Малюнок 4. Конкурентоспроможність олігосахаридів і НА у зв'язуванні з CD44. (A) Зменшенняефект олігосахаридівна антигенність CD44. Рекомбінантний CD44 щурів (20 нг/мл) змішували з або без FC, FOS або GOS протягом 1{{10}} хв, а потім аналізували за допомогою набору CD44 ELISA. Результати виражені як середнє значення ± SD (n=4). *, p < 0,05 порівняно з контрольною групою. (B) перешкоджає інгібіторним ефектам олігосахаридів на експресію CD44 і фосфорильованого JNK. Клітини NRK-52E попередньо обробляли 0,1 мг/мл ГК протягом 30 хвилин, потім вводили 0,1 мг/мл FC, FOS або GOS протягом 30 хвилин і, нарешті, піддавали гіпоксичному культивуванню. Експресію білка аналізували Вестерн-блоттингом. Відносне збільшення білкових смуг також представлено у вигляді гістограми. Результати виражені як середнє значення ± SD (n=4).

ЩОБ ПРАЦЮВАЛА НОВА ТРАВА ДЛЯ ЦИСТАНШИ?

3.5. Олігосахариди покращують функцію нирок і зменшують запалення у мишей з ранньою стадією ГПН

Мишача модель AKI з IRI була створена для оцінки впливу олігосахаридів нафункції нирокізапалення.Функція нирокконтролювавсявиявлення креатиніну в сироватці крові. Мишей годували солігосахаридилише на початковій стадії ГПН, тобто від 1 дня до до 2 днів після операції ІРІ. Після цього періоду сироватковий креатинін значно підвищився у мишей ГПН, але не у мишей ГПН, які отримували лікування олігосахаридами, що вказує на те, що олігосахариди покращили функцію нирок (Малюнок 5A). Потім відстежували рівні цитокінів у сироватці крові, щоб оцінити запалення у мишей ГПН. Сироваткові MCP-1, IL-1 і TNF- були значно збільшені у мишей AKI (рис. 5B–D), але були знижені всіма трьома олігосахаридами. Аналіз IHC маркера нейтрофілів Ly6G показав інфільтрацію нейтрофілів у нирках мишей ГПН, але не у нормальних мишей і мишей ГПН, які отримували лікування олігосахаридами (Рисунок 6A). Аналіз IHC маркера макрофагів F4/80 виявив інвазію макрофагів у нирках мишей ГПН, але не у нормальних мишей і мишей ГПН, які отримували олігосахариди (Рис. 6B). Порівняно з нормальними мишами та мишами AKI, яких годували олігосахаридами, ниркові канальці мишей AKI продемонстрували високу експресію TNF (рис. 6C). Ці результати вказують на те, що FC, FOS і GOS зменшують запалення нирок у мишей з ранньою стадією ГПН.

Рисунок 5. Зменшення впливу олігосахаридів на сироватковий креатинін і цитокіни у мишей AKI на ранній стадії. Кров відбирали у кожної миші через 2 дні після операції IRI для вимірювання сироваткового креатиніну (A), MCP-1 (B), IL-1 (C) і TNF- (D). Результати виражені як середнє значення ± SD (n=8).

3.6. Олігосахариди сприяють відновленню нирок після АГН

На сьомий день після операції IRI сироватковий креатинін мишей AKI знизився, але все ще був вищим, ніж у нормальних мишей (Рис. 7A). Не спостерігалося істотної різниці в сироватковому креатиніні між мишами ГПН, які отримували олігосахариди та без них. Однак рівень NGAL у сироватці крові, маркер ГПН, був все ще вищим у мишей ГПН, ніж у нормальних мишей і мишей, які отримували олігосахарид ГПН (Фігура 7B). Це відкриття вказує на те, що годування олігосахаридами на ранній стадії ГПН може зменшити пошкодження нирок після ГПН. Фарбування PAS кори кори нирок миші проводили через 7 днів після операції IRI. У мишей AKI спостерігалося серйозне ушкодження канальців із дилатацією канальців і внутрішньопросвітних клітинних дебрисів через некроз канальців, а у мишей AKI, які отримували лікування олігосахаридами, спостерігалося лише незначне ушкодження канальців (Рис. 7C). Таким чином, споживання FC, FOS або GOS на ранній стадії ГПН сприяє відновленню ниркових тканин і функції нирок у мишей ГПН.

Рисунок 6. Інгібуюча дія олігосахаридів на запалення нирок у мишей з ранньою стадією ГПН. Нирки від кожної миші через 2 дні після операції IRI збирали для фарбування IHC. (A) Фарбування Ly6G IHC. Біла стрілка вказує на нейтрофіли позитивного фарбування Ly6G. (B) Фарбування F4/80 IHC. Біла стрілка вказує на F4/80 позитивне фарбування макрофагів. (C) Фарбування TNF-IHC

4. Обговорення

Ішемія є однією з основних причин ГПН. Тут була створена модель гіпоксичної клітини та модель AKI миші з IRI для вивчення впливу олігосахаридів на AKI та їх молекулярний механізм. Індукована гіпоксією експресія MCP-1, IL-1 і TNF- у клітинах NRK-52E, які пригнічувалися інгібітором JNK SP600125. Трансфекція siRNA CD44 блокувала індуковану гіпоксією активацію JNK. Ці результати вказують на те, що гіпоксія підвищує регуляцію CD44, яка, у свою чергу, активує JNK і таким чином регулює цитокіни в клітинах ниркових канальців. FC, FOS і GOS знижували антигенність CD44 і конкурували з лігандом HA CD44 клітин ниркових канальців. Цей висновок означає, що три олігосахариди можуть безпосередньо взаємодіяти з CD44, щоб пригнічувати спричинену гіпоксією регуляцію CD44, активацію JNK і експресію цитокінів у клітинах ниркових канальців. Хоча р38 є іншою важливою MAP-кіназою для TNF та IL-1 під час запальних реакцій [21], фосфорильований р38 не регулюється в гіпоксичних NRK-52E клітинах. Таким чином, р38 не бере участі в експресії цитокінів у клітинах ниркових канальців і в інгібуючому ефекті олігосахаридів на запальні реакції клітин ниркових канальців. FC і GOS посилили фосфорилювання p38 у гіпоксичних клітинах, що вказує на їхній потенційний вплив на p38-запальні реакції. У дослідженнях на тваринах FC, FOS і GOS пригнічували підвищення рівня MCP-1 та IL-1 у сироватці крові у мишей із ранньою стадією ГПН і знижували експресію TNF у тканинах нирок. Цитокіни є ключовими ефекторами залучення лейкоцитів. FC, FOS і GOS зменшували інфільтрацію нейтрофілів та інвазію макрофагів у нирках мишей із ранньою стадією ГПН. Через 7 днів після операції зменшення запалення та інфільтрації нейтрофілів при ГПН на ранній стадії є корисним для відновлення на пізній стадії. Це дослідження вперше показує, що споживання ФК, ФОС або ГОС на ранній стадії ГПН може сприяти одужанню шляхом пригнічення запалення нирок.

На сьогоднішній день вплив олігосахаридних добавок на ГПН не досліджено. Багато олігосахаридів вважаються пребіотиками і можуть сприяти зростанню сприятливої ​​мікробіоти [13,22]. Олігосахариди жіночого молока регулюють розвиток і функціонування імунної системи шляхом створення специфічної мікробіоти [23,24]. Кишкова мікробіота є важливим модифікатором результату ГПН [20]. Теоретично олігосахариди можуть впливати на тяжкість ГПН шляхом регуляції кишкової мікробіоти. Однак побудова мікробіоти за допомогою олігосахаридів і модерування імунітету за допомогою мікробіоти потребуватимуть більше кількох тижнів. У поточному дослідженні на тваринах мишей годували олігосахаридами від 1 дня до до 2 днів після операції IRI. Результати показали позитивний вплив олігошарад на ГПН на другий день після операції ІРІ. Отже, нирковий захист олігосахаридів у поточній системі не викликаний впливом мікробіоти. Багато олігосахаридів, включаючи FC, FOS і GOS, можуть засвоюватися організмом, потрапляти в системний кровотік і, нарешті, виводитися нирками [14–16,22,25]. Ці оліго шаради мають шанс взаємодіяти з CD44 на клітинах ниркових канальців in vivo. Впливаючи на CD44, олігосахариди можуть миттєво модулювати імунну відповідь нирок при гострому пошкодженні, тим самим покращуючи її відновлення. Крім того, олігосахариди жіночого молока безпосередньо модулюють імунні відповіді локально або системно [22,25]. Тому вплив олігосахаридів на імунну та інші фізіологічні системи пояснюється їх прямим впливом і зміною мікробіоти.

CD44 сприяє клітинній адгезії та діє як сигнальний рецептор у багатьох важливих фізіологічних явищах [26]. Взаємодія CD44 та його головного ліганду HA, основного компонента позаклітинного матриксу, може посилити клітинну адгезію, проліферацію, міграцію та імунні відповіді [27–29]. HA, зв’язуючись із CD44, ініціює внутрішньоклітинні сигнальні події шляхом модуляції сигнальних молекул CD44, що знаходяться нижче, включаючи актиновий цитоскелет [30]; білки езрин, радиксин і моезин [31]; анкірин [32]; і нерецепторна тирозинкіназа Src [33]. Ці вихідні сигнальні молекули пов’язані з активацією JNK. Реорганізація актинового цитоскелету активує численні сигнальні каскади, зокрема JNK [34,35]. Езрін зв’язується з компонентами сигналу JNK, щоб полегшити активацію JNK у В-клітинах [36]. Анкірин і Src також індукують активацію JNK [37–39]. Таким чином, передача сигналу CD44 пов'язана з активацією JNK. Було доведено, що зв’язування НА з CD44 сприяє активації JNK у клітинах раку молочної залози [19]. У цьому дослідженні було виявлено, що олігошаради перешкоджають взаємодії між HA та CD44, щоб інгібувати передачу сигналу JNK вниз за потоком і, як наслідок, імунну відповідь клітин ниркових канальців. Виходячи з цих висновків, олігосахариди демонструють потенціал для пригнічення інших фізіологічних реакцій, пов’язаних із CD44, особливо проліферації та міграції ракових клітин, які сприяють CD44.

Олігосахариди, доступні на ринку, в основному включають FOS, GOS, FC та ізомальтоолігосахариди [40,41]. ФОС, ГОС і ФК можуть частково засвоюватися організмом, потрапляти в системний кровотік і надходити з овочами, молоком і морськими водоростями [14–16,22,25]. У цій роботі було досліджено вплив цих трьох аніонних олігосахаридів на AKI. Хоча ці три олігосахариди мають різні моносахаридні композиції, їх вплив на клітини ниркових канальців під дією гіпоксії дуже подібний, включаючи інгібуючу дію на CD44, фосфорильований JNK і цитокіни. Крім того, додана ГК перешкоджала інгібуючому ефекту всіх трьох олігосахаридів. Таким чином, механізм дії цих трьох олігосахаридів на клітини ниркових канальців однаковий незалежно від типу їх моносахаридів. Цей механізм може бути пов’язаний зі структурною подібністю між олігосахаридами та ГК. Однак типи моносахаридів у трьох олігосахаридах все ще викликають дещо різні ефекти в поточній системі. FC і FOS знижували експресію JNK в гіпоксичних клітинах ниркових канальців, але GOS демонстрував обмежений ефект. Вплив ФОС на антигенність CD44 був слабшим, ніж ФК і ГОС. Найефективніша доза ФОС (0.5 мг/мл) для інгібування спричиненого гіпоксією CD44 також була вищою, ніж доза ФК та ​​ГОС (0,05 мг/мл). Ці результати свідчать про те, що інгібуючі ефекти FC і GOS на трансдукцію сигналу CD44 є більшими, ніж ефекти FOS. Проте експерименти на тваринах показали схожі захисні ефекти для нирок від прийому трьох олігосахаридів на початковій стадії ГПН. Порівняння ниркових захисних ефектів між трьома олігосахаридами у мишей AKI є складним і передбачає всмоктування олігосахаридів у кишечнику. Більшість олігосахаридів перетравлюється кишковими бактеріями, і лише невелика частина може засвоюватися [42,43]. Ефективність травлення в кишечнику різна для різних олігосахаридів, що, в свою чергу, впливає на кількість їх всмоктування. Крім того, довжина олігосахаридів також впливає на ефективність їх всмоктування в кишечнику. У цьому дослідженні FC з найменшим середнім ступенем полімеризації теоретично буде легше поглинатися, ніж FOS з найбільшим середнім ступенем полімеризації. Проте експерименти на тваринах показали, що після того, як олігосахариди (10 мг/кг/день) перетравлюються кишковими бактеріями, достатня кількість все ще може потрапити в кровообіг, щоб досягти захисного ефекту нирок у мишей з ГК.

Таким чином, FC, FOS і GOS безпосередньо взаємодіють з CD44, щоб інгібувати індуковану гіпоксією активацію CD44, активацію JNK і експресію цитокінів у клітинах ниркових канальців. Прийом FC, FOS і GOS на ранніх стадіях ГПН сприяє одужанню шляхом пригнічення запалення нирок. ГПН раптово виникає у пацієнтів, госпіталізованих до лікарень та відділень інтенсивної терапії, і не було розроблено лікування, щоб уникнути або полегшити цей стан. Виходячи з цих висновків, щоденне вживання олігосахаридів може зменшити тяжкість ГПН і сприяти відновленню нирок у пацієнтів з ГПН.

Список літератури

1. Макріс К.; Spanou, L. Гостра ниркова травма: визначення, патофізіологія та клінічні фенотипи. Clin. Біохім. 2016, 37, 85–98. [PubMed]

2. Сільвер, С.А.; Харель, З.; МакАртур, Е.; Наш, Д.М.; Аседільо, Р.; Кітчлу, А.; Гарг, АХ; Чертов, Г.М.; Белл, СМ; Wald, R. Причини смерті після госпіталізації з AKI. J. Am. Соц. Нефрол. 2018, 29, 1001–1010. [CrossRef] [PubMed]

3. Йоаннідіс, М.; Драмл, В.; Форні Л.Г.; Groeneveld, ABJ; Оноре, П.М.; Хосте, Е.; Остерманн, М.; Oudemans-van Straaten, HM; Шетц, М. Профілактика гострого ураження нирок і захист функції нирок у відділенні інтенсивної терапії: Оновлення 2017 р.: Експертна думка робочої групи з профілактики, секція AKI, Європейське товариство медицини інтенсивної терапії. інтенсивної терапії Мед. 2017, 43, 730–749. [CrossRef] [PubMed]

4. Біюкліч, К.; Дженнінгс, П.; Кунчев, Я.; Хаслачер, Дж.; Айдін, С.; Штурн, Д.; Пфаллер, В.; Patsch, JR; Джоаннідіс, М. Міграція лейкоцитів через двошаровий ендотелій-епітелій як модель ниркового інтерстиціального запалення. Am. J. Physiol. фізіол. 2007, 293, C486–C492. [CrossRef]

5. Біхорац, А.; Baslanti, TO; Куенка, А.Г.; Хобсон, К.; Ang, D.; Ефрон, Пенсільванія; Майєр, Р.В.; Мур, Ф.А.; Молдавер, Л. Л. Гостре ураження нирок пов'язане з ранніми змінами цитокінів після травми. J. Trauma Acute Care Surg. 2013, 74, 1005–1013. [CrossRef]

6. Сінгбартл, К.; Formeck, C.; Kellum, JA. Перехресні перешкоди нирки та імунної системи при AKI. Сьомін. Нефрол. 2019, 39, 96–106. [CrossRef]

7. Муруган Р.; Вень, X.; Кінер, К.; Щука, Ф.; Палевський П.М.; Унру, М.; Фінкель, К.; Віджаян, А.; Старший, М.; Чен, Ю.-Ф.; та ін. Зв’язки між інтенсивністю ЗПТ, медіаторами запалення та результатами. Clin. J. Am. Соц. Нефрол. 2015, 10, 926–933. [CrossRef]