МікроРНК у розвитку та захворюваннях нирок Ⅱ

Розвиток нирок

Theнирка ссавців(або метанефрос) є життєво важливим органом, який відіграє вирішальну роль увиведення відходів метаболізму,регуляція об'єму позаклітинної рідини, іобслуговування електролітуікислотно-лужний гомеостаз. Крім того, нирки виробляють важливі гормони, такі якеритропоетин, кальцитріол,ренін, іпростагландини(48). Функціональна здатність нирки корелює з кількістю функціонуючих нефронів, які утворюються під час розвитку нирки до народження, що також називається надбанням нефронів. Кожна нирка людини містить у середньому 1,000,000 нефронів, хоча ця кількість значно варіюється, за оцінками, коливається від 200,000 до 2,000,{{8 }} нефрони (49, 50). сстаріння,втрата функціонального резерву нефроніввідбувається з часом (51, 52); отже, низька забезпеченість нефронами при народженні пов’язана з підвищеним ризиком розвитку гіпертензії та хронічної хвороби нирок (ХНН) у подальшому житті (53–55). Крім того, CAKUT, що призводить до зниження нефронів і функції нефронів, є основною причиною ниркової недостатності у дітей, що призводить до значної захворюваності та смертності, пов’язаної з трансплантацією та діалізом (56, 57). Таким чином, краще розуміння клітинних і молекулярних механізмів, що лежать в основі встановлення кількості нефронів і нормального формування нефронів, дає змогу зрозуміти нові шляхи прогнозування, запобігання та лікування захворювань нирок у дітей.

СКІЛЬКИ ЧАСУ ПОТРІБНО, ЩОБ CISTANCHE ДІЯВ У ПАЦІЄНТІВ З ЗАХВОРЮВАННЯМИ НИРОК?

Розвиток метанефральної ниркипочинається приблизно на 10,5 ембріональний день (E10.5) у мишей і приблизно на п’ятому тижні вагітності у людей (58). У відповідь на індуктивні сигнали від метанефрічної мезенхіми зачаток сечоводу відходить від каудального кінця Вольфової протоки та проникає в сусідню мезенхіму (рис. 2). Одночасно морфогени, що виходять із зачатка сечоводу, індукують конденсацію метанефрічної мезенхіми з утворенням мезенхіми ковпачка (також називаються попередниками нефрону) навколо кінчиків зачатка сечоводу. У міру прогресування нефрогенезу зачаток сечоводу зазнає послідовних раундів розгалуження, подовження та диференціювання, щоб утворити збірні протоки нирки. Субпопуляція попередників нефронів зазнає мезенхімально-епітеліального переходу з утворенням ниркових пухирців, які після поляризації та подовження стають комами та S-подібними структурами тіла. Нарешті, дистальна частина S-подібного тіла зливається із збиральною протокою, утворюючи функціональний нефрон (59–61). S-подібне тіло піддається подальшій диференціації з утворенням зрілих типів клітин нефрону, крім збірної протоки. Стромальні клітини-попередники Foxd1+ розташовані поруч із попередниками нефронів у зовнішній кортикальній або нефрогенній зоні нирки, що розвивається (рис. 2) (62). Вважається, що сигнали від кортикальної строми пригнічують експансію клітин-попередників нефронів і стимулюють їх диференціювання, оскільки абляція ниркової строми призводить до порушення диференціювання клітин-попередників нефронів (63). Клітини-попередники Foxd1+ дають початок усім стромальним клітинам у метанефрічній нирці, включаючи інтерстиціальні клітини ниркової кори та медулярного шару, перицити, периваскулярні фібробласти, мезангіальні клітини та гладком’язові клітини судин (64, 65). Порушення на будь-якому етапі цього процесу можуть призвести до CAKUT, основної причини ХХН у дітей (66, 67).

Зрілий нефрон складається з клубочка, який діє як фільтраційна одиниця, і трубчастого заднього сорбційного відділу, який підрозділяється на проксимальний звивистий каналець, петлю Генле, дистальний звивистий каналець і збірну протоку (рис. 2). Фільтраційний бар’єр клубочка (який включає фенестрований ендотелій, базальну мембрану клубочка, ніжки відростків і щілинні діафрагми подоцитів) дозволяє фільтрувати плазму та дрібні розчинені речовини, при цьому вибірково утримуючи білки, такі як альбумін та імуноглобуліни в крові (68, 69). У той же час канальцевий відділ реабсорбції відповідає за підтримку водного гомеостазу, реабсорбцію розчинених речовин (включаючи натрій, калій, кальцій, фосфор, магній, глюкозу та багато інших) і виведення кислоти та інших відходів.

МіРНК у нирці, що розвивається

У дослідженнях на кондиційних трансгенних мишах мікроРНК виявилися критичними регуляторами морфогенезу нирок у багатьох лініях клітин. Початкові дослідження, що оцінювали функціональну роль мікроРНК у розвитку нирок, використовували умовну делецію Dicer (70) у різних ниркових лініях. Однак відомо, що Dicer виконує незалежні від мікроРНК ролі (71), що ускладнює інтерпретацію цих моделей. Умовна делеція Dicer у ранній метанефричній мезенхімі або попередниках нефронів призводить до посиленого апоптозу попередників нефронів, підвищених рівнів проапоптозного білка Bim і передчасного припинення нефрогенезу (72–75) (табл. 1). Цікаво, що втрата експресії Bim у прогениторах нефронів з дефіцитом Dicer зменшує апоптоз і частково відновлює утворення нефронів. Дві мікроРНК, що експресуються в попередниках нефронів, miR-17 і miR-106, були ідентифіковані як супресори експресії BIM (76). Разом ці результати вказують на те, що мікроРНК контролюють баланс між виживанням і апоптозом у попередниках нефронів, щоб забезпечити формування правильної кількості нефронів протягом нефрогенезу.

Рисунок 2. Схематичне зображення етапів розвитку метанефральної нирки. Сигнали від бруньки сечоводу викликають конденсацію метанефрічної мезенхіми з утворенням ковпачка з попередників нефронів (мезенхіми ковпачка) навколо кінчиків бруньки сечоводу. Мезенхіма ковпачка зазнає мезенхімально-епітеліального переходу з утворенням ниркових пухирців, які послідовно розвиваються в тільця у формі коми та S. Ці структури з’єднуються з ніжкою бруньки сечоводу, яка дає початок збірній протоці. Клітини в проксимальному домені S-подібного тіла диференціюються в спеціалізовані епітеліальні клітини зрілого ниркового тільця (тобто подоцити та клітини капсули Боумена), тоді як клітини в середній і дистальній частинах диференціюються в тубулярні сегменти нефрону (проксимальні канальці , петлі Генле та дистальні канальці). Створено за допомогою BioRender.com.

Умовна делеція Dicer у лінії бруньки сечоводу призводить до спектру аномалій, які сильно нагадують CAKUT, включаючи дисплазію нирок і розвиток кіст збиральних проток (73, 77, 78). Передчасне припинення морфогенезу розгалуження (у відповідь на зниження експресії Wnt11 і c-Ret із зачатка сечоводу) є, ймовірно, основним фактором, що сприяє нирковій дисплазії (73). Початок утворення кісти відбувається приблизно на E15.5 і пов’язаний з дефектами довжини первинних війок, підвищеною апоптотичною загибеллю клітин і надмірною проліферацією клітин (73). Оскільки Dicer виконує важливі незалежні від мікроРНК ролі в клітині, умовна делеція Dgcr8 була використана для підтвердження того, що фенотипи, які спостерігаються в моделях умовного нокауту Dicer, справді є результатом втрати мікроРНК. Тварини з делецією Dgcr8 у дистальному нефроні та похідних збиральної протоки розвивають гідронефроз і кісти збиральної протоки (79), CAKUT-подібний фенотип, який нагадує втрату активності Dicer у лінії бруньки сечоводу.

Дослідження двох незалежних груп показали, що абляція Dicer із лінії ниркової строми Foxd1+ та її похідних призводить до спектру ниркових аномалій, з послідовними висновками щодо гіпоплазії нирок, зменшення кількості клубочків, аномального дозрівання клубочків та дефектів судин малювання (80, 81). Хоча обидві групи описали в значній мірі узгоджені фенотипи, використовуючи подібні мишачі моделі, було відзначено дві чіткі відмінності. Накагава та ін. спостерігали відсутність внутрішньої мозкової речовини та сосочка, а також зменшення нефрогенної зони (80). Навпаки, Phua et al. показали розширення популяції попередників нефрону та збереження ниркового сосочка (81). Накагава та ін. припустив, що ці дефекти пов’язані з порушенням сигнального шляху Wnt, що призводить до змін у міграції та проліферації стромальних клітин через зниження регуляції мікроРНК стромальних клітин, miR-214, miR-199a{{7 }}p і miR-199a-3p (80). Дослідження Phua та ін. припустили, що зміни в програмах апоптозу (включаючи посилену експресію ефекторних генів Bim і p53) сприяють фенотиповим дефектам (81). Цілком можливо, що генетичні фонові відмінності та/або ефективність Cre-опосередкованої рекомбінації можуть бути відповідальними за відмінності, які описують ці дослідження. Тим не менш, описані фенотипи узгоджуються з відомими багатогранними ролями ниркової строми в розвитку нирок, і механізми, що лежать в основі цих фенотипів, ймовірно, є складними, враховуючи природу делеції Dicer. Необхідні подальші дослідження, що вивчають специфічні мікроРНК у різних субпопуляціях строми, щоб краще визначити діючі регуляторні механізми.

Нещодавні роботи стосуються питання функції специфічних мікроРНК як у нирках, що розвиваються, так і в попередниках нефронів. Використовуючи модель людських ембріональних стовбурових клітин, Bantounas et al. показали, що інгібування кластера miR-199a~214 призводить до дисморфічних клубочків, аберантних проксимальних канальців, зниження експресії WT1 та збільшення інтерстиціальних капілярів у ниркоподібних органоїдах (82). Цікаво, що глобальне видалення miR-210, що реагує на гіпоксію, призводить до дефіциту чоловічого нефрону (83). Наприклад, умовна делеція кластера miR-17~92 у попередниках нефронів та їх похідних у мишей порушує проліферацію клітин-попередників і зменшує кількість нефронів, що розвиваються. В результаті у мутантних мишей розвивається протеїнурія, фіброз нирок і порушення функції нирок (84). Порушення регуляції рівнів цільового гена miR-17~92, CFTR, пов’язано з дефектною проліферацією клітин-попередників і зниженою забезпеченістю нефронами в цій моделі миші (85).

Секвенування малих РНК (smRNA-Seq) все частіше використовується для профілювання моделей експресії мікроРНК і для відкриття нових видів мікроРНК. smRNA-Seq нефрогенних мезенхімальних клітин E15.5 ідентифікувала 162 анотовані мікроРНК, які диференційовано експресуються в цій популяції клітин порівняно з цілими нирками та 49 новими видами мікроРНК (86). Цікаво, що рівні мікроРНК сімейства miR-200 були значно знижені в попередниках нефронів. З огляду на те, що члени сімейства miR-200 є ключовими регуляторами мезенхімально-епітеліального переходу в збірній протоці (87), ми припускаємо, що їх експресія може жорстко регулюватися для забезпечення нормальної епітеліальної диференціації попередників нефронів під час розвитку нирок.

МіРНК функціонують у зрілому нефроні

На додаток до потреби під час розвитку нирок, мікроРНК регулюють численні біологічні процеси в основних клітинних лініях, які утворюють зрілий нефрон (69, 88–91). Відповідно до цього описано сегментоспецифічну експресію мікроРНК вздовж нефрону, включаючи miR-143 і miR-195a в клубочку, miR-107 і miR{{7} }a в проксимальному канальці, miR-193 і miR-378a в товстій висхідній кінцівці, miR-874 і miR-155 в дистальному звивистому канальці та miR{{ 12}}c в колекторі (87). Крім того, функціональні дослідження в компартментах зрілого нефрону підтверджують різні ролі мікроРНК.

У мишей, у яких відсутні Dicer або Drosha в подоцитах, спостерігаються виражена протеїнурія, гломерулосклероз і швидке прогресування до ниркової недостатності внаслідок порушення бар’єру клубочкової фільтрації (90–93). Аналіз in silico виявив, що різні активовані стенограми в мутантних клубочках містять цільові послідовності для членів родини miR-30. Як і всі чотири члени родини miR-30 (miR-30c-1, miR-30b, miR-30d і miR-30c{ {9}}) зазвичай високо експресуються в подоцитах, ці мікроРНК можуть бути відповідальними за аномалії подоцитів і порушення бар’єру клубочкової фільтрації у мутантних мишей (91).

Дещо дивно, але видалення Dicer з постнатальних проксимальних канальців ссавців не впливає на розвиток нирок, гістологію або функцію, але захищає від ниркової ішемії/реперфузійного пошкодження. Мутантні миші демонструють кращу функцію нирок, зменшене пошкодження нирок, нижчий тубулярний апоптоз і покращену виживаність порівняно з їхніми однопомітними WT (94). Ймовірно, це відображає «суму» ефекту делеції кількох мікроРНК у проксимальному канальці, оскільки інша робота з тих пір продемонструвала, що експресія специфічних мікроРНК є захисною при нирковій ішемії/реперфузійному пошкодженні (наприклад, miR-16 та miR-21; посилання 95, 96); тоді як інші є шкідливими (наприклад, miR-182; посилання 97).

Хоча мікроРНК, здається, не потрібні для функціонування проксимальних канальців, вони важливі для гомеостазу дистальних нефронів і збиральних проток (79, 88, 98). Збір специфічної для проток інактивації Dicer та інших критичних генів, пов’язаних з біогенезом мікроРНК (включаючи Dgcr8, Ago1, 2, 3 та 4), викликає ниркову недостатність у дорослих мишей через прогресуючий тубулоінтерстиціальний фіброз та інтерстиціальне запалення (88). Цьому передує частковий епітеліально-мезенхімальний перехід (EMT) клітин збиральних проток і зниження регуляції членів родини miR-200, які пригнічують EMT (88). Подібним чином абляція Dicer або Dgcr8 з дистального нефрону та похідних бруньки сечоводу, відповідно, призводить до ниркових аномалій і ниркової недостатності (78, 98), які в кінцевому підсумку пов’язані зі зниженою регуляцією членів родини miR-200 (98). Підвищена експресія цільового гена miR-200 Pkd1 у цих мутантних мишей порушує тубулогенез і створює кістоподібні структури (98). Ці відмінності у потребах у функціональних мікроРНК у проксимальних канальцях і дистальному нефроні/збірній протоці можна пояснити сегментарним розподілом мікроРНК уздовж довжини нефрону та збиральної протоки в WT нирках (88).

Видалення Dicer у ренінсекретуючих клітинах юкстагломерулярного апарату призводить до дефіциту юкстагломерулярних клітин, зниження рівня циркулюючого реніну з подальшим зниженням артеріального кров’яного тиску, зниженням функції нирок, смугастим малюнком інтерстиціального фіброзу та судинними аномаліями (89). Зменшення юкстагломерулярних клітин свідчить про потребу в зрілих мікроРНК для підтримки їхнього фенотипу. Пізніше miR-330 і miR-125b-5p були ідентифіковані як потенційні кандидати, які або пригнічують, або сприяють, відповідно, гладком’язовому фенотипу юкстагломерулярних клітин (99).

Інші активні напрямки дослідження мікроРНК при гострому ураженні нирок (8–10), полікістозі нирок (11) і трансплантації нирки (10) були всебічно розглянуті в інших останніх оглядах.

МіРНК при захворюваннях нирок у дітей У цьому розділі ми надаємо огляд ролі мікроРНК у розвитку захворювань нирок, включаючи пухлини CAKUT і Вільмса. CAKUT є однією з найпоширеніших форм вад розвитку при народженні, що вражає приблизно 3–7 із 1000 живонароджених (100). Порушення розвитку нирок і нижніх сечовивідних шляхів призводить до широкого спектру клінічних проявів, що спостерігаються при CAKUT, включаючи аномалії нирок (тобто агенезію нирок, гіпоплазію та дисплазію нирок, мультикістозну диспластичну нирку), аномалії лоханки сечоводу (тобто обструкцію лоханочного з’єднання сечоводу), дуплексна система збору та аномалії сечового міхура та уретри (101–103). Ця фенотипова неоднорідність, ймовірно, пов’язана зі складною взаємодією між генетичними, епігенетичними та/або пренатальними факторами навколишнього середовища, які впливають на розвиток нирок і нижніх сечових шляхів, що призводить до CAKUT (101). Більшість наших сучасних знань про патогенез CAKUT виникли на мишачих моделях і синдромних формах CAKUT. Ці дослідження привели до ідентифікації кількох генів CAKUT, багато з яких беруть участь у ранньому розвитку нирок, включаючи PAX2, SALL1, HNF1B, EYA1, GATA3, RET, WNT4, GDNF, SIX1, SIX2 та інші (101, 104, 105). Однак поодинокі мутації або варіанти кількості копій у генах, що кодують білок, не пояснюють більшість випадків CAKUT (~80%) (101, 106).

Як згадувалося вище, виснаження зрілих мікроРНК з різних ліній клітин нирки, що розвивається, у мишачих моделях призводить до ниркових аномалій, які імітують CAKUT людини (73, 74, 78, 79). Крім того, делеції зародкової лінії MIR17HG, який кодує кластер miR-17~92, викликають у людей синдром Фейнгольда 2 типу (107). Хоча нирковий фенотип у пацієнтів із синдромом Фейнгольда 2 типу з мутаціями MIR17HG залишається невизначеним, повідомляється про 18% частоту CAKUT у випадках синдрому Фейнгольда, пов’язаного з мутаціями MYCN (108, 109). Разом ці спостереження свідчать про те, що мутації мікроРНК, які експресуються під час розвитку нирок, можуть викликати CAKUT у людей, особливо тому, що багато мікроРНК є висококонсервативними між мишами та людьми.

Щоб перевірити цю гіпотезу, в одному дослідженні було досліджено 1248 пацієнтів із несиндромною CAKUT із 980 сімей і шукали мутації в 96 ділянках стовбурової петлі 73 генів мікроРНК розвитку нирок (106). У цій когорті було ідентифіковано 31 особу з 17 різними однонуклеотидними варіантами, що впливають на 16 різних генів мікроРНК. Серед них два нових варіанти мікроРНК були визнані потенційно патогенними. MIR19B1 (член кластера miR-17~92) асоціювався з наявністю агенезії правої нирки, а MIR99A асоціювався з важким міхурово-сечовідним рефлюксом і птозом нирки. Така несподівано низька кількість патогенних варіантів-кандидатів частково пояснюється обмеженнями цього дослідження, оскільки аналіз враховував лише мутації в генах мікроРНК, які були включені в підхід до генів-кандидатів, і не виявив варіацій кількості копій і великих перебудов ДНК (106). .

В альтернативному підході сегменти сечоводу пацієнтів із різноманітними CAKUT були проаналізовані на диференціальну експресію транскриптів за допомогою мікрочіпів, на наявність біоінформаційно передбачених мікроРНК-мішеней і зрілих мікроРНК за допомогою кПЛР (110). Використовуючи цей багатосторонній підхід, було ідентифіковано сім мікроРНК, які потенційно відіграють роль у CAKUT, і серед них has-miR-144 було значно збільшено у пацієнтів із CAKUT. Онтологічний аналіз генів показав, що прогнозовані цільові гени has-miR-144 сприяють біологічним процесам, залученим до розвитку CAKUT, включаючи розвиток трубок (22 цільових гени), розвиток сечостатевої системи (18 цільових генів), розвиток нирок (14 цільових генів) , розвиток ембріональних органів (18 цільових генів) (110).

Необхідні подальші дослідження для визначення молекулярних механізмів, що лежать в основі патогенної ролі мікроРНК у CAKUT. Результати таких досліджень будуть мати вирішальне значення для покращення догляду за пацієнтами з CAKUT та запобігання їх прогресуванню до ХХН, надання належного генетичного консультування пацієнтам та їхнім родинам і розробки нових терапевтичних стратегій.