресивні [36], протизапальні [33], і, крім того, він може полегшити діабетичну нефропатію [37] .

Наскільки нам відомо, наразі немає конкретної інформації щодо профілактичних ефектів гераніолу проти нефротоксичності, опосередкованої Dox. Таким чином, ми вивчили ефекти та ймовірні механізми дії гераніолу на пошкодження, спричинені Dox через сигнальні шляхи NF-kB та Nrf2/Ho-1 у нирках щурів Wistar.

2. Матеріал і методи

2.1.Тварини

Самці щурів Wistar були отримані з центру догляду за тваринами Університету короля Сауда (KSU) в Ер-Ріяді, Саудівська Аравія. Тварин утримували в контрольованих умовах, наприклад, їх утримували при кімнатній температурі (25 ± 1 градус) з 12-годинним циклом світла/темряви та мали необмежений доступ до води та стандартної дієти, як дозволено Комітетом з етики місцевих інституційних досліджень KSU (REC) під номером авторизації KSU-SE-19-122.

2.2. Експериментальний дизайн

У цьому дослідженні було досліджено 32 самця щурів Wistar вагою 190-210 г, розподілених на чотири групи. Перед дослідженням щурам дали тиждень на адаптацію до середовища. Група носія, також відома як контрольна група, складалася з щурів, яким перорально вводили фізіологічний розчин. Групу II складали щури, які отримували Dox (20 мг/кг внутрішньовенно одноразово) на 17 день [11]. Щурам 3-ї та IV групи вводили профілактичні дози гераніолу (перорально) 100 і 200 мг/кг відповідно протягом 18 днів, а на 17-й день також вводили Dox (20 мг/кг, внутрішньовенно). На 18 день щурів евтаназували, використовуючи комбінацію кетаміну/ксилазину в контрольованому середовищі. Була зібрана кров і виділена сироватка, обидві нирки були видалені і негайно швидко заморожені в рідкому азоті. На заморожених тканинах проводили біохімічний аналіз, аналіз експресії генів і білка. Для гістологічного дослідження зразки ниркової тканини промивали PBS, а потім зберігали в 4% розчині формальдегіду. Під час дослідження не було виявлено ознак дистресу чи смерті піддослідної тварини.

2.3. Визначення маркерів функції нирок

Щоб виділити сироватку з крові, зібраної під час умертвіння, зразки крові центрифугували протягом 10 хвилин при 2000×g у попередньо охолодженій центрифузі. Потім отриману сироватку аналізували для кількісного визначення альбуміну, азоту сечовини крові (BUN) і креатиніну. Цінностіфункції нирокмаркери були розраховані за допомогою Siemens Autoanalyzer Dimension RXL MAXTM, Siemens, Вашингтон, округ Колумбія, США.

2.4. Оцінка перекисного окислення ліпідів

Перекисне окислення ліпідів оцінювали в тканинах нирок, як описано раніше Ohkawa та ін., з невеликими модифікаціями.

2.5. Кількісне визначення відновленого глутатіону

Рівні відновленого глутатіону (GSH) у нирковій постмітохондріальній надосадовій рідині (PMS) вимірювали відповідно до методу, описаного Sedlak і Lindsay, з незначними модифікаціями.

2.6. Кількісна оцінка активності каталази

Активність CAT при нирковому ПМС визначали за методом, описаним Claiborne, з незначними модифікаціями.

2.7. Аналіз експресії генів (RT-qPCR)

Реагент TRIzolTM (Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) використовували для екстракції загальної РНК із тканини нирок відповідно до вказівок виробника. Чистоту та кількість екстрагованих зразків РНК визначали за допомогою спектрофотометра NanoDropTM 8000 (Thermo Scientific, США). Потім ізольовану РНК зворотно транскрибували в кДНК за допомогою cDNA Synthesis SuperMix (Bimake, Houston, TX, USA), а експресію генів кількісно визначали за допомогою SYBR Green Master Mix (Bimake, Houston, TX, USA) на Applied Biosystems 7500 Fast Real- Часова система ПЛР. Потім був використаний підхід AACt для визначення відносної експресії різних генів у групах, причому GAPDH використовувався як ген господарювання. У таблиці 1 наведено послідовності праймерів, використаних у цьому дослідженні (IDT, Левен, Бельгія).

2.8. Імуноблот аналіз

Вестерн-блот аналіз проводили, як описано Alasmari et al. [41]. Коротко, ізольовані білки (30-50 мкг) піддавали електрофорезу на SDS-PAGE гелі, а потім переносили на мембрани PVDF. Після блокування 5-відсотковим знежиреним сухим молоком протягом 60 хвилин блоти досліджували протягом ночі при 4 градусах селективними первинними антитілами (проти Ho-1, Nrf2, TNF-, I6, NF-kB-p65, розщепленої каспази{{ 14}}, Bcl-2, Bax і GAPDH, розведення 1:1000). Згодом мембрани промивали, потім інкубували протягом 60 хвилин при кімнатній температурі з відповідними кон’югованими з HRP вторинними антитілами (розведення: 1:5000). Набір реагентів ECL та обладнання для гелевої візуалізації (Bio-Rad, Hercules, CA, США) використовували для виявлення присутності білків на мембрані.

2.9. Гістопатологічні дослідження

Тканини нирок постфіксували в 4% формальдегіді, потім обробляли для парафінового зрізу та фарбування. Для вирізання парафінових зрізів товщиною 3 мкм використовували мікротом. Зрізи потім обробили, щоб видалити віск, і пофарбували за допомогою барвника гематоксилін плюс еозин (H&E) для гістопатологічного дослідження. Гістологічні зображення нирок були отримані за допомогою камери DP72, підключеної до мікроскопа Olympus BX.

2.10. Аналіз даних

Дані були проаналізовані за допомогою комп’ютерної програми Graph Pad Prism 5 (Сан-Дієго, Каліфорнія, США), і результати представлені як середні значення та стандартні відхилення (середнє ± SD). Міжгрупові відмінності оцінювали за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з подальшим порівняльним тестом Тьюкі, із значенням p менше 0,05, що вказує на статистичну значущість (p<>