Частина 1: 3-Гідроксифенілоцтова кислота: флавоноїдний метаболіт, що знижує артеріальний тиск

Контакти:tina.xiang@wecistanche.com

Анотація: Регулярне споживання їжі, багатої поліфенолами, асоціюється з широким спектром корисних наслідків для здоров’я, включаючи профілактикусерцево-судинні захворювання. Однак батькофлавоноїди мають здебільшого низьку біодоступність і, отже, їх метаболіти вважаються біоактивними. Раніше повідомлялося, що один із цих метаболітів, 3-гідроксифенілоцтова кислота (3-HPAA), що утворюється кишковою мікробіотою, має судинорелаксуючий ефект ex vivo. Метою цього дослідження було пролити більше світла на цей ефект in vivo та з’ясувати механізм дії. 3-HPAA призвела до дозозалежного зниження артеріального тиску при внутрішньовенному введенні у вигляді болюсу та інфузії щурам зі спонтанною гіпертензією. Навпаки, суттєвих змін частоти серцевих скорочень не спостерігалося. В експериментах ex vivo, де для зменшення потреби в лабораторних тваринах використовувалися свинячі серця з бійні, 3-HPAA розслабляла попередньо скорочені сегменти коронарної артерії свиней за допомогою механізму, який частково залежить від цілісності ендотелію. Ця релаксація була значно порушена після інгібування ендотеліальної синтази оксиду азоту. Навпаки, блокада каналів SKCa або IKCa або мускаринових рецепторів не впливала на 3-розслаблення HPAA. Подібним чином не спостерігалося впливу 3-HPAA на циклооксигеназу та кальцієві канали L-типу. Таким чином 3-HPAA знижуєтьсякров’яний тискin vivo через розслаблення судин, і цей механізм може базуватися на вивільненні оксиду азоту ендотеліальним шаром.

Ключові слова: флавоноїди; кишкова мікробіота;метаболіт;3-гідроксифенілоцтова кислота;артеріальний тиск;розслаблення судин; коронарний; артерія; щур; свиня

1. Введення

Серцево-судинні захворювання є основною причиною смерті в усьому світі, за оцінками, кількість смертей наближається до 18 мільйонів на рік. Ішемічна хвороба серця та інсульт спричиняють приблизно 85 відсотків цих летальних серцево-судинних подій [1]. Глобальна смертність і захворюваність спонукали до впровадження рекомендацій щодо профілактики серцево-судинних ризиків [2]. Виявлення стійкого високого артеріального тиску з подальшим лікуванням є однією з основних стратегій [34]. Дійсно, гіпертонія класифікується як основний фактор ризику серцево-судинних захворювань. Це здебільшого викликано підвищеним системним судинним опором, і це часто пов’язано з різними структурними та функціональними змінами в судинній системі, які порушують гомеостаз судин. Зокрема, дисфункціональна оболонка кровоносних судин, утворена одним шаром ендотеліальних клітин. Крім того, клітини гладких м’язів судин часто здаються більш скороченими та менш чутливими до розслаблюючих факторів ендотелію [5].

Кілька досліджень надали докази захисної дії багатої на поліфеноли дієти проти серцево-судинних захворювань. Дійсно, дієта, багата фруктами, овочами, горіхами, шоколадом або чаєм, які є багатими джереламифлавоноїди, асоціюється зі зниженням ризику серцево-судинних захворювань [6]. Крім антиоксидантних, протизапальних, антитромбоцитарних і протимікробних властивостей,флавоноїдитакож мають значні судинорозширювальні властивості [7,8]. Однак споживання флавоноїдів у всьому світі дуже різне, і після потрапляння в організм ці сполуки складним чином взаємодіють із шлунково-кишковим трактом. Коротко кажучи, флавоноїди зустрічаються в рослинах переважно у форміглікозиди. Після введення у вигляді дієти вони гідролізуються під час травлення, що дозволяє вивільнити форму аглікону в тонкій кишці. Аглікони, у свою чергу, можуть піддаватися метаболізму в епітелії тонкої кишки і пізніше в печінці. Це призводить до дуже низької біодоступності вихідних флавоноїдів, що було неодноразово підтверджено [9,10]. Однак неабсорбована фракція проходить із тонкої кишки в дистальну кишку, де вона розщеплюється мікробіотою товстої кишки, що призводить до виробництва невеликих фенольних сполук, включаючи фенілпропіонову, фенілоцтову, бензойну кислоти та гідроксибензоли, які згодом абсорбуються [ 9]. Слід зазначити, що за останні кілька десятиліть стало зрозуміло, що захисні ефекти дієтичних флавоноїдів пояснюються їхніми метаболітами, а не їхніми вихідними формами [10-12]. Незважаючи на це, Бут і його колеги задокументували ще на початку 1950-х років наявність різних метаболітів флавоноїдів, а саме 3,4-дигідроксифенілоцтової (DHPA), 3-гідроксифенілоцтової (3-HPAA) і гомованілової кислот. в сечі різних видів тварин після перорального прийомукверцетин[13]; Дослідження біологічного ефекту малих фенольних метаболітів флавоноїдів є набагато пізнішими. Зокрема, в останні роки дослідження метаболічної долі флавоноїдів, а також дослідження біоактивності їхніх мікробних метаболітів стали гарячою та інтенсивно дослідженою темою в цій галузі. Наша дослідницька група показала, що кілька мікробних метаболітів, включаючи DHPA, 4-метилкатехол і 3-(3-гідроксифеніл)пропіонову кислоту, розслаблюють аорту щурів, ймовірно, у фізіологічно досяжних концентраціях [14,15 ]. Наскільки нам відомо, 3-HPAA є одним із найменш вивчених метаболітів. Документально підтверджено, що він є метаболітом ряду фенольних сполук, включаючи різні класи флавоноїдів, таких як флавоноли (кверцетин з його глікозидом рутин, кемпферол), ізофлавони та флаваноли (як олігомерні проціанідини, так і їх мономерні одиниці, катехін та епікатехін) (рис. 1) [16-20].

Оскільки 3-HPAA розслаблює клітини гладких м’язів ex vivo [14], це дослідження мало на меті перевірити, чи здатний цей метаболіт спричиняти зниження артеріального кров’яного тиску in vivo, і виявити механізм його дії в серії механічних експериментів .

2. Матеріали та методи

2.1. Тварини

Експерименти in vivo проводили на щурах зі спонтанною гіпертензією (SHR), отриманих від Чеської академії наук, Прага, Чеська Республіка. Тварин розводили в тваринницькому приміщенні факультету фармації та підтримували при постійній температурі 23-25 градусів з 12-годинним циклом темрява/світло. Щурам надавали стандартну дієту та водопровідну воду ad libitum. Дослідження (реєстр. №.4937 2019-9) було схвалено Міністерством освіти, молоді та спорту відповідно до Посібника з догляду та використання лабораторних тварин, опублікованого Національним інститутом здоров’я США (8-е видання, переглянуте 2011, ISBN-13:978-0-309-15400-0).

2.2.Хімічні речовини

Пентобарбітал, нітропрусид натрію, диметилсульфоксид (ДМСО), метиловий ефір L-Nw-нітроаргініну (L-NAME), атропін, TRAM-34/1-[(2-хлорфеніл)дифенілметил] -1H-піразол, індометацин, ніфедипін, брадикінін, KCl, CaCl та UCL-1684/6,12,19, 20,25,26-гексагідро-5,27 :13,18:21,24-триетено-11,7-метено-7Н-дибензо[b,m][1,5,12,16]тетраазациклотрикозин{{ 29}},13-гідрат трифторацетату діуму було придбано у Sigma-Aldrich (Steinheim, Німеччина). Bay K8644 було отримано від Axon Medchem BV (Гронінген, Нідерланди). Випробуваний метаболіт 3-HPAA було придбано в Toronto Research Chemicals (Торонто, Онтаріо, Канада). NaCl, NaHCO3 і D-глюкоза були надані PENTA sro (Прага, Чеська Республіка). MgSO4.7H2O був придбаний у Erba Lachema sro (Брно, Чеська Республіка), а KH2PO4 у Dr. Kulich Pharma sro (Градец Кралове, Чехія). республіка). Фізіологічний розчин був придбаний у Baxter Czech spol. sro (Прага, Чехія) та гепарин від Zentiva (Прага, Чехія).

Нітропрусид натрію, L-NAME і атропін розчиняли в дистильованій воді. Базові розчини TRAM-34（1 мМ） і UCL-1684（100 мкМ） готували як водні розчини з додаванням 20 відсотків і 10 відсотків ДМСО відповідно. Базовий розчин індометацину (1 мМ) також готували в 10% ДМСО/воді, а Bay K8644 (10 мМ) і ніфедипін (10 мМ) розчиняли в чистому ДМСО. Кінцева концентрація ДМСО в тканинній камері була завжди<0.2%.the krebs="" solution="" contains="" the="" following="" (mm):="" nacl119,="" kcl4.7,="" cacl2="" 1.25,kh2po41.18,="" mgso4.7h2o1.17,="" nahco325,="" and="" d-glucose="">

2.3. Експерименти In Vivo

Дванадцять щурів SHR (середня вага 356 ± 21 г, артеріальний тиск під наркозом 211 ± 64/152 ± 45 мм рт. ст., частота серцевих скорочень 381 ± 37 уд./хв) анестезували внутрішньовенно пентобарбіталом (50 мг. кг-). Датчик тиску MLTO380/D був під’єднаний до лівої загальної сонної артерії, і артеріальний кров’яний тиск із частотою серцевих скорочень реєструвався за допомогою пристрою Power Lab, підключеного до програмного забезпечення LabChart 7 (ADInstruments, Сідней, Австралія). Ліву підшкірну вену канюлювали для внутрішньовенного введення болюсу або інфузії. Після операції кожному щуру давали стабілізуватися протягом 15 хвилин перед експериментом. 3-HPAA розчиняли у фізіологічному розчині та вводили за двома протоколами: (1) у вигляді одноразової болюсної дози в діапазоні від 0.001–10 мг кг{{18 }}(застосовуваний об’єм завжди становив 0,1 мл, n=8); або (2) у вигляді чотирьох послідовних 5-хвилинних інфузій у дозах 0,05, 0,25, 1 та 5 мг.кг-1.хв-1 （n=4） зі швидкістю інфузії 50 мкл за хвилину за допомогою шприцевого насоса «Genie» Kent （Kent Scientific Corporation, Torrington, CT, USA) (Малюнок 2a). В обох протоколах наступну дозу завжди вводили після того, як артеріальний тиск був стабільним протягом щонайменше 5 хвилин. Для контролю кожну тварину обробляли фізіологічним розчином за тих самих умов перед першим введенням 3-HPAA. Після вимірювання кожного щура забивали внутрішньовенним розчином KCl (1 мл, 1 моль·л). Температуру тіла під час експерименту підтримували на рівні 36,5±0,5° за допомогою нагрівальної плити.

2.4. Експерименти Ex Vivo

2.4.1. Підготовка тканин

Експерименти ex vivo проводили на кільцевих сегментах коронарних артерій свиней (рис. 2b). Свинячі серця (n= 11) були отримані з місцевої бійні. Свині були здоровими тваринами обох статей, стандартного розведення та під ветеринарним контролем, призначені для споживання. Серця для експерименту обробляли приблизно через 4 години після забою тварини. Серця занурювали в розчин Кребса, і ліву огинаючу коронарну артерію негайно вирізали, знову занурювали в розчин Кребса і очищали від прилиплого жиру, сполучної тканини та крові. Після цього очищену коронарну артерію розрізали на циліндричні кільця довжиною приблизно 3 мм. Для певних механічних експериментів ендотеліальний шар механічно порушували шляхом обережного тертя люмінальної поверхні щипцями. Кільця зберігали в тканинних ваннах, наповнених розчином Кребса, в умовах насичених киснем (95 відсотків O і 5 відсотків CO2) при 37 градусах. Кожне кільце артерії було підвішено між двома дротяними гачками з нержавіючої сталі, один з яких був закріплений на тримачі, а другий підключений до датчика та комп’ютера, оснащеного програмним забезпеченням SPEL Advanced Kymograph, v3.2 (Experimetria Ltd., Будапешт, Угорщина). Таке розташування дозволяє вимірювати ізометричний натяг. Препарати врівноважували при напрузі 2 г протягом 40 хв, протягом яких розчин Кребса замінювали кожні 10 хв. Після цього натяг встановлювали на рівні 1 г (базова лінія), кожну тканинну ванну наповнювали 5 мл розчину Кребса, і був проведений наступний тест на життєздатність: коронарні кільця були скорочені за допомогою KCl (кінцева концентрація всередині ванни становила 40 мМ), і коли плато було досягнуто, додали брадикінін (300 нМ), щоб підтвердити інтактний ендотелій або оголені кільця. Потім коронарні кільця кілька разів промивали розчином Кребса.

2.4.2. Підтвердження судинорозширювальної активності 3-HPAA на коронарній артерії свиней

Вазорелаксуючу активність вимірювали на попередньо скорочених KCl (40 мМ) артеріальних кільцях (рис. 2b). Після досягнення плато3-HPAA кумулятивно додавали у ванну в концентраціях від 100 мкМ до 1 мМ.3-HPAA готували в розчині Кребса. Розчин Кребса без досліджуваної сполуки додавали до деяких коронарних кілець як контроль за тією ж процедурою. Кожну дозу застосовували після стабілізації реакції релаксанта, спричиненої попередньою дозою, і нітропрусид натрію (100 мкМ) використовували для індукції максимального розслаблення в усіх експериментах наприкінці процедури.

2.4.3. Механістичні експерименти

У наступних експериментах досліджували механізм судинорозширювальної дії 3-HPAA на неушкоджених коронарних кільцях ендотелію з використанням інгібітора синтази оксиду азоту (NO), L-NAME（100 мкМ）; антагоніст мускаринових рецепторів, атропін （50 мкМ）; інгібітор циклооксигенази (ЦОГ), індометацин (10 мкМ); або інгібітори Ca2 плюс -активованих каналів Kt із середньою та малою провідністю, TRAM-34（10 мкМ） та UCL-1684 （1 мкМ）, відповідно (рис. 2b). Атропін або інгібітори завжди додавали за 30 хв до додавання KCl (40 мМ). Після цього в окремому експерименті було досліджено участь судинних каналів Cay1.2 Ca2 plus (L-типу) у 3-HPAA-індукованій вазорелаксації шляхом попередньої обробки оголених ендотелієм коронарних кілець 15 мМ KCl з подальшою інкубацією з 3-HPAA в концентрації 1 мМ протягом 30 хв. Потім активатор кальцієвих каналів L-типу, Bay K8644, було застосовано кумулятивно (100 пМ-10мкМ) у темряві, щоб викликати скоротливу відповідь. Для індукції максимального скорочення використовували KCl (80 мМ). Кільця, інкубовані з відповідним об’ємом носія (розчин Кребса), використовували як негативний контроль. Крім того, кільця, інкубовані з відомим інгібітором кальцієвих каналів L-типу ніфедипіном (150 нМ), використовували як позитивний контроль. Досліджені цільові білки та ліганди, використані в механістичних експериментах, підсумовані в таблиці 1.

2.5. Аналіз даних

Для аналізу даних використовувався GraphPad Prism 7.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Для експериментів in vivo відмінності між окремими болюсними дозами 3-HPAA та контролем (фізіологічний розчин) порівнювали за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з подальшим тестом Dunnett post hoc. Для інфузій використовувався двосторонній дисперсійний аналіз з наступним тестом Dunnett post hoc. Для механічних експериментів ex vivo результати порівнювали за допомогою непарного t-тесту. Для експериментів із затокою K8644 використовувався двосторонній дисперсійний аналіз із подальшим тестом Даннетта для кількох порівнянь. Дані представлені як середнє ± SEM.

3. Результати

3.1. Вплив 3-HPAA на артеріальний тиск і частоту серцевих скорочень In Vivo у SHR

3.1.1. Одноразове введення болюсу

Значне зниження середнього, систолічного та діастолічного артеріального тиску спостерігалося після болюсного введення {{0}}HPAA у дозах від 0.01 до 10 мг.кг-' (Малюнки 3 і S1). Зниження систолічного артеріального тиску було очевидним при дозі 0,1 мг. кг-1 (Малюнок 3а), тоді як діастолічний артеріальний тиск значно знизився навіть від у 10 разів нижчої дози (0,01 мг. кг-1) (Малюнок 3б). У тому ж експерименті не було виявлено жодного впливу на частоту серцевих скорочень 3-Дози HPAA (Малюнок S2).

3.1.2. Інфузійне введення

5-хвилинні інфузії 3-HPAA призвели до зниження середнього, систолічного та діастолічного артеріального тиску (повні результати на малюнку S3). Ефект був дозозалежним, досягаючи максимально прибл. 50 відсотків. Значні зміни були викликані двома найвищими дозами, 1 і 5 мг·кг-1.хв-1 (рис. 4). Крім того, у цьому випадку не було виявлено значних змін у частоті серцевих скорочень (Рисунок S4).

3.2. Підтвердження судинорозширювальних властивостей 3-HPAA на коронарній артерії свиней

У експериментах ex vivo 3-HPAA викликала вазодилатацію коронарної артерії свині залежно від дози (рис. 5). За винятком першої дози, спостерігалося розширення судин. Однак результати були значущими лише для найвищої концентрації (1 мМ). Таку саму концентрацію використовували для подальшого механічного тестування ex vivo.

3.3. Механізм судинних ефектів 3-HPAA досліджено Ex vivo на коронарній артерії свиней

Щоб дослідити механізми, що лежать в основі 3-HPAA-індукованої вазодилатації, ми порівняли її вплив на коронарні артеріальні кільця свиней із неушкодженим і оголеним ендотелієм, попередньо скорочені KCl. Видалення ендотелію зменшило вазодилататорний ефект (рис. 6b). На основі цього висновку було перевірено участь ендотеліального NO. Попередня обробка інгібітором eNOS, L-NAME (100 мкМ), також призвела до значного зниження 3-HPAA-індукованої вазодилатації (рис. 6c). Навпаки, аналогічна попередня обробка коронарних кілець антагоністом мускаринових рецепторів атропіном (50 мкМ) або блокаторами каналів IKCa або SKCa, TRAM-34（10 мкМ） і UCL-1684（1 мкМ）, відповідно, або з інгібітором ЦОГ, індометацин (10 мкМ) не викликав жодних змін у вазодилатації, спричиненій 3-HPAA (рис. 6d-g). Нарешті, ми вирішили дослідити, чи може 3-HPAA діяти шляхом інгібування кальцієвих каналів Cay1.2 (L-типу) на гладком’язових клітинах судин. Попередня обробка кілець 3-HIPAA (1 мМ) не мала суттєвого впливу на скорочення, спричинене кумулятивними дозами Bay K8644（100 пМ-10 мкМ） (Малюнок 7), тоді як інкубація з відомим інгібітором кальцієвих каналів Cav1.2 (L-типу) ніфедипіном (150 нМ) значно зменшила скорочення (позитивний контроль).

Клацніть посилання для отримання додаткової інформації у частині 2
https://www.xjcistanche.com/news/part2-3-hydroxyphenylacetic-acid-a-blood-pre-54725696.html