In vitro інгібування ниркової секреції OCT2 і MATE1 протиблювотними препаратами
Mar 18, 2022
Блессі Джордж1, Ся Вень1, Едгар А. Джеймс2, Мелані С. Радість3,4,5,†і Лорен М. Алексунес
Анотація:Переносник органічних катіонів 2 (2 ЖОВТНЯ) і протеїн екструзії кількох лікарських засобів і токсинів 1 (MATE1) опосередковують секрецію ліків нирками. Останні дослідження показують, що ондансетрон, 5-препарат-антагоніст HT3, який використовується для запобігання нудоті та блювоті, може пригнічувати2 ЖОВТНЯ- і MATE1-посередницький транспорт. Метою цього дослідження було перевірити здатність п’яти 5-препаратів-антагоністів НТ3 пригнічувати2 ЖОВТНЯі транспортери MATE1. Транспортування субстрату зонда OCT2/MATE1 ASP plus було оцінено за допомогою двох моделей: (1) HEK293ниркаклітини з надмірною експресією людини2 ЖОВТНЯабо MATE1 і (2) клітини MDCK, трансфіковані людиною2 ЖОВТНЯand MATE1. In HEK293 cells, the inhibition ofASP+ uptake by OCT2 listed in order of potency was palonosetron (IC50: 2.6 µM) > ondansetron >granisetron > tropisetron > dolasetron (IC50: 85.4 µM) and the inhibition of ASP+ uptake by MATE1in order of potency was ondansetron (IC50: 0.1 µM) > palonosetron = tropisetron > granisetron >доласетрон (IC50: 27,4 мкМ). Ондансетрон (0.5–20 мкМ) пригнічував базолатеральний до апікальний трансцелюлярний транспорт ASP плюс до 64 відсотків. Більш високі концентрації (10 і 20 мкМ) палоносетрону, тропісетрону та доласетрону аналогічно знижували міжклітинний транспорт ASP plus. У подвійно трансфікованих клітинах OCT2-MATE1 MDCK ондансетрон у концентраціях 0,5 і 2,5 мкМ викликав значне внутрішньоклітинне накопичення ASP plus. У сукупності ці дані свідчать про те, що 5-антагоністи HT3 можуть інгібувати ниркову секрецію катіонних препаратів, перешкоджаючи функції OCT2 та/або MATE1.
Ключові слова:Жовтень2; MATE1; катіонний; 5-антагоніст HT3;нирка; секреція; транспорт
Контакти:joanna.jia@wecistanche.com
Cistanche tubulosa запобігаєнирказахворювання, натисніть тут, щоб отримати зразок
1. Введення
Ниркова секреція досягається скоординованим поглинанням і відтоком ліків через епітелій канальців. Для лікарських засобів і токсикантів, які є органічними катіонами, їх трансепітеліальний транспорт у фільтрат спочатку досягається транспортером органічних катіонів 2 (OCT2) на базолатеральній поверхні, а згодом транспортером мультилікарської екструзії та екструзії токсинів 1 (MATE1) на щітковій межі мембрана. До відкриття генів OCT2/SLC22A1 і MATE1/SLC47A1 було добре зрозуміло, що секрецію органічних катіонів можна інгібувати фармакологічно [1]. Використовуючи різноманітні експериментальні підходи до різних доклінічних видів, було продемонстровано, що органічні катіони піддаються активному транспорту та секреції нирками [2–4]. Після цих ранніх спостережень дослідження просунулися до розуміння не лише молекулярних механізмів секреції органічних катіонів, але й потенціалу клінічно значущої взаємодії лікарських засобів після руйнування OCT2 і MATE1 (переглянуто в [5]).
Антагоністи серотонінового 5-рецептора HT3 стали критично важливими препаратами для лікування нудоти та блювання. Серотонін виділяється ентерохромаффінними клітинами тонкої кишки. 5-Антагоністи НТ3 пригнічують іонотропний ліганд-керований іонний канал на аферентних нервах від блукаючого нерва та запобігають рефлексу блювання [6]. Ондансетрон був першим антагоністом 5-HT3, схваленим для запобігання нудоті та блюванню, спричиненим хіміотерапією [7,8]. З того часу були розроблені додаткові препарати цього класу (включаючи тропісетрон, гранісетрон, доласетрон і палоносетрон) [9]. Хоча основним терапевтичним показанням 5-антагоністів НТ3 є профілактика хіміотерапії та блювання, спричиненого радіацією, вони також схвалені для лікування післяопераційної нудоти та блювання та використовуються не за призначенням для лікування ранкової нудоти, гіперемезису вагітних , післяопераційний делірій та свербіж [10–14].
Враховуючи катіонну природу 5-антагоністів HT3 (рис. 1), вони стали субстратами та інгібіторами транспортерів OCT і MATE. Дослідження in vitro виявили, що ондансетрон і тропісетрон є субстратами та інгібіторами OCT1 і OCT2 [15–20]. Крім того, було показано, що в осіб із варіантами втрати функції гена OCT1/SLC22A1 фармакокінетика тропісетрону змінена та клінічна ефективність [16]. Подібним чином ондансетрон може пригнічувати транспортери MATE, що призводить до накопичення в нирках протидіабетичного препарату метформіну, а також до посилення нефротоксичності протипухлинного препарату цисплатину [19]. У людей ондансетрон знижує нирковий кліренс метформіну, ймовірно, шляхом інгібування витоку MATE1 [21]. Разом ці дані вказують на потенціал 5-антагоністів HT3 пригнічувати трансепітеліальну секрецію ліків через OCT2 і MATE1. Таким чином, ми прагнули систематично порівнювати п’ять 5-антагоністів HT3 щодо їх здатності інгібувати опосередкований OCT2 та MATE1-транспортування катіонного субстрату зонда, використовуючи одно- та подвійну трансфекціюниркаклітини. Слід зазначити, що поточне дослідження було зосереджено насамперед на MATE1, оскільки рівень білка MATE2-K у людининиркаРаніше було показано, що вони нижче нижньої межі кількісного визначення за допомогою мас-спектрометрії [22].
2. Результати
2.1. Характеристика ASP plus як флуоресцентного субстрату в клітинах HEK293 із надмірною експресією OCT2 та MATE1
Початкові дослідження характеризували поглинання ASP plus клітинами, які надмірно експресують порожній вектор (EV), OCT2 або MATE1 (рис. 2). ASP plus демонструє залежне від часу (рис. 2A) і залежне від концентрації (рис. 2B) поглинання в обох клітинах, що експресують OCT2- і MATE1-, і демонструє насичену кінетику (OCT2: Vmax 8,1 нмоль/мг/хв. , Km 2,9 мкМ, R2 0,95; MATE1: Vmax 3,4 нмоль/мг/хв, Km 8,2 мкМ, R2 0,96). Клітини EV продемонстрували мінімальне накопичення ASP plus (Vmax 1,9 нмоль/мг/хв, Km 37,3 мкМ, R2 0.92). Ґрунтуючись на цих результатах, поглинання ASP плюс було визначено кількісно через 1 хвилину (лінійний діапазон для транспорту OCT2 і MATE1) у концентрації 10 мкМ, що забезпечувало достатню чутливість для виявлення флуоресценції та скринінгу 5-HT3 антагоністів як інгібіторів.
Щоб переконатися, що ці умови відображають активний транспорт кожним транспортером, були визначені значення IC5{{10}} циметидину, добре відомого інгібітора OCT2 та MATE1 (рис. 3 і таблиця 1). IC50 для циметидину становила 24,5 ± 4,0 мкМ у клітинах, що експресують OCT2-, і 0,23 ± 0,2 мкМ у клітинах, які експресують MATE1-, що узгоджується з опублікованими даними, які показують інгібування MATE1 при нижчих концентраціях [18,20]. Циметидин не впливав на ASP плюс поглинання клітинами EV.
2.2. Інгібування OCT2- і MATE1-опосередкованого транспорту протиблювотним препаратом у клітинах HEK293
П’ять різних 5-антагоністів HT3 (ондансетрон, палоносетрон, гранісетрон, тропісетрон і доласетрон) були оцінені на предмет інгібування транспорту OCT2 і MATE1 у клітинах HEK293 з використанням ASP plus як субстрат (рис. 3). Залежне від концентрації зниження ASP плюс поглинання спостерігалося в клітинах, що експресують OCT2- і MATE1-, у присутності всіх п’яти антагоністів 5-HT3, протестованих у діапазоні концентрацій. Значення IC50 для інгібування ASP плюс накопичення антагоністами 5-HT3 з використанням перевірених діапазонів концентрацій наведено в таблиці 1. За винятком гранісетрону, інші антагоністи 5-HT3 інгібували MATE1 сильніше, ніж вони. 2 ЖОВТНЯ. Транспорт, опосередкований OCT2-, пригнічувався до ~90 відсотків, тоді як транспорт, опосередкований MATE1-, пригнічувався до ~70 відсотків у досліджуваних концентраціях.
Загалом поглинання ASP plus клітинами EV значною мірою не змінювалося 5-антагоністами HT3. Однак було зазначено, що палоносетрон і тропісетрон стимулюють додаткове поглинання ASP плюс у клітинах EV, а найвища концентрація гранісетрону спричиняє невелике зниження накопичення ASP плюс.
2.3. Характеристика міжклітинного транспорту та внутрішньоклітинного накопичення ASP plus у клітинах OCT2/MATE1-, що експресують MDCK
Щоб дослідити комбінований внесок OCT2 і MATE1 у трансепітеліальну секрецію, наступні експерименти проводили на клітинах MDCK, які поляризуються базолатеральною (OCT2) і апікальною (MATE1) поверхнями. Експресію білка OCT2 і MATE1 було підтверджено в подвійно трансфікованих клітинах MDCK за допомогою вестерн-блоттингу (рис. 4A). Трансцелюлярний транспорт субстрату катіонного зонду ASP plus (25 мкМ) перевіряли в цих клітинах за допомогою вставок Transwell. Базолатеральний до апікального (B-до-A) транспорт ASP plus був набагато більшим (до 28-разів за 120 хв), ніж апікальний до базолатерального (A-до-B) транспорт у подвійно трансфікованих клітинах OCT2/MATE1 (рис. 4B). Співвідношення витоку В до А/А до В через 120 хв було оцінено як 2,7 для клітин OCT2/MATE1, що підтримують активну секрецію ASP plus. Навпаки, контрольні клітини продемонстрували набагато нижчий ASP плюс транспорт в обох напрямках порівняно з клітинами OCT2/MATE1. Транспорт B-to-A ASP plus був лише значно вищим порівняно з транспортом A-to-B у контрольних клітинах через 90 (13-рази) та 120 хвилин (1.7-рази) ). Усі подальші аналізи інгібування проводили в напрямку B-A.
Здатність хімічних речовин інгібувати ASP плюс потік і накопичуватися в подвійно трансфікованих клітинах OCT2/MATE1 за визначених умов тестування оцінювали за допомогою трьох інгібіторів позитивного контролю (циметидин 5 і 50 мкМ, піриметамін 1 мкМ і оланзапін 20 мкМ) (Рисунок 4C). Циметидин є відомим інгібітором OCT2 і MATE1 з більшою ефективністю щодо MATE1 (табл. 1) [18]. Піриметамін є специфічним інгібітором MATE1 [23], тоді як було виявлено, що оланзапін сильніше інгібує OCT2 (додатковий малюнок S1) [18, 20]. Усі три хімічні речовини пригнічували трансцелюлярний потік ASP plus (18 відсотків циметидину 5 мкМ, 40 відсотків циметидину 50 мкМ, 36 відсотків піриметаміну 1 мкМ і 28 відсотків оланзапіну 20 мкМ через 120 хвилин).
Накопичення ASP плюс внутрішньоклітинно також кількісно визначали в лізатах через 120 хв. Циметидин і піриметамін збільшували внутрішньоклітинне накопичення ASP plus у 18- раз і 1}3-раз (в основному через інгібування MATE1) відповідно, тоді як оланзапін зменшував внутрішньоклітинне накопичення ASP plus на 51 раз відсотків (через інгібування OCT2). У контрольних клітинах не спостерігалося суттєвого пригнічення транспорту B-to-A ASP plus в будь-який момент часу. У контрольних клітинах також не спостерігалося значних змін у внутрішньоклітинному накопиченні ASP плюс порівняно з контрольними клітинами-носіями, за винятком помірного зниження накопичення ASP плюс у присутності оланзапіну 20 мкМ.
2.4. Інгібування міжклітинного транспорту ASP plus 5-антагоністами HT3 в клітинах OCT2/MATE1-, що експресують MDCK
П’ять 5-антагоністів HT3 (ондансетрон, палоносетрон, гранісетрон, тропісетрон і доласетрон) оцінювали на їх здатність впливати на міжклітинний транспорт і внутрішньоклітинне накопичення ASP плюс у клітинах, подвійно трансфікованих OCT2/MATE1 (рис. 5 і 6). Циметидин (50 мкМ) додавали до кожного експерименту в паралельний набір Transwells як позитивний контроль. Цікаво, що всі п’ять антагоністів 5-HT3 демонстрували різний ступінь інгібування трансцелюлярного транспорту B-to-A ASP plus (рис. 5). Порівняно з клітинами, обробленими носієм, ондансетрон інгібував транспорт B-to-A ASP plus залежно від концентрації, з 36-відсотковим інгібуванням через 120 хвилин у найвищій протестованій концентрації (20 мкМ). Палоносетрон і тропісетрон також показали залежне від концентрації інгібування секреції ASP плюс, яке було значущим при 10 і 20 мкМ для всіх часових точок. Інгібування секреції ASP плюс спостерігалося за допомогою палоносетрону та тропісетрону при 20 мкМ. Доласетрон при 10 і 20 мкМ інгібував ASP плюс транспорт лише через 120 хв. Нарешті, гранісетрон не змінював транспорт ASP plus від В до А за жодної досліджуваної концентрації. Контрольні клітини не показали значного пригнічення транспорту B-to-A ASP плюс будь-яким із 5-антагоністів HT3 (дані не показані).
2.5. ASP плюс внутрішньоклітинне накопичення в OCT2/MATE1-Експресія клітин MDCK після
Лікування 5-антагоністами HT3
Низькі концентрації (0,5 і 2,5 мкМ) ондансетрону призвели до 1.3-кратного збільшення внутрішньоклітинного ASP плюс накопичення в клітинах, що експресують OCT2/MATE1-, хоча різниці не було порівняно з носіями при вищих концентраціях (10 і 20 мкМ) (рис. 6). Однак у контрольних клітинах спостерігалося зниження (40 відсотків) накопичення ASP плюс при високих концентраціях ондансетрону. У клітинах OCT2/MATE1 тропісетрон і гранісетрон збільшували ASP плюс накопичення (у 1,5 і 13-раза відповідно) при найвищій концентрації (20 мкМ). При застосуванні палоносетрону або доласетрону не спостерігалося істотних змін у накопиченні ASP плюс.
3. Обговорення
OCT2 і MATE1 є ключовими транспортерами, які координують ниркову секрецію органічних катіонів. Вони мають низку спільних субстратів, включаючи метформін, цисплатин, ламівудин та ентекавір, а також деякі 5-антагоністи HT3 [15–20,24]. Попередні дослідження показали, що 5-антагоністи HT3 також можуть пригнічувати транспорт OCT2 і MATE1. Зокрема, було показано, що ондансетрон зменшує транспорт цисплатину та метформіну MATE1 [19]. Поточне дослідження мало на меті розширити цю попередню роботу, щоб порівняти п’ять антагоністів 5-HT3 щодо їхньої здатності інгібувати OCT2 і MATE1 окремо при надмірній експресії в клітинах HEK293 і при коекспресії в клітинах MDCK і вирощуванні на вставках Transwell. Ондансетрон і палоносетрон були здатні пригнічувати поглинання катіонної хімічної речовини зонда, ASP plus, клітинами HEK293, що експресують OCT2 або MATE1, особливо в таких низьких концентраціях, як 0.1–0.5 мкМ . Подібним чином, гранісетрон, тропісетрон і доласетрон також були здатні пригнічувати кожен транспортер (однак у більш високих концентраціях). Використовуючи двічі трансфіковані OCT2/MATE1 клітини MDCK, ондансетрон інгібував базолатерально-апікальну секрецію ASP плюс у всіх перевірених концентраціях (0,5–20 мкМ), що спостерігалося лише при більш високих концентраціях палоносетрону, тропісетрону та доласетрону. Ці дані, отримані з використанням флуоресцентного субстрату зонда, свідчать про можливість опосередкованої OCT{33}} і MATE1-взаємодії ліків із 5-антагоністами HT3.
Дані, отримані в подвійно трансфікованих клітинах OCT2/MATE1, значною мірою збігаються з даними HEK293, за винятком гранісетрону. Ондансетрон, палоносетрон і тропісетрон продемонстрували залежне від концентрації інгібування транспорту B-to-A ASP plus з порядком активності, що відображає інгібування MATE1 у клітинах HEK293. Дивно, що гранісетрон не виявляв жодного суттєвого інгібування в клітинах OCT2/MATE1 MDCK, навіть у концентраціях, у п’ять разів вищих за концентрацію IC50, що спостерігається в клітинах HEK293, що експресують OCT2 або MATE1. Оскільки клітини MDCK більше схожі на нативні тубулярні клітини, ніж клітини HEK293, існує ймовірність зміни розподілу гранісетрону через експресію ендогенних транспортних ортологів OCT2 або MATE1 або потенційно інших транспортерів. Наприклад, клітини MDCK високо експресують собачий транспортер P-глікопротеїну [25], що може призвести до витоку гранісетрону. Підтримкою цього припущення є той факт, що поліморфізм одного нуклеотиду в транспортері MDR1/ABCB1 людини покращив клінічну ефективність гранісетрону для лікування блювання [26]. Ці дані свідчать про те, що гранісетрон може бути субстратом для собачого Р-глікопротеїну, спричиняючи зміну внутрішньоклітинної концентрації, яка піддається дії транспортера MATE1.
Незважаючи на те, що субстрати та інгібітори транспортерів OCT і MATE значно збігаються, відмінності все ж існують. Взаємодія між ліками на основі транспортера часто може залежати від ідентичності субстрату жертви, який оцінюється, як було продемонстровано для OCT2 [27–29]. Для OCT2 вибір катіонного субстрату має як кількісний, так і якісний вплив на ступінь і тип інгібування [27,28]. Навпаки, уявна константа Міхаеліса транспортованого субстрату та значення IC50 для інгібування MATE1 на чотирьох різних субстратах були подібними [30]. Ці дані свідчать про наявність спільного сайту зв’язування для взаємодії субстратів та інгібіторів на зовнішній поверхні hMATE1. Як наслідок, взаємодія 5-антагоністів HT3 з OCT2 і MATE1 може відбуватися через різні механізми, незважаючи на їх спільну катіонну природу. Потрібні подальші дослідження для просування поточного дослідження з використанням субстрату зонда та оцінки взаємодії з конкретними субстратами ліків, такими як циметидин, метформін і цисплатин.
Крім 5-антагоністів HT3, для запобігання нудоті та блювоті також використовуються додаткові класи препаратів. У попередніх дослідженнях ми оцінили здатність інших протиблювотних препаратів пригнічувати OCT2 і MATE1-опосередкований транспорт ASP plus у клітинах HEK293. Цікаво, що оланзапін, прохлорперазин і метоклопрамід інгібували активність OCT2 у різних концентраціях (додатковий малюнок S1). Жоден із цих препаратів не інгібував активність MATE1 у концентрації 10 мкМ (дані не показані). Інші протиблювотні засоби, включаючи апрепітант і дексаметазон, не впливали на ASP і поглинання клітинами OCT2- або MATE1-, що експресують HEK293 (дані не показані). Як наслідок, інші протиблювотні препарати (оланзапін, прохлорперазин і метоклопрамід) при одночасному застосуванні з 5-антагоністами НТ3 також можуть впливати на ниркову секрецію катіонів, особливо через їхню здатність пригнічувати поглинання OCT2.
Важливо розглянути, наскільки добре моделі in vitro повторюють особливості ендогенного транспорту в людининирки. Рівні білків OCT2 і MATE1 людини були раніше кількісно визначені в подвійно трансфікованих клітинах MDCK за допомогою РХ-МС/МС (hOCT2 і hMATE1 становили 28,6 і 6,9 фмоль/мкг мембранного білка відповідно) [31]. Для порівняння, дослідження, що визначають експресію білка в корі та мембранах нирки людини, виявляють більш скромну різницю в експресії між двома транспортерами або навіть більшу експресію MATE1 (OCT2 7).4 пмоль/мг, MATE{{14 }}.1 пмоль/мг) [22] і (OCT2 5 фмоль/мкг, MATE1 10 фмоль/мг) [32]. Ці відмінності між моделями in vitro та ендогенною людською експресією OCT2 і MATE1 слід враховувати та враховувати при розробці фізіологічно заснованих фармакокінетичних моделей для потенційної катіонної взаємодії лікарських засобів у нирках.
Поточне дослідження зосереджено в основному на нирковій секреції катіонних препаратів. Однак важливо визнати, що печінка також експресує OCT1 і MATE1, які забезпечують очищення жовчю катіонних хімічних речовин. Це важливо, оскільки 5-антагоністи HT3 відрізняються своєю структурою, метаболізмом, зв’язуванням з білками та шляхами виведення. Структурно 5-антагоністи рецепторів HT3 містять основний амін, ароматичну або гетероароматичну кільцеву систему та карбоніл (або подібну структуру), який копланарний до ароматичної області (рис. 1) [33]. Слід зазначити, що структура амінної частини відрізняється для ондансетрону та включає імідазол, тоді як 6-кільця-члени включені в інші 5-антагоністи HT3. Актуальність цих структурних відмінностей у взаємодії з OCT2 та/або MATE1 потребує подальшого дослідження, але може пояснити більш значні ефекти ондансетрону при нижчих концентраціях. Крім того, деякі 5-антагоністи HT3 екстенсивно очищаютьсяниркияк вихідні речовини або метаболіти (такі як палоносетрон і тропісетрон). Багато 5-антагоністів HT3 (включаючи ондансетрон, тропісетрон, палоносетрон і гранісетрон) швидко метаболізуються (48–95 відсотків) ферментами цитохрому P450 у печінці. Нещодавні дослідження показали, що метаболіти можуть відігравати більшу роль у взаємодії між ліками, ніж вважалося раніше [34]. Подальше тестування транспорту OCT2 і MATE1 з основними метаболітами 5-антагоністів HT3, які перевищують 25 відсотків системної експозиції батьків, є виправданим. Так само в хімічному класі є препарати з коротким періодом напіввиведення (< 6="" h,="" ondansetron,="" and="" tropisetron),="" moderate="" half-lives="" (8–9="" h,="" granisetron,="" and="" dolasetron),="" and="" a="" long="" half-life="" (40="" h,="" palonosetron).="" these="" factors="" should="" be="" considered="" when="" evaluating="" potential="" drug-drug="" interactions="" using="" in="" vitro="" transporter="">
На підставі 2020 Керівництва FDA щодо метаболізму in vitro та досліджень взаємодії лікарських засобів, опосередкованих транспортерами [35], препарат має потенціал інгібувати транспортер in vivo, якщо: значення Cmax (незв’язаного)/IC50 більше або дорівнює 0,1. Виходячи з цих рекомендацій, значення MATE1 Cmax/IC50 для ондансетрону вказують на потенційну взаємодію лікарських засобів in vivo з використанням ASP plus як субстрату для дослідження. Порівняння значень IC50 для інших 5-антагоністів HT3 з їхніми значеннями Cmax (діапазон від високих наномолярних до низьких мікромолярних) не свідчить про ризик взаємодії ліків, принаймні з ASP plus як субстратом жертви. Подібним чином ми наразі не знаємо внутрішньониркових концентрацій 5-антагоністів HT3, що було б важливо для оцінки потенційної взаємодії препаратів MATE1. Існують обмежені клінічні дані про взаємодію ондансетрону з субстратами OCT/MATE. Наприклад, ондансетрон підвищує рівні креатиніну та метформіну у здорових людей через пригнічення ниркового транспортера [21,36]. Цікаво, що ондансетрон не тільки знижував нирковий кліренс метформіну, але й покращував показники толерантності до глюкози [21]. В інших клінічних дослідженнях повідомлялося, що ондансетрон посилює нефротоксичність препарату-субстрату шляхом потенційної зміни опосередкованої транспортерами секреції всерединінирка[37–39]. Разом ці дані вимагають подальшого дослідження лікарських взаємодій ондансетрону через інгібування транспортерів OCT і MATE.
Підсумовуючи, ці дані in vitro вказують на те, що багато з 5-антагоністів HT3 мають більшу ефективність щодо інгібування MATE1, підвищуючи потенціал для підвищення тубулярної концентрації катіонних препаратів. Крім того, ондансетрон був достатньо сильним, щоб збільшити внутрішньоклітинну концентрацію субстрату зонда, ASP плюс у концентраціях, близьких до клінічно значущої Cmax. Ці дані узгоджуються з попередніми дослідженнями in vivo на мишах, де спостерігалося посилення опосередкованої цисплатином нефротоксичності при одночасному введенні ондансетрону [19]. Виходячи з поточних критеріїв для оцінки клінічного потенціалу взаємодії лікарських засобів, інші 5-антагоністи НТ3, а також протиблювотні препарати, протестовані в нашому дослідженні, ймовірно, становлять менший ризик клінічно значущої взаємодії лікарських засобів через набагато нижчу терапевтичну концентрації в плазмі та вищі константи інгібування.
4. Матеріали та методи
4.1. Хімікалії
4-(4-(Диметиламіно)стирил)-N-метилпіридиній йодид (ASP plus ) було придбано в Life Technologies (Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США). Тропісетрон був придбаний у Abcam (Кембридж, Массачусетс, США). Усі інші хімікати від Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі, США).
4.2. Лінії клітин і культури клітин
Контрольні порожні вектори (EV) (трансфіковані pcDNA5-) і лінії клітин Flp-In ембріональної нирки людини (HEK)293, які стабільно експресують людські транспортери MATE1 і OCT2, були щедро надані доктором Кеті Джакоміні з Каліфорнійського університету, Сан Франциско. Клітини HEK293 культивували в середовищі Дульбекко, модифікованому Іглу (DMEM), доповненому 10 відсотками фетальної бичачої сироватки, 2 мМ L-глутаміну, 100 ОД/мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину та 200 мкг/мл гігроміцину В. Вектор (pcDNA3. 1 plus і pcDNA3.1/Hygro( plus )) і лінії клітин собачої нирки Мадіна-Дарбі (MDCK) із подвійною трансфекцією OCT2/MATE1 людини були щедро надані доктором Джоан Вонг з Університету Вашингтона, Сіетл, штат Вашингтон. Клітини MDCK зберігалися в мінімально необхідному середовищі (MEM), доповненому 10 відсотками фетальної сироватки великої рогатої худоби, 500 мкг/мл G418 і 200 мкг/мл гігроміцину B. Усі клітинні лінії культивували у зволоженому інкубаторі при 37 °C з 5 відсотками CO2.
4.3. Аналізи інгібування поглинання та витоку в клітинах HEK293
OCT2- і MATE1-клітини HEK293 із надлишковою експресією висівали в прозорі 24-планшети з полі-D-лізином (Fisher Scientific, Hanover Park, IL, USA) і вирощували протягом 24 год. приблизно до 90 відсотків конфлюенту. Після одноразового промивання попередньо підігрітим буферним сольовим розчином Хенка (HBSS) клітини попередньо інкубували протягом 30 хвилин при 37°C з різними 5-HT3 антагоністами для клітин OCT2 або в 30 мМ розчині NH4Cl у HBSS при pH 6,5 для клітин MATE1 для внутрішньоклітинних підкислення. Поглинання клітинами OCT2 було ініційовано шляхом впливу 10 мкМ флуоресцентного субстрату ASP плюс безпосередньо в інкубаційному середовищі. Поглинання клітинами MATE1 було ініційовано застосуванням HBSS при pH 7,4, що містить 5-HT3 антагоністи та 10 мкМ флуоресцентного субстрату ASP plus. Після інкубації протягом 1 хвилини при 37°C на шейкері поглинання субстрату було зупинено додаванням крижаного HBSS, що містить 500 мкМ циметидину. Середовище видаляли і чотири рази промивали крижаним HBSS. Клітини лізували 1% Triton X-100. Флуоресценцію було виявлено за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів Spectramax (Molecular Devices, Саннівейл, Каліфорнія, США) на наступних довжинах хвиль (збудження 485 нм/випромінювання 495 нм). Внутрішньоклітинну флуоресценцію нормалізували до загальної концентрації білка клітинних лізатів з кожної лунки за допомогою аналізу біцинхонінової кислоти (BCA) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Експерименти повторювали три окремі рази, з трьома-чотирма повторами в кожному експерименті.
4.4. Дослідження Transwell у клітинах MDCK-OCT2/MATE1
Control and OCT2/MATE1-expressing MDCK cells were evaluated for protein expression of OCT2 and MATE1 using SDS-PAGE and western blotting with specific primary antibodies (OCT2, sc292622 1:500 and MATE1, sc133390 1:250, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), followed by an antirabbit HRP-conjugated secondary antibody (1:1000, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) and Super Signal Western Dura Extended Duration Substrate (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Detection was performed with a FluorChem imager (ProteinSimple, Santa Clara, CA, USA). Both MDCK cell lines were seeded on 0.4 um transwell inserts (VWR, Radnor, PA, USA) at a density of 2 × 105 cells/cm2. Transport experiments were performed 3 to 5 days after seeding. The integrity of MDCK monolayers was verified by measuring transepithelial electrical resistance (TEER) >150 o*cm2 за допомогою епітеліального вольт-омметра, EVOM2 (World Precision Instruments, Sarasota, FL). Правильне формування щільних з’єднань також було підтверджено вимірюванням пасивної проникності люциферу жовтого в базолатеральному до апікального напрямку (B-to-A). Люцифер жовтий (20 мкМ) наносили на базолатеральну камеру на 1 годину, а середовище збирали з апікальної камери. Жовту флуоресценцію Люцифера зчитували при довжині хвилі збудження 430 нм і довжині хвилі випромінювання 538 нм. Середні значення пасивної проникності (Papp) становили 7 × 10-7 см/с, що відповідає літературним значенням [40].
Після одноразового промивання клітин забуференим сольовим розчином Хенка (HBSS) pH 7,4 дослідження транспорту були розпочаті після аспірації промивного буфера як з апікальної, так і з базальної камер. Клітини інкубували з 5-HT3 антагоністами в апікальній камері в HBSS pH 6.0 і 5-HT3 антагоністами з ASP plus (25 мкМ) в базолатеральній камері в HBSS pH 7,4 та інкубували при 37 oC протягом 120 хв. Для вимірювання залежного від часу міжклітинного транспорту аліквоту інкубаційного середовища (100 мкл) з апікальної камери (приймальної камери) збирали через 40, 60, 90 і 120 хвилин і замінювали рівним об’ємом свіжого буфера, що містить {{ 19}} Антагоніст HT3 або хімічна речовина позитивного контролю у вихідній концентрації. Через 120 хв середовище для обробки видаляли, а трансвелли тричі промивали крижаним HBSS. Клітини лізували 1% Triton X-100. Флуоресценцію було виявлено за допомогою Spectramax Microplate Reader на наступних довжинах хвиль (збудження 485 нм/випромінювання 495 нм). Внутрішньоклітинну флуоресценцію нормалізували до загальної концентрації білка клітинних лізатів з кожної транслунки за допомогою аналізу BCA. Експерименти проводили в трьох окремих вставках Transwell.
4.5. Статистичний аналіз
Для статистичного аналізу використовували GraphPad Prism v6 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Km і Vmax обчислювали за допомогою нелінійної регресії (рівняння кінетики ферменту Міхаеліса–Ментена, (Y=Vmax × X/(Km плюс X), придатне за методом найменших квадратів). Дані з двома змінними аналізували за допомогою двох- метод дисперсійного аналізу з подальшим одностороннім дисперсійним аналізом та/або постфактум тестом Даннетта для множинних порівнянь. Значення IC50 розраховували за допомогою нелінійної регресії за методом найменших квадратів. Відмінності вважалися статистично значущими при p <>
Додаткові матеріали:Наведені нижче матеріали доступні в Інтернеті за адресою https://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms22126439/s1.
Авторські внески:Концептуалізація, BG, MSJ, LMA; методологія, BG, XW; формальний аналіз, BG, LMA; ресурси, LMA; написання—підготовка оригіналу, BG, LMA; написання— рецензування та редагування, MSJ, LMA; адміністрування проекту, LMA; фінансування, MSJ, EAJ, LMA Усі автори прочитали та погодилися з опублікованою версією рукопису.
Фінансування:Це дослідження фінансувалося Національним інститутом загальних медичних наук (грант GM123330) і Національним інститутом наук про здоров’я навколишнього середовища (гранти ES005022, ES007148), Національним інститутом раку (гранти CA072720, CA046934, CA008748) і Національним інститутом діабету та Захворювання органів травлення та нирок (грант DK093903), компоненти Національного інституту здоров'я.
Заява інституційної ревізійної ради: не застосовується.
Заява про інформовану згоду:Не застосовується.
Заява про доступність даних:Не застосовується.
Подяки:Ми дуже цінуємо щедрі транспортні клітинні лінії HEK293 від Кеті Джакоміні та трансфіковані клітинні лінії MDCK від Джоан Ванг.
Конфлікт інтересів:Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів.
Список літератури
1. Акара, М.; Rennick, B. Двофазний ефект органічних катіонів на виведення інших органічних катіонів. J. Pharmacol. Exp. Тер. 1976, 199, 32–40. [PubMed]
2. Гологан П.Д.; Ross, CR Механізми транспорту органічних катіонів у везикулах плазматичної мембрани нирок: 1. Дослідження протитранспорту. J. Pharmacol. Exp. Тер. 1980, 215, 191–197.
3. Кінселла, JL; Холохан, П.Д.; Песа, Н. І.; Ross, CR Транспорт органічних іонів у ниркових кортикальних люмінальних і антилюмінальних мембранних везикулах. J. Pharmacol. Exp. Тер. 1979, 209, 443–450.
4. Волд, Дж.С.; Міллер, Б.Л. Інгібування витоку органічних іонів із ниркових кортикальних зрізів. Experientia 1978, 34, 630–631. [CrossRef] [PubMed]
5. Гесснер, А.; Кеніг, Дж.; Фромм, М. Ф. Клінічні аспекти взаємодій між лікарськими засобами, опосередкованими транспортерами. Clin. Pharmacol. Тер. 2019, 105, 1386–1394. [CrossRef]
6. Сміт, HS; Кокс, Л.Р.; Smith, EJ 5-Антагоністи рецепторів HT3 для лікування нудоти/блювання. Енн Паліат. Мед. 2012, 1, 115–120. [CrossRef] [PubMed]
7. Косталл, Б.; Ганнінг, SJ; Нейлор, RJ; Tyers, MB Вплив GR38032F, нового антагоніста 5-HT3-рецептора на спорожнення шлунка у морської свинки. бр. J. Pharmacol. 1987, 91, 263–264. [CrossRef]
8. Крис М.Г.; Гралла, RJ; Кларк, Р.А.; Tyson, LB Оцінка діапазону доз антагоніста серотоніну GR-C507/75 (GR38032F) при використанні як протиблювотний засіб у пацієнтів, які отримують протипухлинну хіміотерапію. Дж. Клін. Онкол. 1988, 6, 659–662. [CrossRef]
9. Трікко, AC; Блондал, Е.; Вероніка А.А.; Soobiah, C.; Вафаї, А.; Айворі, Дж.; Стріфлер, Л.; Кардозо, Р.; Рейнен, Е.; Нінчіч, В.; та ін. Порівняльна безпека та ефективність антагоністів рецепторів серотоніну у пацієнтів, які проходять хіміотерапію: систематичний огляд і мережевий мета-аналіз. BMC Med. 2016, 14, 216. [CrossRef]
10. Boelig, RC; Бартон, SJ; Сакконе, Г.; Келлі, AJ; Едвардс, SJ; Berghella, V. Втручання для лікування гіперемезису вагітних: Кокранівський систематичний огляд і мета-аналіз. Я. Матерн. Fetal Neonatal Med. 2018, 31, 2492–2505. [CrossRef]
11. Хаке, Н.; Накві, Р.М.; Dasgupta, M. Ефективність ондансетрону в профілактиці або лікуванні післяопераційного делірію - систематичний огляд. може геріатр. J. 2019, 22, 1–6. [CrossRef] [PubMed]
12. Макпарлін К.; О'Доннелл, А.; Робсон, SC; Бейєр, Ф.; Молоні, Е.; Браянт, А.; Бредлі, Дж.; Мюрхед, CR; Нельсон-Пірсі, К.; Ньюбері-Бірч, Д.; та ін. Лікування Hyperemesis Gravidarum і нудоти та блювання під час вагітності: систематичний огляд. JAMA 2016, 316, 1392–1401. [CrossRef] [PubMed]
13. Ван, В.; Чжоу, Л.; Sun, L. Ондансетрон для нейраксіального морфін-індукованого свербежу: мета-аналіз рандомізованих контрольованих досліджень. Дж. Клін. фарм. Тер. 2017, 42, 383–393. [CrossRef]
14. Йокой, А.; Міхара, Т.; Ка, К.; Goto, T. Порівняльна ефективність рамосетрону та ондансетрону в запобіганні післяопераційної нудоти та блювання: оновлений систематичний огляд і мета-аналіз із пробним послідовним аналізом. PLoS ONE 2017, 12, e0186006. [CrossRef]
15. Морзе, Б. Л.; Колур, А.; Хадсон, Л.Р.; Хоган, AT; Чен, Л.Г.; Бракман, Р.М.; Савада, Джорджія; Феллон, Дж.К.; Сміт, ПК; Хіллгрен, К. М. Фармакокінетика субстратів переносника органічних катіонів 1 (OCT1) у нокаутних мишей Oct1/2 і видова різниця в печінковому OCT1-опосередкованому поглинанні. Препарат Метаб. Dispos. 2020, 48, 93–105. [CrossRef] [PubMed]
16. Цвєтков М.В.; Саадатманд, Арканзас; Бокельманн, К.; Майнеке, І.; Кайзер, Р.; Brockmoller, J. Вплив поліморфізмів OCT1 на клітинне поглинання, концентрацію в плазмі та ефективність антагоністів 5-HT(3) тропісетрону та ондансетрону. Фармакогеноміка. J. 2012, 12, 22–29. [CrossRef] [PubMed]
17. Чжу, П.; Є, З.; Го, Д.; Сюн, З.; Хуанг, С.; Го, Дж.; Чжан, В.; Поллі, JE; Чжоу, Х.; Лі, К.; та ін. Іринотекан змінює диспозицію морфіну через інгібування транспортера органічних катіонів 1 (OCT1) і 2 (OCT2). фарм. рез. 2018, 35, 243. [CrossRef]
18. Кідо, Ю.; Матссон, П.; Джакоміні, К. М. Профілювання бібліотеки ліків, що відпускаються за рецептом, для потенційної ниркової взаємодії між ліками, опосередкованої транспортером органічних катіонів 2. J. Med. Chem. 2011, 54, 4548–4558. [CrossRef] [PubMed]
19. Лі, К.; Го, Д.; Донг, З.; Чжан, В.; Чжан, Л.; Хуанг, С.М.; Поллі, JE; Shu, Y. Ондансетрон може посилити нефротоксичність, спричинену цисплатином, шляхом інгібування багатьох токсинів і екструзійних білків (MATE). Токсикол. апл. Pharmacol. 2013, 273, 100–109. [CrossRef]
20. Віттвер, М.Б.; Зур, А.А.; Хурі, Н.; Кідо, Ю.; Косака, А.; Чжан, X.; Моріссі, К.М.; Салі, А.; Хуан, Ю.; Джакоміні, К. М. Відкриття потужних, селективних інгібіторів транспортера 1 (MATE1, SLC47A1), що відпускаються за рецептом, і інгібіторів екструзії токсинів шляхом визначення профілю ліків, що відпускаються за рецептом, і комп’ютерного моделювання. J. Med. Chem. 2013, 56, 781–795. [CrossRef] [PubMed]