Частина IV Дослідження моделі 5-Fu/5-Fu+L-OHP-індукованого пригнічення кісткового мозку у мишей
Oct 09, 2024
Наразі широко використовувані методи побудови тваринних моделей пригнічення кісткового мозку включають радіаційне моделювання [1,2], моделювання внутрішньоочеревинної ін’єкції циклофосфаміду [3-5], 5-фторурацил (5-фторурацил, { {5}}FU) моделювання внутрішньоочеревинної ін’єкції [6,7], опромінення в поєднанні зхіміотерапевтичний препаратмоделювання сполуки [8,9], моделювання протиепілептичного препарату карбамазепіну через зонд [10] тощо. Різні методи моделювання викликають різні механізми пригнічення кісткового мозку, а вплив на різні клітини крові та його ступінь є різними; різні хіміотерапевтичні препарати, завдяки різним механізмам дії, також виявляють певні відмінності у впливі на кровотворення кісткового мозку. Таким чином, ідеальна тваринна модель пригнічення кісткового мозку має велике значення для вивчення впливу хіміотерапевтичних препаратів на кровотворення в кістковому мозку.
У клінічній практиці,ад'ювантна хіміотерапія колоректального ракув основному приймає схему 5-FU та 5-Fu в поєднанні з оксаліплатином (оксаліплатин, L-OHP). Були проведені відповідні дослідження щодо використання лише 5-Fu для побудови тваринної моделі пригнічення кісткового мозку. Проте сфера використання 5-Fu відносно широка. Літературні звіти включають 110 мг/кг, внутрішньоочеревинну ін’єкцію (ip) на d1 і d5 для моделювання [7, 150 мг/кг, ip, d1 для моделювання 16, 11], 200 мг/кг, ip, d1 для моделювання [{{ 15}}] та 250 мг/кг, ip, d1 для моделювання [16]. Однак не було повідомлень про використання 5-Fu в поєднанні з L-OHP для побудови тваринної моделі пригнічення кісткового мозку. Yu Linghong та ін. [17] використовували 5-Fu в поєднанні з L-OHP для створення тваринної моделі ураження печінки. Посилаючись на метод введення та дозування в літературі, команда провела попереднє дослідження дозування 5-Fu в поєднанні з L-OHP, щоб створити тваринну модель кісткипригнічення кісткового мозку, а також порівняли метод моделювання 5-Fu 200 мг/кг, внутрішньовенно, d1 і метод моделювання 5-Fu 187,5 мг/кг + L-OHP 9 мг/кг, внутрішньовенно, d1. Результати показали, що дозування цих двох моделей було занадто великим. Таким чином, метою цього дослідження є продовження вивчення оптимальної дози 5-Fu-індукованого пригнічення кісткового мозку тваринної моделі та дозування 5-Fu у поєднанні з моделюванням L-OHP, щоб забезпечити найідеальніша тваринна модель длянаступний крок вивчення ефективностіімеханізм рецепту Qitu Erzhi.
ТРАВА ЦИСТАНША ДЛЯ ЗДОРОВ'Я НИРОК
Служба підтримки Wecistanche
Електронна адреса:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Тел.:+86 15292862950
Матеріали та методи
1 Експериментальні матеріали
1.1 Піддослідні тварини
100 вільних від специфічних патогенів (SPF) самців мишей BALB/c вагою 20 г ± 2 г були придбані у SBEF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. і поміщені в клітки в Центрі експериментальних тварин лікарні Сіюань Китайської академії китайської медицини. наук (кваліфікаційний сертифікат: SYXK (Пекін) № 2015-0011). Усіх мишей адаптовано годували протягом 1 тижня та мали вільний доступ до води та їжі протягом періоду годування. Умови годування: температура в приміщенні 20-26 градусів, відносна вологість 40%~60%, світло/темрява 12 годин/12 годин. Цей експеримент суворо відповідає відповідним нормам Комітету з етики поводження з експериментальними тваринами лікарні Сіюань Китайської академії медичних наук Китаю та стандартам етики тварин.
1.2 Основні експериментальні препарати та реактиви
5-Fu (фторурацил для ін’єкцій) Оксаліплатин для ін’єкцій
0.01M фосфатний буфер (PBS буфер) Розчинник для аналізу клітин крові (MEK-640)
Очисний розчин для аналізу клітин крові (MEK-680) Гемолітик для аналізу клітин крові (MEK-680) Очисний розчин для аналізатора клітин крові
Фарбування гематоксиліном Харріса 0.5% фарбування еозином
Нейтральний засіб для запечатування ясен
Розчин для декальцинації зразків тканин типу мінеральної кислоти
1.3 Основні прилади та обладнання
Автоматичний лічильник клітин крові (MEK6318) Пробірка для капілярної крові (20 мкл)
Наконечник піпетки 1000 мкл
Дегідратор біологічних тканин Tissue-TEK VIP6 Машина для вкладання біологічних тканин Tissue-TEK TEC Слайсер тканин Leica RM2235
Leica HI1210 Збірник шматочків Leica HI1220 Машина для випікання шматочків
Leica ST5020 автоматичний фарбувальний пристрій Leica CV5030 автоматичний покривний мікроскоп Olympus Bx53
Контроль якості патології Path QC та система управління даними
Інше: піпетка, ваги звичайні електронні, ножиці хірургічні, пінцет, спирт 75%, марля медична, ватні кульки стерильні, шприци та ін.
1.4 Приготування хіміопрепаратів
(1) Схема з одним препаратом 5-Fu
Розчиніть {{0}}Fu (0.25 г/10 мл) у 40 мл 0,9% розчину NaCl, щоб приготувати розчин із концентрацією 5 мг/мл для використання в режимі очікування.
(2) 5-Fu в поєднанні зі схемою L-OHP
Розчиніть {{0}}Fu (0.25 г/10 мл) у 40 мл 0,9% розчину NaCl для приготування розчину з концентрацією 5 мг/мл для режиму очікування використовувати. Розчиніть 1 пробірку L-OHP (50 мг) у 5 мл 5% розчину глюкози та продовжуйте розводити 5% розчином глюкози до розчину 0,5 мг/мл для використання.
Таблиця 4-1 Моделювання схеми лікування
Згідно з наведеним вище режимом дозування, усіх мишей зважували та вводили індивідуальну дозу відповідно до маси тіла. У групі подвійного лікування інтервал часу між 5-Fu та введенням L-OHP становив більше 5 годин [17].
(2) Показники оцінки моделі пригнічення кісткового мозку
Показники оцінки моделі пригнічення кісткового мозку включають зниження кількості клітин периферичної крові [18-22] або кількість клітин периферичної крові в поєднанні з ядерними клітинами кісткового мозку [9.23-25]. У цьому дослідженні використовувався другий метод для оцінки ефекту моделювання.
2.2 Індикатори та матеріали спостереження
2.2.1 Загальний стан мишей
Під час експерименту щодня спостерігали за дієтою, дефекацією, активністю, станом, психічним станом і станом волосся кожної групи мишей. Якщо миші гинули, їх вчасно фіксували.
2.2.2 Зміни маси мишей у кожній групі
Зважте та запишіть вагу кожної миші перед дозуванням у день моделювання (d0), а також зважте та запишіть вагу кожної миші через день після моделювання.
2.2.3 Зміни кількості клітин периферичної крові
Зафіксуйте мишу фіксатором, оголіть хвіст і замочіть його в гарячій воді 45-50 градусів. Висушивши хвіст, відріжте 1-2 мм кінчика хвоста. Швидко й ніжно погладьте хвіст від основи до кінчика 2-3 разів. Використовуйте пробірку для збору капілярної крові, щоб зібрати 20 мкл крові, розвести її в підготовленому розчиннику клітин крові та виконати аналіз клітин крові на апараті. Щодня здавати кров у встановлений час; весь збір крові виконує одна людина. До показників виявлення відносяться: лейкоцити, еритроцити, гемоглобін і тромбоцити.
2.2.4 Зміни кількості ядерних клітин кісткового мозку
За один день до взяття зразка за допомогою мікропіпетки візьміть 1000 мкл розчину PBS і розведіть його в пробірку EP об’ємом 2 мл і зберігайте в холодильнику при 4 градусах для подальшого використання. На d6 випадковим чином відібрали 8 мишей із кожної групи та вбили вивихом шийки матки. Під стерильним чистим столом хірургічними ножицями зрізали шерсть біля стегнової кістки, видалили праву стегнову кістку та обернули її медичною марлею, щоб видалити залишки м’яких тканин. Використовуйте голку шприца об’ємом 1 мл (голка № 4), щоб отримати розчин PBS у пробірці EP, просвердліть один кінець стегнової кістки, щоб промити кістковий мозок у пробірку EP; кілька разів промийте та аспіруйте, щоб вимити клітини кісткового мозку, поки стегнова кістка не побіліє. Підготовлену суспензію клітин кісткового мозку пропускали через 200-сітчасту нейлонову сітку. Використовуйте автоматичний лічильник клітин крові для виявлення ядерних клітин кісткового мозку. На d13 решту мишей убили таким же чином і відібрали зразки.
2.2.5 Фарбування HE при патології кісткового мозку
На d6, після того, як мишей у кожній групі вбили через вивих шийки матки, хірургічними ножицями зрізали шерсть біля стегнової кістки під стерильною чистою лавою, видалили ліву стегнову кістку, зробили воскові блоки, зрізи та фарбування HE.
(1) Етапи підготовки воскового блоку та розділення
① Відбір зразків: зафіксуйте тканину 4% параформальдегідом більше ніж на 24 години, замочіть у розчині для декальцинації на 24-48 годин, проколіть серветку шпилькою, розріжте та обріжте тканину після того, як вона розм’якне, і помістіть її у восковий блок ящик;
② Зневоднення: тканину послідовно поміщають у 70% спирт (2 години), 80% спирт (1,5 години), 95% спирт I (1,5 години), 95% спирт II (1,5 години). годин), 100% спирту I (0,5 години) і 100% спирту II (0,5 години), і зневоднюють градієнтним способом.
③ Прозорість: тканину послідовно поміщають у безводний етанол і розчин ксилолу (об’ємне співвідношення 1:1), ксилол I і ксилол II на 40 хвилин кожен.
④ Занурення воском: серветку послідовно поміщають у суміш ксилолу та парафіну (1:1), парафіну I та парафіну II на 20 хвилин кожна. Занурення воску здійснюється в апараті постійної температури при 58 градусах, щоб підтримувати розплавлення парафіну.
⑤ Вбудовування: після маркування тканинного блоку попередньо розігрійте пінцет, введіть розплавлений парафін у форму, а потім помістіть тканинний блок і зачекайте, доки парафін застигне.
⑥ Нарізка: після вбудовування помістіть восковий блок тканини на слайсер, відрегулюйте кут нарізки та наріжте блок тканини на шматочки товщиною 4-5 мкм.
⑦ Приклеювання: розкладіть парафінові скибочки у воді з температурою 42 градуси, візьміть скибочки один за одним гіркою та приклейте їх до гірки.
⑧ Випікання: помістіть приклеєну гірку в камеру постійної температури приблизно при 70 градусах і випікайте 1,5 години.
(2) Етапи фарбування HE:
① Депарафінізація шляхом замочування в ксилолі I і II протягом 15 хв.
② Замочіть у 100% спирті I та II на 5 хв.
③ Замочіть у 95%, 85% та 75% градієнтному спирті на 3 хвилини та промийте дистильованою водою.
④ Фарбування гематоксиліном протягом 1-3 хв і промивання дистильованою водою.
⑤ Диференціювання спирту соляної кислоти протягом 2-3 с, промивання дистильованою водою.
⑥ Занурте в аміачну воду, щоб вона стала синьою на 1 хв, промийте дистильованою водою.
⑦ Фарбування еозином протягом 5 хв.
⑧ Занурте в градієнтний спирт 75%, 85%, 95% на 2 хв.
⑨ Занурте в 100% спирт I, IⅡ на 3 хвилини кожен.
⑩ Занурте в ксилол I, Ⅱ на 5 хвилин кожен.
⑪ Заклейте нейтральною гумкою.
2.3 Статистичні методи
Для статистичного аналізу даних використовувався SPSS26.0. Дані вимірювань виражали як середнє ± стандартне відхилення (x±s). Спочатку дані перевіряли на нормальність та однорідність дисперсії: для нормально розподілених даних для порівняння між кількома групами використовували односторонній дисперсійний аналіз: коли дисперсія була рівною, для попарного порівняння використовували LSD-тест; якщо дисперсія не була рівною, для попарного порівняння використовувався критерій Tamhane t2; якщо він не відповідав нормальному розподілу, використовувався непараметричний тест. П<0.05 was considered statistically significant.
