ISG15-залежна активація датчика MDA5 антагонізується SARS-CoV-2 папаїноподібною протеазою, щоб уникнути вродженого імунітету господаря

Активація RIG-I-подібних рецепторів, гена I, індукованого ретиноєвою кислотою (RIG-I), і білка 5, пов’язаного з диференціацією меланоми (MDA5), створює противірусний стан шляхом посилення регуляції генів, стимульованих інтерфероном (IFN) (ISG). Серед них ISG15, роль якого у вродженому імунітеті все ще залишається загадковою. У цьому дослідженні ми повідомляємо, що кон’югація ISG15 є важливою для противірусних відповідей IFN, опосередкованих датчиком вірусної РНК MDA5. ISGilation доменів активації та рекрутингу каспази MDA5 сприяє його олігомеризації та, таким чином, запускає активацію вродженого імунітету проти ряду вірусів, включаючи коронавіруси, флавівіруси та пікорнавіруси. Залежна від ISG15-активація MDA5 антагонізується шляхом прямого де-ISG-гілювання за допомогою папаїноподібної протеази SARS-CoV-2, нещодавно виниклого коронавірусу, який спричинив пандемію COVID-19 . Наша робота демонструє вирішальну роль ISG15 у противірусній відповіді, опосередкованій MDA5-, а також визначає ключовий механізм ухилення імунітету від SARS-CoV-2, який може бути спрямований на розробку нових противірусних засобів і вакцин для боротися з COVID-19.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Натисніть тут, щоб переглянути продукти Cistanche Enhance Imunity

【Запитуйте більше】 Електронна пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Вірусне порушення імунного гомеостазу господаря контролюється вродженою імунною системою, яка спирається на рецептори, які сприймають молекулярні структури, пов’язані з небезпекою або патогеном (PAMP)1–3. RIG-I-подібні рецептори (RLR) RIG-I та MDA5 є ключовими для виявлення вірусу шляхом дослідження цитоплазми на вірусні або отримані від хазяїна імуностимулюючі РНК4. Зв’язування РНК із С-кінцевим доменом (CTD) і геліказою RIG-I та MDA5 призводить до їх конформації, що дає сигнали, що дозволяє рекрутувати кілька ферментів5. Ці ферменти модифікують RLR у багатьох доменах і сайтах, а посттрансляційні модифікації (PTM) особливо добре вивчені для доменів активації та рекрутування каспаз (CARD), сигнальних модулів. Протеїнфосфатаза 1 (PP1) / дефосфорилює RIG-I та MDA5 CARDs6. У випадку RIG-I дефосфорилювання сприяє пов’язаному з Lys63- поліубіквітуванням CARD за допомогою TRIM25 (тристоронній мотив, що містить 25) та інших лігаз E37,8, що стабілізує олігомерну форму RIG-I, таким чином уможливлюючи мітохондріальну противірусну дію -зв'язування з сигнальним білком (MAVS). Порівняно з RIG-I, окремі етапи активації MDA5 і важливі PTM, що беруть участь, менш зрозумілі. Активація RLR індукує вироблення IFN типів I та III, які, у свою чергу, поширюють противірусну сигналізацію шляхом активації ISGs9,10. Серед них ISG15, убіквітиноподібний білок, який може бути ковалентно кон’югований із залишками лізину цільових білків, процес PTM називається ISGylation11. Хоча загальновизнано, що кон’югація ISG15 діє противірусно12, механізми ISG-гіляції білка хазяїна, які могли б пояснити широку противірусну рестрикційну активність ISG15, наразі невідомі. Збудник триваючої пандемії COVID-19, важкий гострий респіраторний синдром, коронавірус 2 (SCoV2), належить до родини Coronaviridae, яка містить кілька інших патогенів людини. Коронавіруси мають виняткову здатність пригнічувати опосередковані IFN противірусні відповіді, і низька продукція IFN у SCoV2-інфікованих пацієнтів корелює з тяжким захворюванням13. Серед антагоністів коронавірусного IFN є папаїноподібна протеаза (PLpro), яка має деубіквітінуючу та де-ISG-гілюючу активність14,15. У цьому дослідженні ми визначаємо істотну роль ISGylation в активації MDA5. Крім того, ми показуємо, що SCoV2 PLpro взаємодіє з MDA5 і протидіє ISG15-залежній активації MDA5 за допомогою активного де-ISGylation, показуючи, що SCoV2 вже еволюціонував, щоб уникнути імунного нагляду MDA5.

Результати

MDA5, але не RIG-I, сигналізація вимагає ISG15.

Щоб ідентифікувати PTM MDA5 CARD, які можуть регулювати активацію MDA5, ми піддали афінно очищену MDA5–2CARD, злиту з глутатіон-S-трансферазою (GST–MDA5–2CARD), або окремо GST, рідинній хроматографії в поєднанні з тандемною мас-спектрометрією (LC –MS/MS), і виявили, що, зокрема, GST–MDA5–2CARD спільно очищений з ISG15, який виглядав як дві смуги, які мігрували повільніше (на ~15 і 30 кДа), ніж немодифікований GST–MDA5–2CARD (розширені дані рис. 1а). Імуноблоттинг (IB) підтвердив, що GST–MDA5–2CARD модифікується ISG15 (розширені дані, рис. 1b). Потім ми визначили релевантність ISG15 для передачі сигналів, викликаної MDA5-. У той час як експресія FLAG–MDA5 у мишачих ембріональних фібробластах (MEF) дикого типу (WT) індукувала інформаційну РНК і білок IFN, а також транскрипти Ccl5 залежно від дози, експресія FLAG–MDA5 у Isg15−/− MEF призвела до абляції експресія противірусного гена та білка (рис. 1а та розширені дані, рис. 1с). Подібним чином, індукція антивірусного гена значно знижена в нокаутних (KO) ISG15 клітинах HeLa (людини) порівняно з контрольними клітинами WT (рис. 1b і розширені дані, рис. 1d), що виключає видоспецифічний ефект. Навпаки, FLAG–RIG-I індукував порівнянну кількість секретованого білка IFN, а також транскриптів Ifnb1 і Ccl5 у Isg15−/− і WT MEFs (рис. 1a та розширені дані, рис. 1c). Транскрипти IFNB1 та CCL5, а також продукція білка IFN за допомогою FLAG–RIG-I була подібною або дещо посиленою в клітинах ISG15 KO HeLa порівняно з клітинами WT (рис. 1b та ​​розширені дані, рис. 1d), що узгоджується з попередніми повідомленнями про те, що ISGylation негативно впливає на сигналізацію RIG-I16,17

Рис. 1|ISGylation потрібне для сигналізації MDA5, але не RIG-I. a, b, ELISA IFN- із супернатантів MEF (WT або Isg15−/−) (a) і клітин HeLa (WT або ISG15 KO) (b), тимчасово трансфікованих зростаючою кількістю FLAG-міченого MDA5 або RIG-I для 40 год. Цільноклітинні лізати (WCL) були досліджені IB з анти-ISG15, анти-FLAG та анти-актином (контроль навантаження). c, ELISA IFN- із супернатантів WT або Isg15−/− MEF, які були імітовано стимульовані або трансфіковані РНК EMCV (0.1 або 0.4 мкг мл−1), HMW-poly (I: C) (0,5 мкг мл-1 ) або RABVLe (1 пмоль мл-1 ), або інфіковані SeV (10 одиниць гемаглютинації (HAU) мл-1 ) протягом 24 ч. d, аналіз RT–qPCR мРНК Ifnb1, Ccl5 та Tnf у WT та Isg15−/− MEFs, стимульованих як у c. e, фосфорилювання IRF3 у WCL NHLF, які були трансфіковані зазначеними siRNA протягом 30 годин, а потім імітовано стимульовані або трансфіковані РНК EMCV (0,4 мкг мл-1) або RABVLe (1 пмоль мл-1) протягом 6 годин, оцінювали за допомогою IB з анти-pSer396-IRF3 та анти-IRF3. f, ELISA IFN- із супернатантів NHLF, які були трансфіковані зазначеними siRNA протягом 30 годин, а потім імітовано стимульовані або трансфіковані РНК EMCV (0,4 мкг мл-1) або RABVLe (1 пмоль мл-1), або інфіковані SeV (10 HAU мл-1 ) протягом 16 год. g, ELISA IFN- із супернатантів PBMCs, які були трансдуковані протягом 40 годин зазначеними shRNA лентивірусними частинками, а потім інфіковані mutEMCV (MOI=10) або SeV (200 HAU мл-1) протягом 8 годин. h, аналіз RT–qPCR мРНК IFNA2 та IL-6 у PBMCs, які були трансдуковані та інфіковані, як у g. Дані представляють принаймні два незалежні експерименти з подібними результатами (середнє значення ± sd для n= 3 біологічних реплікатів у a–d і f та середнє для n= 2 біологічних реплікатів у g і h). *П< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test). ND, not detected; NS, not significant.

Далі ми перевірили вплив делеції гена ISG15 на активацію ендогенних MDA5 і RIG-I їх відповідними лігандами. Виробництво IFN, а також експресія генів IFNB1, CCL5 і TNF, індукована трансфекцією РНК вірусу енцефаломіокардиту (EMCV) або високомолекулярної (HMW)-poly(I:C), обидва з яких переважно сприймаються MDA5, були значно аттенуйовані в клітинах Isg15−/− MEF, ISG15 KO HeLa та ISG15 KO HAP-1 порівняно з їхніми відповідними контрольними клітинами (рис. 1c, d та розширені дані, рис. 1e–g). Важливо відзначити, що припинення індукції антивірусного гена за допомогою РНК EMCV або HMW-poly(I:C) у клітинах ISG15 KO не було спричинене припиненням експресії гена MDA5; навпаки, експресія мРНК MDA5 була посилена в клітинах ISG15 KO порівняно з клітинами WT (розширені дані, рис. 1f,g). На відміну від стимуляції агоністами MDA5, стимуляція клітин Isg15−/− MEF та ISG15 KO HeLa за допомогою трансфекції лідерної РНК вірусу сказу (RABVLe) або інфікування вірусом Сендай (SeV), які є стимулами RIG-I, призвела до виробництва IFN та експресія антивірусного гена порівнянна з клітинами WT (рис. 1c, d і розширені дані, рис. 1e). Щоб виключити потенційні клональні ефекти, які можуть бути пов’язані з клітинами з видаленим геном ISG15, ми провели експерименти з тимчасовим приглушенням генів у первинних нормальних легеневих фібробластах людини (NHLF). Сайленсування ISG15, подібне до нокдауну MDA5, призвело до майже повної втрати фосфорилювання IFN-регуляторного фактора 3 (IRF3) — характерної ознаки активації RLR-сигналу — після стимуляції РНК EMCV, але не після RABVLe ished продукції IFN, а також експресія антивірусного транскрипту в NHLF, трансфікованих РНК EMCV, але не в клітинах, стимульованих RABVLe або SeV (рис. 1f і розширені дані, рис. 1h). Опосередковане малою шпилькою (sh)РНК глушіння ISG15 або MDA5 у первинних мононуклеарних клітинах периферичної крові людини (PBMC) також суттєво знижувало експресію противірусного білка та транскрипту після інфікування рекомбінантним мутантним EMCV (mutEMCV) з дефіцитом антагонізму MDA518,19 порівняно з інфіковані РВМС, трансдуковані за допомогою ненаціленої контрольної shRNA (рис. 1g,h та розширені дані, рис. 1i). Навпаки, виснаження ISG15 або MDA5 не вплинуло на відповіді цитокінів у РВМС після інфікування SeV (рис. 1g,h та розширені дані, рис. 1i). Ці результати показують, що ISG15 необхідний для передачі імунних сигналів MDA5, але не RIG-I. Карти MDA5 CARD мають ISG-гіляцію на Lys23 і Lys43.

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

Щоб підтвердити наш MS-аналіз, який ідентифікував MDA5–2CARD ISGylation, ми спочатку перевірили, чи ендогенний MDA5 також модифікується ISG15. Ендогенний MDA5 був надійно ISGiled в клітинах, трансфікованих HMW-poly(I: C), або інфікованих вірусами денге (DENV) або Zika (ZIKV), які відчуваються MDA5 (посилання 5) (рис. 2a). Примітно, що ендогенний MDA5 також був ISGилирован в неінфікованих клітинах, хоча і на дуже низьких рівнях (Розширені дані, рис. 2a), що узгоджується з попередніми висновками про те, що багато білків хазяїна також ISGилировались на низьких рівнях у нормальних (неінфікованих) умовах20. У клітинах, оброблених анти-IFNAR2 для блокування опосередкованої сигналами IFNAR активації ISG, глушіння ISG15 або MDA5 призвело до порівнянного зниження експресії гена IFNB1 після інфікування mutEMCV (розширені дані, рис. 2b), що вказує на залежність від ISG15- Передача сигналу MDA5 відбувається навіть за відсутності сигналу IFNAR.

t MDA5Δ2CARD (містить геліказу та CTD) є основним місцем MDA5 ISGylation, що демонструє дві помітні смуги для ISGylated 2CARD (рис. 2b). Реконституція клітин ISG15 KO HeLa за допомогою WT ISG15 або некон’югованого мутанта ISG15, у якому два гліцини, необхідні для кон’югації, були замінені аланіном (ISG15-AA)21, продемонструвала ковалентну кон’югацію ISG15 (рис. 2c) . Мутація окремих залишків лізину в GST–MDA5–2CARD до аргініну виявила, що односайтова мутація Lys23 і Lys43 помітно знижує ISGylation (Розширені дані, рис. 2c), тоді як їх комбінована мутація (Lys23Arg/Lys43Arg) майже скасовує ISGylation (рис. 2d). ). Повнорозмірний FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg також показав помітно знижене ISGylation (рис. 2e та розширені дані, рис. 2d); залишкове ISGylation, яке спостерігається у FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg, ймовірно, пов’язане з додатковими незначними ділянками в 2CARD та/або Δ2CARD. Слід зазначити, що мутація Lys23Arg/Lys43Arg не вплинула на SUMOylation5 MDA5–2CARD (розширені дані, рис. 2e). Крім того, у той час як RIG-I–2CARD був надійно убіквітований (що представляє ковалентне Lys63-пов’язане убіквітування7), ані MDA5–2CARD WT, ані мутант Lys23Arg/Lys43Arg не показали виявлених рівнів убіквітування (розширені дані, рис. 2f). У сукупності ці результати вказують на те, що MDA5 CARD піддаються ISG-гіляції на двох основних сайтах, Lys23 і Lys43.

CARD ISGylation необхідна для активації MDA5.

Порівнюючи їхню здатність передавати сигнали, односайтові мутанти MDA5–2CARD Lys23Arg і Lys43Arg показали частково знижену активацію промотору IFN порівняно з WT MDA5–2CARD, тоді як мутант Lys23Arg/Lys43Arg мав значно знижену сигнальну активність, яка була майже такою ж сильною як у сигнальних дефектних мутантів Ser88Glu і Ser88Asp6 (Розширені дані, рис. 2g). Навпаки, мутант, у якому Lys68, який є залишком лізину, який знаходиться найближче до Lys43 і Lys23, був замінений на аргінін (Lys68Arg), продемонстрував порівнянну здатність до кон’югації ISG15 і сигнальної здатності до WT 2CARD (розширені дані, рис. 2c,g). MDA5–2CARD Lys23Arg/Lys43Arg, на відміну від WT MDA5–2CARD, також не зміг індукувати димеризацію IRF3 (розширені дані, рис. 2h). FLAG–MDA5 Lys23Arg, Lys43Arg або Lys23Arg/Lys43Arg також показали знижені або майже скасовані здатності активувати промотор IFN порівняно з FLAG–MDA5 WT (рис. 2f). MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg продемонстрував глибокий дефект передачі сигналів навіть при експресії у великих кількостях, тоді як WT MDA5 індукував антивірусні стенограми залежно від дози (рис. 2g). Відповідно, фосфорилювання STAT1, характерна ознака передачі сигналів IFNAR, а також експресія білка ISG були сильно індуковані MDA5 WT, але не Lys23Arg/Lys43Arg (рис. 2h). Комплементація MDA5-генно-редагованих астроцитів людини (SVGA) з MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg або Ser88Glu призвела до значного зменшення транскриптів IFNB1, CCL5 та ISG порівняно з клітинами, що експресують WT MDA5 (рис. 2i та розширені дані, рис. 2i) . Ці результати демонструють, що ISGylation у Lys23 та Lys43 є важливим для MDA5-опосередкованих цитокінових відповідей.

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

Дефосфорилювання за допомогою PP1 регулює ISG-гілювання MDA5.

Подібно до RIG-I, MDA5 фосфорилюється в CARD в неінфікованих клітинах, що запобігає автоактивації; дефосфорилювання RIG-I і MDA5 за допомогою PP1 / є вирішальним для вивільнення RLR зі станів придушення сигналів6,22–24. Дефосфорилювання RIG-I дозволяє Lys63-пов’язане убіквітування CARD, що сприяє мультимеризації RIG-I та передачі сигналів5. Деталі того, як дефосфорилювання CARD (на Ser88) викликає активацію MDA5, залишаються невідомими, і тому ми перевірили, чи регулює дефосфорилювання MDA5 ISGylation. Приглушення PP1 / сильно знижене MDA5–2CARD ISGylation (розширені дані, рис. 3a). Крім того, фосфоміметичні мутанти Ser88Glu та Ser88Asp мали знижене ISGylation, тоді як мутант Ser88Ala з нульовим фосфоном демонстрував сильніше ISGylation, ніж WT MDA5–2CARD (розширені дані, рис. 3b). І навпаки, MDA5 WT і Lys23Arg/Lys43Arg мали порівняне фосфорилювання Ser88 (розширені дані, рис. 3c). Разом ці дані свідчать про те, що дефосфорилювання MDA5 на Ser88 передує CARD ISG-гілюванню. Далі ми використали білок V вірусу кору (MeV-V), який протидіє дефосфорилюванню MDA5 Ser88 через PP1 / антагонізм25. Експресія MeV-V посилювала фосфорилювання Ser88 (що свідчить про абляційне дефосфорилювання) GST–MDA5–2CARD або FLAG–MDA5 залежно від дози, як було показано раніше25. Посилене фосфорилювання за MeV-V корелювало зі зниженням ISGylation (розширені дані, рис. 3d,e). На відміну від WT MeV-V, мутантний MeV-V, який скасував зв’язування PP1- і антагонізм дефосфорилювання MDA5- (MeV-VΔtail)25, продемонстрував незначний вплив на MDA5–2CARD ISGylation (Extended Data Рис. 3f), посилення інгібування ISG-гіляції в основному за рахунок інгібування PP1, а не інших антагоністичних ефектів MeV-V. V-білки з вірусів Nipah і Hendra (NiV-V і HeV-V) також посилюють фосфорилювання MDA5 Ser88 і, відповідно, послаблюють MDA5 ISGylation (Розширені дані, рис. 3g,h), що свідчить про те, що кілька параміксовірусних V-білків інгібують MDA5 ISGylation через маніпуляції фосфорилювання Ser88, хоча точні механізми для окремих білків V ще належить визначити. У сукупності ці дані свідчать про те, що MDA5 CARD ISGylation залежить від дефосфорилювання на Ser88.

ISGylation сприяє складанню MDA5 вищого порядку.

Активація RLR вимагає зв’язування РНК, олігомеризації RLR та їх транслокації з цитозолю в мітохондрії для взаємодії з MAVS5. Щоб з’ясувати механізм, за допомогою якого ISGylation впливає на активність MDA5, ми спочатку перевірили, чи впливає ISGylation на зв’язування РНК. Ендогенний MDA5, очищений з WT або Isg15-/- MEF, однаково добре взаємодіяв з HMW-poly(I: C) in vitro (розширені дані, рис. 4a). MDA5 WT і Lys23Arg/Lys43Arg показали порівнянне зв’язування з HMW-poly(I:C), що вказує на те, що ISGylation не впливає на здатність MDA5 зв’язуватися з РНК (розширені дані, рис. 4b). Коли ми спостерігали за транслокацією MDA5 з цитозолю в мітохондрії після стимуляції РНК EMCV, ми виявили, що глушіння ISG15, але не так. трансфекція C, скасувала транслокацію MDA5 (рис. 3a). Навпаки, транслокація RIG-I після трансфекції RABVLe була ефективною як для ISG15-деплетованих, так і для si. С-трансфіковані клітини (рис. 3b). Ці дані показали, що ISGylation регулює транслокацію MDA5 або крок до неї. Оскільки транслокація MDA5 із цитозолю в мітохондрії потребує взаємодії з 14-3-3η26, ми порівняли 14-3-3η зв’язування WT і мутантного MDA5. Здатність MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg зв’язувати 14-3-3η була подібною до WT MDA5 або мутанта Lys68Arg (розширені дані, рис. 4c). Однак, у той час як стимуляція РНК EMCV ефективно індукувала олігомеризацію MDA5 у MEF WT, утворення олігомерів MDA5 було видалено в MEF з дефіцитом ISG15- (рис. 3c). Нокдаун ISG15 у клітинах 293T також скасував олігомеризацію FLAG–MDA5–2CARD (рис. 3d). І навпаки, спільна експресія компонентів механізму ISGylation, Ube1L і UbcH8, сильно посилила олігомеризацію MDA5–2CARD у si. С-трансфіковані клітини, але не в клітинах, деплетованих ISG15- (рис. 3d), що вказує на те, що для утворення олігомеру MDA5 необхідне ISG-гілювання. На підтримку цієї концепції FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg продемонстрував майже скасовану олігомеризацію, тоді як WT MDA5 ефективно олігомеризувався (рис. 3e). Ми також порівняли ефект мутації Lys23 Arg/Lys43Arg з ефектом руйнівних олігомеризаційних мутацій, які локалізуються на поверхні розділу між мономерами MDA5 і перешкоджають опосередкованій зв’язуванням РНК філаментації MDA5 (Ile841Arg/Glu842Arg і Asp848Ala/Phe849Ala)27,28, або до CARD (Gly74Ala/Trp75Ala) і порушити олігомеризацію 2CARD27. На відміну від WT MDA5, мутант Lys23Arg/Lys43Arg, подібний до MDA5 Gly74Ala/Trp75Ala, продемонстрував недостатню олігомеризацію та, відповідно до цього, скасував здатність активувати промотор IFN (рис. 3f,g). Введення Lys23Arg/Lys43Arg у фон Ile841Arg/Glu842Arg або Asp848Ala/Phe849Ala, кожен із яких сам по собі знижував олігомеризацію та передачу сигналів MDA5, також скасовував утворення олігомеру MDA5 та індукцію IFN (рис. 3f,g). Оскільки LGP2 сприяє нуклеації MDA5 на дволанцюговій РНК і, отже, олігомеризації MDA529, 30, ми порівняли зв’язування LGP2 MDA5 WT і Lys23Arg/Lys43Arg. MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg взаємодіє з LGP2 так само ефективно, як WT MDA5 (Розширені дані, рис. 4d), посилюючи припущення про те, що CARD ISGylation сприяє олігомеризації MDA5 незалежно від філаментації, опосередкованої зв’язуванням РНК. У сукупності ці результати встановлюють, що ISGylation полегшує олігомеризацію CARD і збірки MDA5 вищого порядку.

Рис. 2|Для активації MDA5 потрібна ISG-гіляція на Lys23 і Lys43. ендогенне MDA5 ISGylation у NHLFs, які були імітовано оброблені, трансфіковані HMW-poly(I: C) (0.1 мкг мл-1 ) протягом 40 годин (зліва) або інфіковані DENV або ZIKV (MOI {{ 10}} для кожного) протягом 48 годин (праворуч), визначено IP з анти-MDA5 (або контролем ізотипу IgG) та IB з анти-ISG15. b, ISGилирование FLAG-мічених MDA5–2CARD і MDA5Δ2CARD у тимчасово трансфікованих клітинах HEK293T, які також експресують V5–ISG15, HA–Ube1L і FLAG–UbcH8, оцінене за допомогою FLAG PD та IB з анти-V5 через 40 годин після трансфекції. c, Ендогенне ISG-гілювання MDA5 у клітинах ISG15 KO HeLa, стабільно відновлених за допомогою вектора, WT ISG15 або ISG15-AA та котрансфікованих HA–Ube1L та FLAG–UbcH8 після обробки ІФН (1,000 U мл-1 ) протягом 24 год, визначено IP з анти-MDA5 та IB з анти-ISG15. d, ISGилування GST–MDA5–2CARD WT і Lys23Arg/Lys43Arg у клітинах HEK293T, які були спільно трансфіковані V5–ISG15, HA–Ube1L і FLAG–UbcH8 протягом 24 годин, визначено GST PD і IB з анти-V5. e, ISGілування FLAG–MDA5 WT і Lys23Arg/Lys43Arg у клітинах HEK293T, які були спільно трансфіковані V5–ISG15, HA–Ube1L і FLAG–UbcH8, визначене за допомогою FLAG PD і IB з анти-V5. f, активність репортера IFN-люциферази в клітинах HEK293T, які були трансфіковані протягом 40 годин вектором, FLAG–MDA5 WT або мутантами. Значення люциферази представлені як кратна індукція відносно значень для клітин, трансфікованих вектором, встановлених на 1. WCL досліджували за допомогою IB з анти-FLAG і анти-актином. g, аналіз RT–qPCR мРНК IFNB1 та CCL5 у клітинах HEK293T, які були тимчасово трансфіковані вектором або зростаючою кількістю FLAG–MDA5 WT або Lys23Arg/Lys43Arg. h, фосфорилювання STAT1 і кількість білка ISG (IFIT1 і -2) у WCL клітин HEK293T, які були тимчасово трансфіковані вектором або FLAG–MDA5 WT або Lys23Arg/Lys43Arg, визначені IB. I, RT–qPCR аналіз зазначених антивірусних генів у MDA5 KO SVGA, які були тимчасово відновлені або порожнім вектором, або FLAG-міченим MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg або Ser88Glu. Дані представляють принаймні два незалежні експерименти з подібними результатами (середнє значення ± sd для n= 3 біологічних повторів у f, g та i). *П< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

Рис. 3|CARD ISGylation сприяє утворенню вузлів MDA5 вищого порядку. a, b, цитозоль-мітохондріальне фракціонування WCL з NHLF, які були трансфіковані протягом 30 год нецільовою контрольною siRNA (si. C) або ISG15-специфічної siRNA (si.ISG15), і потім імітаційно оброблений або трансфікований РНК EMCV (0.4 мкг мл-1 ) (a) або RABVLe (1 пмоль мл-1 ) (b) протягом 16 годин. ІБ проводили з анти-MDA5 (a), анти-RIG-I (b), анти-ISG15 та анти-актину (a і b). -Тубулін і MAVS служили маркерами чистоти для цитозольних і мітохондріальних фракцій відповідно (а і б). c, Ендогенна олігомеризація MDA5 у WT та Isg15−/− MEFs, які були трансфіковані РНК EMCV (0,5 мкг мл−1) протягом 16 годин та оцінені за допомогою SDD–AGE та IB з анти-MDA5. WCL були додатково проаналізовані за допомогою SDS-PAGE і досліджені IB з анти-MDA5 і анти-актином. d, Олігомеризація FLAG–MDA5–2CARD у клітинах HEK293T, які були трансфіковані зазначеними siRNA, з або без HA–Ube1L та FLAG–UbcH8 протягом 48 годин, визначена NativePAGE та IB з анти-FLAG. WCL були додатково проаналізовані за допомогою SDS-PAGE та досліджені IB з анти-FLAG, анти-HA, анти-ISG15 та анти-актином. e, олігомеризація FLAG–MDA5 WT і Lys23Arg/Lys43Arg у тимчасово трансфікованих клітинах MDA5 KO HEK293, оцінена SDD–AGE та IB з анти-FLAG. WCL були додатково проаналізовані за допомогою SDS-PAGE та IB з анти-FLAG та анти-актином. f, Олігомеризація FLAG-міченого MDA5 WT і мутантів у тимчасово трансфікованих клітинах MDA5 KO HEK293, оцінена NativePAGE та IB з анти-MDA5. WCL були додатково проаналізовані за допомогою SDS-PAGE і досліджені IB з анти-MDA5 і анти-актином. g, репортерна активність IFN-люциферази в клітинах MDA5 KO HEK293, які були трансфіковані протягом 24 годин або порожнім вектором, або FLAG-міченим MDA5 WT або мутантами. Активність люциферази представлена ​​як кратна індукція відносно значень для клітин, трансфікованих вектором, встановлених на 1. Дані представляють принаймні два незалежні експерименти з подібними результатами (середнє значення ± sd для n= 3 біологічних повторів у г). ***П< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

Залежна від ISGylation передача сигналів MDA5 обмежує реплікацію вірусу.

Далі ми оцінили, чи потрібне ISGylation MDA5 для його здатності обмежувати реплікацію вірусу. FLAG–MDA5 WT, але не Lys23Arg/Lys43Arg, потужно (на ~2log) інгібував реплікацію EMCV (рис. 4a). Подібним чином клітини MDA5 KO HEK293, відновлені за допомогою WT MDA5, але не клітини, доповнені мутантом Lys23Arg/Lys43Arg, ефективно обмежували реплікацію DENV (рис. 4b). Ми також відновили SVGA астроцитів MDA5 KO, фізіологічно релевантний тип клітин для інфекції ZIKV, або вектором, або MDA5 WT, або Lys23Arg/Lys43Arg, а потім оцінили реплікацію ZIKV протягом 40- годин. Реплікація ZIKV була послаблена ~100-разом у клітинах, відновлених WT MDA5, порівняно з клітинами, що експресують вектор. Навпаки, клітини, доповнені MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg, не обмежують ZIKV, подібно до клітин, що експресують MDA5 Ser88Glu (рис. 4c). WT MDA5, але не Lys23Arg/Lys43Arg, також обмежив реплікацію SCoV2, хоча й меншою мірою, ніж це спостерігалося для інших перевірених вірусів (рис. 4d).

Рис. 4|ISGylation потрібне для обмеження вірусу MDA5. Титри EMCV у супернатанті клітин HEK293T, які були трансфіковані протягом 40 год або вектором, або FLAG–MDA5 WT, або Lys23Arg/Lys43Arg, а потім інфіковані EMCV (MOI=0.001) протягом 24 h, визначається аналізом TCID50. b, Відсоток інфікованих DENV клітин MDA5 KO HEK293, які були трансфіковані протягом 24 годин або вектором, або FLAG–MDA5 WT, або Lys23Arg/Lys43Arg, а потім імітовано оброблені або інфіковані DENV (MOI=5) протягом 48 годин , оцінений FACS з використанням анти-флавівірусу E (4G2). SSC, бічний розкид. c, титри ZIKV у супернатанті MDA5 KO SVGA, які трансфікували протягом 30 годин вектором або міченим FLAG MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg або Ser88Glu, а потім інфікували ZIKV (MOI=0.1) протягом зазначеного часу , визначений аналізом зубного нальоту. pfu, бляшкоутворюючі одиниці; hpi, години після зараження. d, титри SCoV2 у супернатанті клітин HEK293T–hACE2, які були трансфіковані протягом 24 годин порожнім вектором, або FLAG–MDA5 WT або Lys23Arg/Lys43Arg, а потім інфіковані SCoV2 (MOI=0.5) протягом 24 h, визначається за допомогою аналізу нальоту. e, Схема експериментального підходу до «відокремлення» ролі ISG15 у MDA5-опосередкованій індукції IFN від його ролі в послабленні передачі сигналу IFNAR. Доп., супернатант. f, «донорські» клітини NHLF трансфікували протягом 40 годин зазначеними siRNA, а потім інфікували mutEMCV (MOI=0.1) протягом 16 годин. Супернатанти клітин були інактивовані УФ-променями та перенесені на клітини-реципієнти Vero. Через 24 години клітини інфікували ZIKV (MOI=0.002–2) протягом 72 годин, і ZIKV-позитивні клітини визначали за допомогою імунного фарбування антифлавівірусом E (4G2) і субстратом пероксидази TrueBlue. g, «донорські» клітини RIG-I KO HEK293 трансфікували si. C або si.ISG15 разом з вектором, або FLAG–MDA5 WT, або Lys23Arg/Lys43Arg протягом 24 годин, після чого інфікування EMCV (MOI=0.001) протягом 16 годин. Супернатанти клітин, інактивованих ультрафіолетовим випромінюванням, переносили на клітини-реципієнти Vero на 24 години з подальшим інфікуванням EMCV (MOI=0.001–0,1) протягом 40 годин. Цитопатичні ефекти, викликані EMCV, візуалізували за допомогою фарбування кумасси синім. Дані представляють принаймні два незалежні експерименти з подібними результатами (середнє значення ± sd для n= 3 біологічних повторів у a–d). *П< 0.05, **P< 0.01 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

Потім ми визначили вплив глушіння ISG15 на здатність MDA5 пригнічувати розмноження вірусу. Незважаючи на те, що MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg не вдалося придушити реплікацію EMCV незалежно від глушіння ISG15, WT MDA5 ефективно обмежив реплікацію EMCV у si. С-трансфіковані клітини та, несподівано, також у клітинах, деплетованих ISG15- (Розширені дані, рис. 5а). Досліджуючи основний механізм цих несподіваних результатів, ми виявили, що EMCV-інфіковані клітини, які експресували WT MDA5, мали помітно підвищені рівні експресії білка ISG, коли ISG15 був приглушений, порівняно з інфікованими клітинами, трансфікованими WT MDA5 і si. C (Розширені дані, рис. 5b). Подібним чином, підвищена експресія транскрипту ISG та білка спостерігалася в клітинах з дефіцитом ISG15-, які були трансфіковані РНК EMCV або інфіковані mutEMCV, незважаючи на скасування індукції IFN (розширені дані, рис. 5c,d). Навпаки, нокдаун MDA5 скасував експресію білків IFN- і ISG, як і очікувалося (Розширені дані, рис. 5d). Ми помітили, що кількість білка USP18, ферменту деубіквітинування, який негативно регулює передачу сигналів IFNAR31, значно зменшилася в клітинах з виснаженням ISG15- після інфікування EMCV порівняно з інфікованими клітинами, які були трансфіковані si. C або MDA5-специфічна siRNA (розширені дані, рис. 5b,d), що узгоджується з повідомленою роллю ISG15 у запобіганні деградації USP1832. Разом ці дані свідчать про те, що в експериментальних умовах націлювання на ген ISG15- (тобто глушіння або KO) противірусний ефект ISG-гіляції MDA5 маскується аномальною регуляцією ISG через абляцію інгібіторної дії ISG15 на передачу сигналів IFNAR.

Рис. 5|SCoV2 PLpro зв’язується з MDA5–2CARD і де-ISGілює. Стрічкове зображення кристалічної структури комплексу SCoV2 PLpro: ISG15 (Protein Data Bank, номер доступу 6YVA). Вказано ключові залишки, які опосередковують взаємодію сайту 1 (Asn156 і Arg166/Glu167) або взаємодію сайту 2 (Phe69) у PLpro, а також його каталітично активний сайт (Cys111). b, ISGілування GST–MDA5–2CARD у клітинах HEK293T, які були котрансфіковані протягом 20 год вектором або V5-позначеним SCoV2 PLpro WT або мутантами разом із FLAG–ISG15, HA–Ube1L та FLAG–UbcH8, визначається GST PD і IB з анти-FLAG і анти-GST. WCL досліджували за допомогою IB з анти-V5, анти-HA, анти-FLAG та анти-актином. c, Зв’язування HA-міченого MDA5 або RIG-I з V5--міченим SCoV2–PLpro або FLAG-міченим MeV-V (позитивний контроль) у тимчасово трансфікованих клітинах HEK293T, визначене HA PD та IB з анти-V5 або анти-FLAG і анти-HA. WCL були досліджені IB з анти-V5 та анти-FLAG. d, Олігомеризація FLAG–MDA5–2CARD у клітинах HEK293T, які були спільно трансфіковані вектором або V5-позначеним SCoV2 PLpro WT або Cys111Ala протягом 24 годин, оцінено NativePAGE та IB з анти-FLAG. WCL були додатково проаналізовані за допомогою SDS-PAGE та досліджені IB з анти-FLAG, анти-V5 та анти-актином. e, ISGілування GST–MDA5–2CARD у клітинах HEK293T, які також експресували FLAG–ISG15, HA–Ube1L і FLAG–UbcH8 і були котрансфіковані протягом 40 годин вектором або вказаним V5-міченим коронавірусним PLpro білків, визначених GST PD і IB з анти-FLAG, анти-V5 і анти-GST. Дані представляють принаймні два незалежні експерименти з подібними результатами.

Далі ми застосували аналіз захисту від вірусів, який експериментально відокремлює передачу сигналів MDA5 в інфікованих вірусом клітинах від передачі сигналів IFNAR у тих самих клітинах (рис. 4e). Супернатанти з mutEMCV-інфікованих «донорських» клітин, які були або si. C, трансфіковані або збіднені ISG15 або MDA5, були інактивовані ультрафіолетом (УФ), а потім перенесені до неінфікованих клітин-реципієнтів. «Прімовані» клітини-реципієнти потім інфікували ZIKV, щоб безпосередньо контролювати противірусний ефект MDA5-опосередкованого виробництва IFN донорськими клітинами. Тоді як супернатанти з si. C-трансфіковані «донорські» клітини сильно пригнічували реплікацію ZIKV, а супернатанти з нокдаунних клітин ISG15 або MDA5 мінімально обмежували інфекцію ZIKV (рис. 4f). Подібним чином супернатанти культури з EMCV-інфікованих донорських клітин, трансфікованих WT MDA5 разом із si. C призвело до більшого захисту клітин-реципієнтів від вірусного зараження, ніж клітин, що експресують WT MDA5 і збіднені ISG15 (рис. 4g). У сукупності ці дані демонструють, що ISGylation є важливим для MDA5-опосередкованого обмеження ряду РНК-вірусів.

Рис. 6|SCoV2 PLpro пригнічує ISG15-опосередковану передачу сигналів MDA5 через його активність де-ISGylase. a, аналіз RT–qPCR транскриптів IFNB1, IFNL1, ISG15, MDA5 та RIG-I у NHLF, які були трансфіковані зазначеними siRNA протягом 40 годин, а потім трансфіковані імітацією РНК або РНК SCoV2 (0,4 мкг мл −1 ) протягом 24 год. b, Зв’язування SCoV2 Nsp3 з ендогенним MDA5 у клітинах A549–hACE2, які були інфіковані SCoV2 (MOI=0.5) протягом 24 годин, визначено IP з анти-MDA5 (або контролем ізотипу IgG), а потім IB з анти-Nsp3 і анти-MDA5. WCL досліджували за допомогою IB з анти-Nsp3 та анти-актином. c, Ендогенне ISG-гілювання MDA5 у клітинах A549–hACE2, які були імітовано інфіковані або інфіковані SCoV2 (MOI=0.5) протягом 40 годин у присутності інгібітора PLpro (GRL-0617; 50 мкМ) або носія контроль (диметилсульфоксид), визначений IP з анти-MDA5 (або контроль ізотипу IgG), потім IB з анти-ISG15 та анти-MDA5. Велика кількість білків IFIT1, RSAD2, ISG15 і актину в WCL досліджували IB. Ефективність реплікації вірусу була перевірена IB з анти-Nsp3 і анти-Spike (S). d, RT–qPCR аналіз транскриптів IFNB1, CCL5 та IFIT1, а також геномної РНК EMCV (gRNA) у клітинах HeLa, які були тимчасово трансфіковані протягом 24 годин вектором або V5–SCoV2 PLpro WT або мутантами, а потім інфіковані mutEMCV (МВС=0.5) протягом 12 год. e, титри EMCV у супернатанті клітин RIG-I KO HEK293, які були тимчасово трансфіковані протягом 24 годин вектором або FLAG–MDA5 разом з V5--міченим SCoV2 PLpro WT, Cys111Ala або Arg166Ser/Glu167Arg, а потім інфіковані з EMCV (MOI=0.001) протягом 16 годин, визначено за допомогою аналізу нальоту. f, Достаток білка зазначених ISG у WCL з експерименту на e, визначений IB із зазначеними антитілами. Дані представляють принаймні два незалежні експерименти з подібними результатами (середнє значення ± sd для n= 3 біологічних повторів у a, d та e). *П< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

SCoV2 PLpro спрямований на MDA5 для де-ISGylation.

Коронавіруси, такі як SARS-CoV (SCoV), MERS-CoV і нещодавно з’явився SCoV2, кодують PLpro, який опосередковує розщеплення вірусного поліпротеїну33. Крім того, PLpro має деубіквітінуючу та де-ISG-гілюючу дію. Нещодавно було показано, що SCoV2 PLpro модулює противірусні відповіді головним чином через свою активність де-ISGylase15. Оскільки відомо, що MDA5 є головним датчиком для виявлення коронавірусів34,35, і оскільки наші дані показали, що ISGylation потрібне для MDA5-опосередкованого обмеження вірусу, ми перевірили, чи SCoV2 PLpro ферментативно видаляє MDA5 ISGylation для протидії вродженому імунітету. SCoV2 PLpro WT, але не його каталітично неактивний мутант (PLpro Cys111Ala)15, скасував ISGилування GST–MDA5–2CARD і FLAG–MDA5 (рис. 5a, b і розширені дані, рис. 6a). Мутанти PLpro Asn156Glu та Arg166Ser/Glu167Arg, які мають незначні та серйозні порушення в зв’язуванні ISG15 на інтерфейсі «сайту 1», відповідно 14, 36, незначно чи ні впливали на ISGylation. Навпаки, PLpro Phe69Ala, в якому порушується інтерфейс «сайту 2», який переважно визначає зв’язування з убіквітином, але не з ISG15,14,36, зменшує ISG-гіляцію MDA5 так само сильно, як і WT PLpro (рис. 5a, b і розширені дані, рис. 6a). ). Проте SCoV2 PLpro не пригнічував убіквітування RIG-I–2CARD (розширені дані, рис. 6b). Ми виявили, що PLpro взаємодіє конкретно з MDA5, але не з RIG-I, як і MeV-V, який зв’язує MDA5 і служить контролем37 (рис. 5c). Низькі кількості PLpro пригнічували передачу сигналів MDA5, але не RIG-I, тоді як більші кількості PLpro пригнічували передачу противірусних сигналів обома RLR (розширені дані, рис. 6c). Це посилює MDA5 як пряму ціль PLpro. Де-ISGylation IRF3, ймовірно, пояснює інгібуючий ефект, який вищі дози PLpro мають на передачу сигналів RLR15,38. При дослідженні впливу PLpro на олігомеризацію MDA5–2CARD PLpro WT, але не Cys111Ala, ефективно блокував олігомеризацію MDA5–2CARD (рис. 5d), вказуючи на те, що SCoV2 PLpro інгібує залежне від ISGilation утворення олігомеру MDA5 через його ферментативну активність. Ферменти PLpro споріднених -коронавірусів, SCoV, MERS–CoV і вірусу мишачого гепатиту (MHV), а також -коронавірусу HCoV-NL63 (NL63) також зв'язувалися з і ефективно знижували MDA5–2CARD ISGylation (рис. 5e). , що свідчить про те, що антагонізм MDA5 з боку PLpro може бути широко збереженим серед коронавірусів.

цистанхе рослина, що підвищує імунну систему

SCoV2 PLpro антагонізує ISG15-залежну передачу сигналів MDA5.

Потім ми визначили релевантність ISG15-залежної сигналізації MDA5 для індукції противірусних цитокінів, викликаної SCoV2. Оскільки відомо, що інфекція SCoV2 мінімально індукує ІФН типу I завдяки ефективним вірусним антагонізмам39, ми виділили загальну РНК із SCoV2-інфікованих клітин, а потім повторно трансфікували її в клітини для стимуляції вродженої імунної сигналізації. РНК SCoV2, але не РНК з імітаційно оброблених клітин, надійно індукувала транскрипти IFN; однак ця індукція була помітно зменшена, коли ISG15 або MDA5 були приглушені (рис. 6a). Нокдаун RIG-I не вплинув негативно на експресію антивірусного гена, викликану РНК SCoV2, що вказує на те, що РНК-PAMP SCoV2 в основному сприймаються віссю ISG15-MDA5 (рис. 6a).

Ми виявили, що неструктурний білок 3 SCoV2 (Nsp3), в якому знаходиться PLpro, легко взаємодіяв з ендогенним MDA5 під час автентичної інфекції SCoV2 (рис. 6b). Ендогенне ISG-гілювання MDA5 було неможливо виявити в SCoV2-інфікованих клітинах, хоча вірус ініціював експресію ISG15; проте, в інфікованих клітинах, оброблених специфічним інгібітором PLpro15, MDA5 ISGylation та індукція ISG нижче за течією були сильно посилені (рис. 6c), що підтверджує припущення, що PLpro ефективно пригнічує MDA5 ISGylation та передачу сигналів під час живої інфекції SCoV2. Далі ми перевірили вплив WT і мутантного PLpro на активацію ендогенного MDA5 під час інфекції mutEMCV. Відповідно до їх впливу на MDA5 ISGylation (рис. 5b і розширені дані, рис. 6a), SCoV2 PLpro WT і Phe69Ala запобігали індукції антивірусного транскрипту, тоді як MDA5 Arg166Ser/Glu167Arg, подібно до мутанта Cys111Ala, не впливали на експресію антивірусного гена (рис. 6d). Відповідно до цього, реплікація mutEMCV була посилена в клітинах, що експресують PLpro WT або Phe69Ala, але не в клітинах, що експресують PLpro Cys111Ala або Arg166Ser/Glu167Arg (рис. 6d). Подібним чином, WT PLpro, але не мутант Arg166Ser/Glu167Arg або Cys111Ala, блокував обмеження EMCV за допомогою FLAG–MDA5 (рис. 6e); вплив на реплікацію вірусу корелює з індукованими білками ISG (рис. 6f). У сукупності це встановлює SCoV2 PLpro як антагоніст IFN, який активно де-ISGylates MDA5.

Обговорення

Відомо, що кон’югація ISG15 надає противірусну активність багатьом вірусам; однак було ідентифіковано лише кілька справжніх субстратів12. З іншого боку, ISG15 у своїй некон’югованій формі діє провірусно, посилюючи USP18-опосередковане інгібування сигналу IFNAR31,32,40. У цьому дослідженні визначено ключову роль ISGylation в MDA5-опосередкованій індукції IFN. Наша робота також підкреслює важливість експериментального дизайну, в якому відокремлення ролі ISG15 в активації MDA5 від ролі в пригніченні сигналізації IFNAR є важливим для виявлення потужної противірусної активності ISG15. В інфікованому організмі результат інфекції та патогенез, які можуть залежати від контексту, визначають, ймовірно, сукупність подій ISG-гіляції (що впливають як на білки хазяїна, так і на вірусні)12.

Переваги Cistanche tubulosa- зміцнити імунну систему

Наші результати показують, що ISGylation MDA5 діє аналогічно пов’язаному з Lys63-убіквітуванням RIG-I5: обидва PTM (1) регулюються PP1-індукованим дефосфорилюванням і (2) сприяють олігомеризації CARD і підвищенню RLR - замовлення збірок. Однак, у той час як убіквітин у великій кількості міститься як у неінфікованих, так і в інфікованих клітинах, експресія ISG15 сильно підвищується при стимуляції IFN. Тим не менш, навіть на базальних рівнях ISG15 кон’югується з багатьма білками господаря20, включаючи MDA5, як показала наша робота, що може бути достатнім для початкової активації MDA5. Під час вірусних інфекцій, які визначаються кількома PRR, MDA5 ISGylation може бути механізмом «підготовки», за допомогою якого регуляція ISG15 безпосереднім вродженим датчиком (наприклад, RIG-I)41 примушує MDA5 перейти в режим «кік-старту». Оскільки ISG15 негативно регулює RIG-I16,17, ISGylation може ініціювати «перемикання датчика», де активація MDA5 сприяє зростанню рівня ISG15, тоді як активність RIG-I послаблюється. Ми визначили, що SCoV2 PLpro антагонізує MDA5 ISGylation через його ферментативну активність після зв’язування з сенсором; ця стратегія, ймовірно, збережена серед коронавірусів, що вимагає подальшого дослідження. Кріоелектронний мікроскопічний аналіз показав, що коронавірусний Nsp3 є частиною порового комплексу, який охоплює подвійні мембранні везикули, отримані з ендоплазматичного ретикулуму, і експортує нещодавно синтезовану вірусну РНК42. Таким чином, MDA5 може розташуватися в безпосередній близькості від сайту експорту вірусної РНК, щоб полегшити виявлення PAMP; проте домен PLpro Nsp3 (який знаходиться на стороні цитоплазми) блокує передачу сигналу MDA5 через пряму де-ISGylation. Деякі віруси також можуть інгібувати MDA5 ISGylation через порушення регуляції фосфорилювання MDA5, як показано для MeV-V. Таким чином, наше дослідження розкриває визначну роль ISGylation в активації MDA5-опосередкованого імунітету, а також його інгібування SCoV2, розкриваючи потенційну молекулярну мішень для розробки терапевтичних засобів проти COVID-19.

Список літератури

1. Liu, G. & Gack, MU. Окремі та організовані функції РНК-сенсорів у вроджених. Імунітет 53, 26–42 (2020).

2. Wu, J. & Chen, ZJ Вроджене імунне відчуття та сигналізація цитозольних нуклеїнових кислот. Annu. Rev. Immunol. 32, 461–488 (2014).

3. Chow, KT, Gale, M.Jr & Loo, YM RIG-I та інші РНК-сенсори в противірусному імунітеті. Annu. Rev. Immunol. 36, 667–694 (2018).

4. Schlee, M. Головні сенсори патогенних РНК-RIG-I подібних рецепторів. Імунобіологія 218, 1322–1335 (2013).

5. Rehwinkel, J. & Gack, MU RIG-I-подібні рецептори: їх регуляція та роль у чутливості РНК. Нац. Rev. Immunol. 20, 537–551 (2020).

6. Wies, E. та ін. Дефосфорилювання РНК-сенсорів RIG-I і MDA5 фосфатазою PP1 є важливим для вродженої імунної сигналізації. Імунітет 38, 437–449 (2013).

7. Gack, MU та ін. Убіквітинлігаза TRIM25 RING-finger E3 необхідна для опосередкованої RIG-I противірусної активності. Nature 446, 916–920 (2007).

8. Chiang, C. & Gack, MU Посттрансляційний контроль внутрішньоклітинних шляхів сприйняття патогенів. Trends Immunol. 38, 39–52 (2017).

9. Lazear, HM, Scoggins, JW & Diamond, MS Спільні та відмінні функції інтерферонів типу I та типу III. Імунітет 50, 907–923 (2019).

10. Schoggins, JW Інтерферон-стимульовані гени: що вони всі роблять? Annu. Преподобний Вірол. 6, 567–584 (2019).

11. Zhang, D. & Zhang, DE Інтерферон-стимульований ген 15 і система білка ISGylation. J. Interferon Cytokine Res. 31, 119–130 (2011).

12. Perng, YC & Lenschow, DJ ISG15 у противірусному імунітеті та не тільки. Нац. Rev. Microbiol. 16, 423–439 (2018). 13. Хаджадж Дж. та ін. Порушення активності інтерферону I типу та запальних реакцій у пацієнтів із тяжкою формою COVID-19. Наука 369, 718–724 (2020).

14. Klemm, T. et al. Механізм та інгібування папаїноподібної протеази, PLpro, SARS-CoV-2. EMBO J. 39, e106275 (2020).

15. Шин Д. та ін. Папаїноподібна протеаза регулює поширення вірусу SARS-CoV-2 і вроджений імунітет. Nature 587, 657–662 (2020).

16. Kim, MJ, Hwang, SY, Imaizumi, T. & Yoo, JY. Регуляція негативного зворотного зв'язку опосередкованої RIG-I противірусної сигналізації за допомогою інтерферон-індукованої кон'югації ISG15. Ж. Вірол. 82, 1474–1483 (2008).

17. Du, Y. та ін. LRRC25 пригнічує передачу сигналів IFN типу I, націлюючись на RIG-I, пов’язану з ISG15-, для аутофагічної деградації. EMBO J. 37, 351–366 (2018).

18. Хато С. В. та ін. Лідерний протеїн менговірусу блокує транскрипцію гена інтерферону-альфа/бета та інгібує активацію регуляторного фактора інтерферону 3. Cell Microbiol. 9, 2921–2930 (2007).

19. Deddouche, S. та ін. Ідентифікація LGP2-асоційованого агоніста MDA5 в клітинах, інфікованих пікорнавірусом. eLife 3, e01535 (2014).

20. Durfee, LA, Lyon, N., Seo, K. & Huibregtse, JM Система кон’югації ISG15 широко спрямована на новосинтезовані білки: наслідки для противірусної функції ISG15. мол. Cell 38, 722–732 (2010).

21. Lenschow, DJ та ін. Ідентифікація стимульованого інтерфероном гена 15 як антивірусної молекули під час інфікування вірусом Сіндбіс in vivo. Ж. Вірол. 79, 13974–13983 (2005).

22. Gack, MU, Nistal-Villan, E., Inn, KS, Garcia-Sastre, A. & Jung, JU Негативна регуляція противірусної активності RIG-I, опосередкована фосфорилюванням. Ж. Вірол. 84, 3220–3229 (2010).

23. Ністал-Віллан Е. та ін. Негативна роль фосфорилювання RIG-I серину 8 у регуляції продукції бета-інтерферону. J. Biol. Chem. 285, 20252–20261 (2010).

24. Maharaj, NP, Wies, E., Stoll, A. & Gack, MU Звичайна протеїнкіназа C-альфа (PKC-альфа) і PKC-бета негативно регулюють трансдукцію противірусного сигналу RIG-I. Ж. Вірол. 86, 1358–1371 (2012).

25. Davis, ME та ін. Антагонізм фосфатази PP1 білком V вірусу кору необхідний для вродженого імунного виходу MDA5. Cell Host Microbe 16, 19–30 (2014).

26. Lin, JP, Fan, YK & Liu, HM Te 14-3-3eta chaperone білок сприяє противірусному вродженому імунітету шляхом полегшення олігомеризації MDA5 і внутрішньоклітинного перерозподілу. PLoS Pathog. 15, e1007582 (2019).

27. Wu, B. та ін. Структурна основа для розпізнавання dsRNA, утворення ниток і активації противірусного сигналу MDA5. Cell 152, 276–289 (2013).

28. Yu, Q., Qu, K. & Modis, Y. Cryo-EM структури ниток MDA5-dsRNA на різних стадіях гідролізу АТФ. мол. Cell 72, 999–1012 (2018).

29. Bruns, AM, Leser, GP, Lamb, RA & Horvath, CM Вроджений імунний датчик LGP2 активує противірусну передачу сигналів, регулюючи взаємодію MDA5-РНК і складання ниток. мол. Cell 55, 771–781 (2014).

30. Uchikawa, E. та ін. Структурний аналіз зв'язування дцРНК з антивірусними рецепторами розпізнавання образів LGP2 і MDA5. мол. Cell 62, 586–602 (2016).

31. Малахова О. А. та ін. UBP43 є новим регулятором передачі сигналів інтерферону незалежно від його активності ізопептидази ISG15. EMBO J. 25, 2358–2367 (2006).

32. Чжан, X. та ін. Внутрішньоклітинний ISG15 людини запобігає надмірній ампліфікації інтерферону альфа/бета та автозапальнню. Nature 517, 89–93 (2015).

33. Harcourt, BH et al. Ідентифікація продуктів реплікази коронавірусу тяжкого гострого респіраторного синдрому та характеристика активності папаїноподібної протеази. Ж. Вірол. 78, 13600–13612 (2004).

34. Roth-Cross, JK, Bender, SJ & Weiss, SR Вірус мишачого коронавирусного гепатиту розпізнається MDA5 та індукує інтерферон типу I у макрофагах/мікроглії мозку. Ж. Вірол. 82, 9829–9838 (2008).

35. Меначерія В. Д. та ін. Атенуація та відновлення мутантного коронавірусу тяжкого гострого респіраторного синдрому без активності 2'-O-метилтрансферази. Ж. Вірол. 88, 4251–4264 (2014).

36. Бекеш М. та ін. Визнання пов’язаної з Lys48-діубіквітину та деубіквітінуючої активності папаїноподібної протеази коронавірусу SARS. мол. Cell 62, 572–585 (2016).

37. Чайлдс К. та ін. mda-5, але не RIG-I, є звичайною мішенню для білків V параміксовірусу. Вірусологія 359, 190–200 (2007).

38. Shi, HX та ін. Позитивна регуляція активації регуляторного фактора 3 інтерферону Herc5 через модифікацію ISG15. мол. Cell Biol. 30, 2424–2436 (2010).

39. Blanco-Melo, D. et al. Незбалансована реакція організму на SARS-CoV-2 сприяє розвитку COVID-19. Cell 181, 1036–1045 (2020).

40. Speer, SD та ін. Дефіцит ISG15 і підвищена стійкість до вірусу у людей, але не у мишей. Нац. Комун. 7, 11496 (2016).

41. Ерретт, Дж. С., Сутар, М. С., Макміллан, А., Даймонд, М. С. і Гейл, М. молодший. Основні, незайві ролі RIG-I і MDA5 у виявленні та контролі інфекції вірусу Західного Нілу. Ж. Вірол. 87, 11416–11425 (2013).

42. Wolf, G. et al. Молекулярна пора охоплює подвійну мембрану органели реплікації коронавірусу. Наука 369, 1395–1398 (2020).

43. Major, EO та ін. Створення лінії гліальних клітин людського плоду, яка підтримує розмноження вірусу JC. Proc. Нац. акад. Sci. США 82, 1257–1261 (1985).

44. Hertzog, J. та ін. Зараження бразильським ізолятом вірусу Зіка генерує стимулюючу РНК RIG-I, а вірусний білок NS5 блокує індукцію та передачу сигналів ІФН типу I. Євро. J. Immunol. 48, 1120–1136 (2018).

45. Cerikan, B. et al. Внутрішня адаптація клітин, що виникає внаслідок хронічної абляції ключового регулятора rho GTPase. Dev. Осередок 39, 28–43 (2016).

46. ​​Chan, YK & Gack, MU Фосфоміметичний механізм протидії вірусу денге вродженому імунітету. Нац. Immunol. 17, 523–530 (2016).

47. Riedl, W. та ін. Вірус Зіка NS3 імітує клітинний 14-3-3-мотив зв’язування для протидії вродженому імунітету, опосередкованому RIG-I та MDA5-. Cell Host Microbe 26, 493–503 (2019).

48. Ulane, CM, Rodriguez, JJ, Parisien, JP & Horvath, CM. Повсюдне поширення та деградація STAT3 вірусом епідемічного паротиту пригнічує передачу сигналів цитокінів і онкогенів. Ж. Вірол. 77, 6385–6393 (2003).

49. Oudshoorn, D. та ін. HERC6 є основною лігазою E3 для глобальної кон’югації ISG15 у клітинах миші. PLoS ONE 7, e29870 (2012).

50. Кім, ДК та ін. Повна, гнучка колекція регіонів кодування SARS-CoV-2. G3 (Bethesda) 10, 3399–3402 (2020).

51. Chiang, C. та ін. Онкопротеїн E6 вірусу папіломи людини націлений на USP15 і TRIM25, щоб придушити опосередковану RIG-I вроджену імунну передачу сигналів. Ж. Вірол. 92, e01737-17 (2018).

52. Gack, MU та ін. Роль RIG-I N-кінцевого тандемного CARD і варіанта сплайсингу в TRIM25-опосередкованій трансдукції противірусного сигналу. Proc. Нац. акад. Sci. США 105, 16743–16748 (2008).

53. Chiang, JJ та ін. Вірусне демаскування клітинних транскриптів псевдогенів 5S рРНК індукує опосередкований RIG-I імунітет. Нац. Immunol. 19, 53–62 (2018).

54. Sparrer, KMJ та ін. TRIM23 опосередковує індуковану вірусом аутофагію через активацію TBK1. Нац. мікробіол. 2, 1543–1557 (2017).