ЧАСТИНА 1 Екстракт Cistanche Tubulosa (Schenk) Wight покращує продуктивність задніх кінцівок і послаблює експресію важкого ланцюга міозину IId/IIx у мишей, іммобілізованих на гіпсокартон.

Для отримання додаткової інформації звертайтеся до:Joanna.jia@wecistanche.com

1 Відділ нейромедичної науки, Інститут природної медицини, Університет Тояма, 2630 Сугітані, Тояма 930-0194, Японія 2 Відділ японської східної медицини, Вища школа медицини та фармацевтики, Університет Тояма, 2630 Сугітані, Тояма {{5 }}, Японія

Кореспонденцію слід адресувати Чіхіро Тода; chihiro@inm.u-toyama.ac.jp

Одержано 14 червня 2019 р.; Переглянуто 13 вересня 2019 р.; Прийнято 17 вересня 2019 р.; Опубліковано 22 жовтня 2019 р

Академічний редактор: Вень-і Кан

Авторське право © 2019 Yoshiyuki Kimbara та ін. Це стаття відкритого доступу, яка розповсюджується згідно з ліцензією Creative Commons Attribution License, яка дозволяє необмежене використання, розповсюдження та відтворення на будь-якому носії за умови належного цитування оригінальної роботи.

Атрофія скелетних м’язів зустрічається в багатьох клінічних станах, але фармакологічне лікування ще не встановлено.Цистанка трубчаста(Schenk) Wight — рослинний лікарський засіб, який використовується в традиційній японській і китайській медицині. У поточному дослідженні ми досліджували впливЕкстракт C. tubulosa(CTE) на атрофованих м'язах in vivo. Ми також досліджували іммобілізацію задніх кінцівок у мишей і розробили новий тип гіпсової пов’язки для задніх кінцівок, що складається з губчастої стрічки та тонкої пластикової трубки. Використовуючи цей метод, 3 із 4 груп мишей (n 11 для кожної групи) іммобілізували задні кінцівки та вводили CTE або носій протягом 13 днів. Фіктивну процедуру проводили на мишах четвертої групи, яким вводили носій. Далі вирізали триголовий м'яз (TS). Щоб проаналізувати вплив нової гіпсової системи та введення CTE на атрофію м’язів, ми оцінили вологу вагу TS і площу поперечного перерізу міоволокна (CSA). Ми також визначили рівні експресії MyHC IId/IIx за допомогою вестерн-блоттингу, оскільки їх збільшення є ознакою атрофії м’язів, що не використовується, що свідчить про зміну типу міоволокна від повільного до швидкого. Крім того, ми провели два тести на продуктивність задніх кінцівок. Новий метод гіпсової іммобілізації значно зменшив вологу вагу TS і CSA міоволокна. Це супроводжувалося погіршенням функції задніх кінцівок і збільшенням експресії MyHC IId/IIx. Введення CTE не змінювало сиру вагу TS або CSA міоволокна; однак, він продемонстрував тенденцію до полегшення втрати функції задніх кінцівок і пригнічення підвищеної експресії MyHC IId/IIx у мишей, іммобілізованих гіпсовою пов’язкою. Наш новий метод гіпсової іммобілізації задніх кінцівок ефективно викликав атрофію м’язів. CTE не впливав на м’язову масу, але пригнічував перехід від повільного до швидкого типу м’язових волокон у іммобілізованих гіпсових пов’язок мишей, покращуючи погіршення функції задніх кінцівок.

Cistanche deserticola має багато ефектів, натисніть тут, щоб дізнатися більше

1. Введення

Патофізіологічні стани, пов’язані з атрофією скелетних м’язів, включають саркопенію [1], кахексію [2] та індуковану глюкокортикоїдами атрофію скелетних м’язів [3]. Атрофія скелетних м’язів також спричинена тривалим бездіяльністю [4], що може бути пов’язано з постільним режимом [5], застосуванням гіпсової пов’язки для лікування переломів або пошкоджень зв’язок [6] або космічним польотом [7]. Оскільки різні захворювання можуть викликати цей стан, воно вражає великий відсоток населення.

Для лікування атрофії м’язів необхідні адекватні фізичні вправи та дієтотерапія [8]. Крім того, деякі дослідження показали ефективність фармакологічних контрзаходів, включаючи селективні модулятори рецепторів андрогенів, людські моноклональні антитіла проти міостатину та селективні агоністи рецепторів греліну [9]; однак ці підходи ще не встановлені.

Описані вище атрофічні стани м’язів супроводжуються зрушенням профілю типу міоволокон і зменшенням м’язової маси. Невикористання м’язів, спричинене втратою нейронного впливу та механічним розвантаженням, викликає повільну зміну типу міоволокна до швидкого та зміну профілю ізоформи важкого ланцюга міозину (MyHC) [10], про що свідчить збільшення рівнів експресії MyHC IId/IIx. [11, 12]. Натомість зміна типу міоволокон із швидкого на повільний індукується введенням глюкокортикоїдів, кахексією, сепсисом та іншими факторами [10].

Цистанхеце рослинний лікарський засіб, що походить зCistanche deserticolaYC Ma,C. tubulosa(Schenk) Wight, або C. salsa (CA Mey) Beck, згідно з Японською фармакопеєю [13]. У традиційній японській (Кампо) і китайській медицині його використовують для лікування «синдрому ниркової недостатності», який характеризується безпліддям, системною м’язовою слабкістю (особливо в спині та нижніх кінцівках) і слабкістю кісток [14, 15]. Відомо, що він містить різні компоненти, включаючи актеозид, ехінакозид та ізоактеозид [16]. Екстракт цієї трави або її хімічні складові показали кардіо-, гепато- та нейропротекторну дію; антивіковий, противтомний, судинорозширювальний та афродизіачний ефекти; антиоксидантна та протизапальна активність; здатність покращувати пам’ять і навчання [15, 16]. Тим не менш, ефективність цієї трави для запобігання або лікування захворювань, пов’язаних із виснаженням м’язів, не була підтверджена. Тому в цьому дослідженні ми досліджували впливC. tubulosaекстракт (CTE) як засіб для лікування атрофії м’язів.

З цією метою ми використовували іммобілізацію задньої кінцівки, щоб викликати атрофію м’язів у мишей, зосереджуючись, зокрема, на матеріалах, які використовуються в гіпсі. Повідомлялося про різноманітні системи зліпків, у тому числі гіпсові зліпки [17], зліпки зі скловолокна [18], поліпропіленові мікроцентрифужні пробірки [19], пристрої, подібні до костюмів із бавовни та сталевої сітки [20], пластикові піпетки з проксимальними губчаста прокладка [21], зліпки з нееластичної бинтової стрічки та сталевого дроту з вініловим покриттям [22], введення дроту в поєднанні з металевими пластинами [23] та використання хірургічного шкірного степлера [24]. Ідеальна пов’язка має бути мінімально інвазивною та нетравматичною, щоб уникнути запальних змін, оскільки запалення може викликати атрофію м’язів [25]. Крім того, на останніх етапах експерименту має бути можливим тестування задніх кінцівок за допомогою гіпсової пов’язки. Крім того, з гіпсом має бути легко поводитися без спеціальних знань чи навичок; він повинен бути легким, недорогим, його легко придбати і не вимагати спеціальних пристроїв для нанесення та видалення.

Повідомлялося про різні тваринні моделі виснаження м’язів. Розвантаження задньої кінцівки часто використовується [11, 12], але має кілька проблем, включаючи некроз хвоста, який може викликати системне запалення [25]; відхилення біологічних рідин у каудальний бік, що призводить до аномалій у кровоносних судинах задніх кінцівок [26]; надзвичайна мікрогравітація на задній кінцівці, яка може сильно вплинути на експресію білків, у тому числі мітохондріальних ферментів [27]. Усі ці фактори можуть впливати на перебіг втрати м’язів. Інший метод індукує м’язову атрофію, позбавляючи м’яз нейронних входів (наприклад, через перерізання сідничного нерва) [28]; оскільки м’язи піддаються впливу трофічних факторів термінальних нейронів [29], цей метод, який призводить до незвичайного майже повного денервованого стану, може змінити процес атрофії м’язів. Тварини, які піддаються системним порушенням, що викликають атрофію м’язів, наприклад цукровий діабет [30], ниркова недостатність [31], застосування кортикостероїдів [32], старіння або прискорене старіння [33, 34], можуть бути використані як моделі людського хвороби; однак ці системні захворювання також можуть перешкоджати процесу атрофії м'язів.

Таким чином, ми вибрали іммобілізацію задньої кінцівки, щоб викликати атрофію м’язів, і ми прагнули створити новий метод для її виконання на мишах, за допомогою якого ми досліджували вплив CTE на атрофію м’язів.

ЦистанхеДієтична добавканиркаЗахворюванняіПідвищуєСила

2. Матеріали та методи

2.1. Рослинний матеріал і екстракція.

CTE було придбано у Alps Pharmaceutical Industry Co., Ltd. (Хіда, Гіфу, Японія).

М’ясисті стебла C. tubulosa були зібрані з району Шінджан-Уйгур Аптоном, Китайська Народна Республіка. Загалом 193 кг змішаних порошків C. tubulosa було занурено в 1883 л 30% етанолу. Суміш кип'ятили зі зворотним холодильником протягом 2 годин при 55-64 градусах. Вихід екстракту становив 7,2% і містив 3,36% актеозиду та 12,72% ехінакозиду.

2.2. миші.

Дорослих самців мишей ddY (віком 12 тижнів) (Japan SLC, Shizuoka, Japan) поміщали окремо в пластикові клітки та підтримували 12--годинний цикл світло/темрява у віварії з регульованою температурою (25 ± 2 градуси). Усім тваринам було дозволено довільний доступ до води та їжі (запас Labo MR; Nosan Corporation, Йокогама, Канагава, Японія).

Усі експерименти на тваринах і протоколи проводилися відповідно до Рекомендацій щодо догляду та використання лабораторних тварин кампусу Сугітані Університету Тояма. Номер схвалення для експериментів на тваринах – A2016INM-3. Були зроблені всі зусилля, щоб звести до мінімуму кількість тварин.

2.3. Індукція атрофії м'язів задніх кінцівок і введення CTE.

Мишей розділили на 4 групи (n 11 на групу): на 2 день усіх мишей під наркозом видалили волосся від стегна до щиколотки за допомогою крему для депіляції (Epilat cream; Kracie, Токіо, Японія). Далі 3 з 4 груп гіпсової пов’язки (плюс) були іммобілізовані за такою процедурою, як показано на малюнках 1(a)–1(g):

Крок 1. Виріжте ущільнювальну стрічку з гумової піни EPDM (Cemedine Corporation, Токіо, Японія) на смужку 12 8 25 мм (Малюнок 1(a)).

Крок 2. Утримуйте задню кінцівку в підошовному положенні щиколотки та дуже обережно оберніть її в гомілковостопному суглобі герметизуючою стрічкою (Малюнок 1(b)).

Крок 3. Виріжте ізоляційний ковпачок з м’якого ПВХ TIC-22 (Nichifu Corporation, Осака, Японія) і накрийте манжету ущільнювальної стрічки. Використовуйте двосторонній скотч (PRO SELF handy cut двосторонній скотч J-1300; Nitoms Inc., Токіо, Японія), щоб вони приклеїлися (Малюнок 1(c)).

Крок 4. Зібрати обрізані кінці шапки; розріжте водонепроникну високоефективну клейку стрічку (стрічку живлення; корпорація Asahipen, Осака, Японія) на прибл. 4 48 мм і зафіксуйте зібрані кінці (Малюнок 1(d)).

Крок 5. Покладіть невеликий шматок (приблизно 5 30 мм) стрічки з алюмінієвої фольги (AL-30; Nichiban Corporation, Токіо, Японія) на передню сторону верхнього кінця кришки (Малюнок 1). (e)).

Крок 6. Розріжте пластикову стрічку (вінілову електроізоляційну стрічку № 21; Nitto Denko Corporation, Осака, Японія) на прибл. 19 × 40 мм і загорніть кришку (Малюнок 1(f)).

Крок 7. Виконайте ту саму процедуру на контралатеральній задній кінцівці (Малюнок 1(g)).

Період іммобілізації, який використовувався в цьому дослідженні, становив 13 днів, і гіпсову пов’язку замінювали, якщо виникало одне або більше з наступних станів: сильний набряк стопи, некроз задніх кінцівок, серйозні виразки на шкірі, ослаблення гіпсової пов’язки внаслідок руйнування або вивих гіпсової пов’язки з гіпсової пов’язки. щиколотка. Іншій групі проводили лише депіляцію (удавана процедура), а носій (фізіологічний розчин) вводили протягом 13 днів з наступного дня після депіляції (день 2). Серед 3 груп (плюс) двом застосовували КТР (50 і 100 мг/кг/день; група (плюс)/КТР-50 група та група (плюс)/КТР-100), і одному вводили носій (гіпс (плюс)/група носія), також з дня 2. CTE розчиняли у фізіологічному розчині та вводили щодня за допомогою перорального зонду протягом 13 днів.

2.4. Оцінка функції задніх кінцівок і сили м'язів задніх кінцівок.

На 14-й день мишей групи з пов’язаною пов’язкою (плюс) знову піддавали анестезії після введення CTE, і пов’язки зняли. Наступного дня (15-й день) усіх мишей перевіряли на функцію задніх кінцівок і м’язову силу за допомогою наступних двох тестів:

2.4.1. Вимірювання швидкості ходи.

Квадратну дерев’яну платформу шириною 15 мм тримали горизонтально приблизно на відстані 50 см від землі. Потім мишу помістили на платформу, і оцінювали швидкість ходи, коли тварина проходила платформу, вручну записуючи за допомогою секундоміра час, необхідний для проходження відстані 50 см. Попередньо кожну мишу звикли до платформи, пройшовши її двічі під час тренування.

2.4.2. Тест на помилку стопи.

Щоб оцінити силу м’язів задніх кінцівок, ми провели «тест на помилку стопи», під час якого кожну мишу знову помістили на платформу, а кількість зісковзувань задніх кінцівок з платформи занесли в таблицю. Цей тест є модифікованою версією статичного тесту зі стержнями, в якому повітряні стрижні фіксують за допомогою G-затискача, а мишей змушують перетинати їх [35]. Тестування на дефекти стопи проводили тричі, і середню кількість кроків за три сеанси було зареєстровано. Між сеансами був інтервал відпочинку не менше 15 хвилин.

2.5. Гістологічний і морфометричний аналізи триголового м'яза.

Після оцінки функції задніх кінцівок мишей піддавали глибокій анестезії та евтаназії перфузією фізіологічного розчину. Потім з обох боків задніх кінцівок вирізали м’язи триголового м’яза (TS); зразки з лівої задньої кінцівки фіксували в 4-відсотковому розчині параформальдегіду в розчині PBS протягом 24 годин, потім переносили в 30-відсотковий розчин сахарози в PBS та інкубували для кріопротекції та кріозрізу. Після цього за допомогою кріостата (Leica 3050S; Leica Systems, Nußloch, Німеччина) вздовж малої осі вирізали зрізи товщиною 12- мкм із середньої частини живота кожного м’яза. Від семи до десяти послідовних зрізів встановлювали на предметні скла з покриттям проти смужок (MAS-GP Type A, Matsunami Glass Industry, Осака, Японія), негайно сушили за допомогою фена, зберігали при 30 градусах і фарбували гематоксилін-еозином (фарбування HE). , ScyTek Laboratories, Логан, Юта, США). Було відібрано один репрезентативний зріз на кожну тварину, на якому було чітко видно зріз кожного міоволокна по короткій осі, і площа його поперечного зрізу (CSA) була виміряна за допомогою зображення J (Національний інститут здоров’я, Бетесда, Меріленд, США) .

2.6. Вестерн-блоттинг.

Загальний білок з правого TS екстрагували наступним способом. Правий TS подрібнили за допомогою ножиць і негайно заморозили в рідкому азоті, зберігали при 30 градусах, а потім гомогенізували для отримання тканинного лізату. Розморожені м’язи інкубували на льоду протягом 30 хвилин у 2 мл розчину білкового екстракту ссавців M-PER (Pierce Biotechnology, Рокфорд, Іллінойс, США), а потім гомогенізували. Потім гомогенати центрифугували при 4 градусах і 4000 g протягом 10 хвилин, і супернатанти збирали.

10 мкг загального білка в кожен м’язовий лізат завантажували та розділяли за допомогою електрофорезу в додецилсульфаті натрію в поліакриламідному гелі (SDS-PAGE) з подальшим електроперенесенням на нітроцелюлозну мембрану (0.2 мкм, # 1620112, Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Каліфорнія, США). Неспецифічне зв’язування було заблоковано 5-відсотковим знежиреним сухим молоком (сухе знежирене молоко, 190-12865, FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Осака, Японія) у трис-буферному фізіологічному розчині з 0,05-відсотковим Твіном 20 (TBS-T). Потім мембрани інкубували протягом ночі при 4 градусах з первинним антитілом, розчиненим у розчині підсилювача імунореакції Can Get Signal 1 (Toyobo, Осака, Японія). Після перемішування та промивання TBS-T мембрани інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з вторинним антитілом, кон’югованим з пероксидазою хрону (HRP-), розведеним у розчині підсилювача імунореакції Can Get Signal 2 (Toyobo, Осака, Японія). Сигнали на мембранах реєстрували за допомогою електрохемілюмінесценції з використанням люмінолу. Потім проводили денситометричний аналіз за допомогою програмного забезпечення CS Analyzer (Atto, Токіо, Японія). Антитіла вибирали та розводили таким чином: моноклональне антитіло миші до MyHC IId/IIx (1 : 1000, клон A4.1025, #05-716, Merck Millipore, Берлінгтон, Массачусетс, США), мишаче анти-GAPDH моноклональне антитіло для контролю завантаження (1: 3500, G041 ABM, Ванкувер, Канада) і кон’юговане з HRP козяче антимишаче IgG поліклональне вторинне антитіло H&L (1: 2000, Abcam, Кембридж, Великобританія).

2.7. Статистичний аналіз.

Усі результати виражені як середнє ± стандартна помилка середнього (SEM). Статистичну значущість порівнянь між групами перевіряли за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу та астрономічних тестів Даннета або тесту HSD Тьюкі; тест Краскела–Уолліса та пост-тест Данна; або двосторонній дисперсійний аналіз із повторними вимірюваннями та ретельний тест Даннетта. Критерій Смирнова–Грабба використовувався для виключення викидів. Для всіх статистичних оцінок значення p менше ніж 0.05 вважалися статистично значущими, і всі аналізи проводилися за допомогою GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, California, United States).

ЦистанхеДієтичні добавки проти старіння та зміцнення

3. Результати

3.1. Здоров'я тварин і вплив КТР на масу тіла.

Візуально всі задні кінцівки мишей, іммобілізованих гіпсовою пов’язкою, були атрофічними порівняно з мишами групи гіпсова пов’язка ( )/носій. Гіпсова іммобілізація призвела до значної втрати маси тіла до кінця фази дослідження. На відміну від цього, зміни маси тіла не були значущими в групі мишей, які отримували гіпс ( )/носій. Дві групи гіпсової пов’язки (плюс)/CTE не показали суттєвих змін у масі тіла порівняно з групою гіпсової пов’язки (плюс)/носій (рис. 2).

Важкі ускладнення на задніх кінцівках іммобілізованих мишей, такі як некроз шкіри або гангрена, не спостерігалися, а також ненормальна поведінка у віварії. Однак легкі ускладнення, включаючи набряк стопи, поверхневі виразки шкіри та почервоніння задніх кінцівок, спостерігалися у всіх іммобілізованих мишей (рис. 1(h)). Також у більшості випадків спостерігалося ослаблення та зсув гіпсової пов’язки, що призвело до заміни гіпсової пов’язки.

3.2. Вплив CTE на м’язову силу та продуктивність м’язів.

У групі гіпсова пов’язка (плюс)/транспортний засіб продемонстрували значно більшу кількість ковзань задніх кінцівок у тесті на помилку стопи (Малюнок 3(a)), а швидкість ходи була значно нижчою, ніж у групі гіпсова пов’язка ( )/транспортний засіб (Малюнок 3(b) )).

Лікування CTE призвело до дозозалежної тенденції до зменшення ковзання задніх кінцівок. У групі гіпсової пов’язки (плюс)/CTE-100 лікування мало тенденцію до зменшення (p 0.0604) ковзання задніх кінцівок порівняно з групою гіпсової пов’язки (плюс)/транспортного засобу (Малюнок 3(a)). Що стосується швидкості ходи, обидві групи гіпс (плюс)/CTE-50 і гіпс (плюс)/CTE-100 не показали суттєвих відмінностей у швидкості ходи порівняно з групою гіпс (плюс)/транспортний засіб, хоча були була невелика, незначна залежна від дози тенденція до збільшення швидкості (рис. 3(b)).

3.3. Мокра вага TS і Myofiber CSA.

Мокра вага TS значно зменшилася з іммобілізацією гіпсової пов’язки порівняно з групою гіпсової пов’язки ( )/носій (Малюнок 4(a)). Введення CTE не вплинуло на сиру вагу TS.

Також аналізували середнє значення CSA міоволокна в кожній групі. У групі гіпсова пов’язка (плюс)/носій було виявлено значне зменшення CSA міоволокна порівняно з групою гіпсова пов’язка ( )/носій (рис. 4(b)). Myofiber CSA було додатково класифіковано та проаналізовано за частотним розподілом, як показано на малюнку 4(c). Найпоширеніший клас CSA у групі гіпс ( )/транспортний засіб був більшим, ніж у групі гіпс ( плюс )/транспортний засіб; відсоток міоволокон у класі CSA 1350- 2250 мкм2 був або мав тенденцію бути значно вищим у групі гіпс ( )/носій, ніж у групі гіпс (плюс)/носій, і протилежна тенденція була очевидною в групи CSA класу 0 900 мкм2 (рис. 4(c)). На розподіл CSA не вплинуло введення CTE у двох групах гіпсової пов’язки (плюс)/CTE, порівняно з групою гіпсової пов’язки (плюс)/носій (рис. 4(c)). Типові зображення міоволокна показані на малюнку 4(d).

3.4. Вплив CTE на рівні експресії MyHC IId/IIx у TS.

Вестерн-блот був проведений у шести репрезентативних зразках з кожної групи (рис. 5(a)). Ці зразки були відібрані на основі їх походження від тварин, які показали продуктивність тесту на помилку стопи, найближчу до середніх значень для відповідних груп.

У групі гіпсова пов’язка (плюс)/носій MyHC IId/IIx було значно збільшено порівняно з групою гіпсова пов’язка ( )/носій. Це збільшення залежно від дози пригнічувалося введенням CTE. У групі гіпс (плюс)/CTE-100 експресія MyHC IId/IIx мала тенденцію до зниження порівняно з групою гіпс (плюс)/носій (p 0.0810) (Малюнок 5(b)) . Експресія GAPDH, яку використовували як внутрішній контроль, не мала суттєвих відмінностей між групами (рис. 5(c)).

Цистанхеtubulosa має багато ефектів