In vitro та in vivo метаболізм екстракту Cistanche Tubulosa у нормальних та хронічних непередбачуваних стрес-індукованих депресивних щурів

Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Ян Лі та ін

АНОТАЦІЯ

Було нещодавно підтверджено, що Cistanche tubulosa, один з видів Cistanches Herba, має антидепресивну ефективність у щурів із хронічним непередбачуваним стресом (CUS), відновлюючи гомеостаз кишкової мікробіоти. У цій статті ми прагнемо дослідити метаболічний профіль C. tubulosa у нормальних та індукованих CUS депресивних щурів in vitro та in vivo. Використовуючи UPLC-Q-TOF-MS, in vitro шлунково-кишковий метаболізмЕкстракт цистанхи трубчастої(CTE) оцінювали як у нормальних, так і у CUS-щурів. У той же час in vivo метаболізм КТР(екстракт цистанхи трубчастої)у нормальних і депресивних щурів також досліджували сечу та фекалії щурів. Загалом 20 та 26 метаболітів були охарактеризовані з метаболізму in vitro та in vivo у нормальних щурів та CUS відповідно. CTE(екстракт цистанхи трубчастої)метаболізувався до агліконів та продуктів розпаду фенілетаноїдних глікозидів (PhGs) та іридоїдних глікозидів за допомогою нормальної або пригніченої мікробіоти кишечника щурів in vitro. Метаболіти II фази агліконів і продукти розпаду PhG та іридоїдних глікозидів були основними метаболітами в сечі та калі щурів. Крім того, метаболічна здатність генерувати вторинні глікозиди та аглікони в депресивній кишковій мікробіоті щурів була набагато слабшою, ніж у нормальній кишковій мікробіоті щурів, що було пов’язано з невпорядкованими глікозид-гідролазами, що виробляються кишковою мікробіотою у щурів з CUS-депресією. Результати цього дослідження заклали основу для розуміння метаболічного процесу та терапевтичного механізму антидепресивної властивості CTE.

Ключові слова: Цистанка трубчаста, ДепресіяМетаболізм, In vitro, In vivo, Кишкова мікробіота

1. Введення

Cistanches Herba офіційно зареєстровано як висушені соковиті стебла Cistanche deserticola (YC Ma) і C. tubulosa (Schrenk), які використовуються для лікування ниркової недостатності, імпотенції, жіночого безпліддя, хворобливої ​​лейкореї, профузної метрорагії та старечого запору [1]. Сучасні фармакологічні дослідження показали, що Cistanches Herba має різні біологічні дії, такі як антинейродегенераційна, імунорегуляційна та протизапальна [2,3]. Наші попередні розслідування це підтвердилиЕкстракт цистанхи трубчастої(CTE), які складаються з 48,6 відсотка фенілетаноїдних глікозидів (PhG), 6,9 відсотка іридоїдних глікозидів і 20.0 відсотка загальної кількості сахаридів, можуть помітно полегшити депресивні симптоми хронічного непередбачуваного стресу (CUS), викликаного депресивними щурами. відновлення гомеостазу кишкової мікробіоти [4]. Останні дослідження показують, що зміни в складі мікробіоти кишечника були пов’язані з розвитком і прогресуванням депресії [5,6]. Відносна кількість мікробних родів була помітно порушена у щурів із депресивною моделлю CUS порівняно з нормальною контрольною групою [7]. У пацієнтів з депресією різноманітність і багатство кишкової мікробіоти також суттєво змінено [8]. Крім того, різні сполуки, включаючи фенілетаноїдні глікозиди (PhGs) та іридоїдні глікозиди, вважалися основними складовими Cistanches Herba [2,3], які легко метаболізувалися у вторинні глікозиди та аглікони, включаючи гідрокситирозол (HT), 3,4-дигідроксифенетил глікозид, деглікозильована геніпозидова кислота тощо кишковою мікробіотою людини. Ці метаболіти легше всмоктуються через кишечник і проявляють біологічну активність, що відповідає компоненту прототипу [9–11]. Таким чином, ми вважаємо, що під час виникнення та розвитку депресії порушення структури кишкової мікрофлори неминуче вплине на метаболізм пероральних традиційних китайських ліків (ТКМ) у шлунково-кишковому тракті, крім впливу на фізіологічний стан організму. Більшість існуючих метаболічних даних Cistanches Herba походять з метаболічних досліджень на здорових тваринах [12–15]. Тому було б більш клінічно значущим досліджувати метаболічний профіль КТР(екстракт цистанхи трубчастої)у патологічному стані для з’ясування його біоактивних компонентів і розуміння механізму дії для його антидепресивної ефективності.

У поточному дослідженні ми прагнемо охарактеризувати метаболічні профілі CTE(екстракт цистанхи трубчастої)як на здорових, так і на модельних щурах з депресією, викликаною CUS, за допомогою надпродуктивної рідинної хроматографії квадрупольної часпролітної мас-спектрометрії (UPLC-Q-TOF-MS). Шлунковий сік, кишкова рідина та мікробіота нормальних і депресивних патологічних щурів були використані для моделювання метаболічного процесу CTE(екстракт цистанхи трубчастої)в шлунково-кишковому тракті in vitro,незалежно і послідовно. Метаболіти in vivo також з’ясовуються після перорального введення CTE(екстракт цистанхи трубчастої)у нормальних і CUS щурів. Це дослідження дає нові знання про метаболізм і активні метаболіти CTE(екстракт цистанхи трубчастої)для депресії.

2. Матеріал і методи

2.1. матеріал

Висушені стебла C. tubulosa були зібрані з округу Хетянь (Сіньцзян, Китай). Зразки ваучерів були засвідчені професором Сяобо Лі та збережені в гербарії Школи фармації Шанхайського університету Цзяо Тонг (Шанхай, Китай). Використовували метод екстракції, як зазначено в нашій попередній публікації [4]. TheЕкстракт цистанхи трубчастої(CTE) зразки зберігалися при 4 градусах і повторно розчинялися стерильною водою перед використанням. Стерильні водні розчини КТР(екстракт цистанхи трубчастої)Потім зразки фільтрували через мембрану 0.22 мкм, а фільтрати збирали в стерильні пробірки.

Ехінакозид був наданий лабораторією доктора Пенфей Ту Пекінського університету (Пекін, Китай). Актеозид, ізоактеозид, 2'-ацетилактеозид і цистанозид А були придбані у Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (Ченду, Китай). Гідрокситирозол, кавова кислота, 3,4-дигідроксибензолпропіонова кислота, 3-гідроксифенілпропіонова кислота та 3-фенілпропіонова кислота були придбані в Aladdin IndustrialInc. (Шанхай, Китай). Чистота кожного компонента була визначена як > 95 відсотків за допомогою ВЕРХ-УФ. Ацетонітрил класу ВЕРХ був придбаний у Merck (Дармштадт, Німеччина). Деіонізовану воду готували з дистильованої води за допомогою системи очищення води Milli-Q (Millipore, Бедфорд, Массачусетс, США). Усі інші використані реагенти та хімікати мали аналітичну якість.

2.2. Досліди на тваринах

Самці щурів Sprague-Dawley (200 ± 20 г) були отримані від Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Пекін, Китай) і розміщені в Центрі лабораторних тварин Шанхайського університету JiaoTong (Шанхай, Китай). Тварин утримували в групі при контрольованій кімнатній температурі (25 ± 2 градуси, 55 ± 10 відсотків відносної вологості) з циклом світло-темрява 12:12 годин. Щурам надавали вільний доступ до звичайної їжі лабораторних щурів і води протягом 1 тижня. Приміщення для тварин і протоколи були схвалені Комітетом з етики тварин Шанхайського університету Цзяо Тонг (Шанхай, Китай).

Після однотижневої акліматизації дванадцять неактивних щурів були випадковим чином розділені на дві групи (n=6), контрольну групу та групу хронічного непередбачуваного стресу (CUS). Щури CUS були розроблені, як у нашому попередньому звіті [4], які були піддані різноманітним стресовим факторам: білий шум (100 дБ) протягом 1 години, нічне стробоскопічне освітлення низької інтенсивності (120 спалахів/хв), позбавлення води протягом 24 годин, порожній пляшки з водою протягом 1 години (після позбавлення води), позбавлення їжі протягом 24 годин, фізичне обмеження (1-2 години), примусове плавання (5 хвилин), забруднена клітка протягом 24 годин (200 мл води в 100 г підстилки з тирси), ущипування хвоста ( 1 хвилина), шок протягом 30 хвилин, нахил клітки на 45 градусів протягом 24 годин і нічне освітлення (12 годин). Стресори застосовувалися безперервно та випадково протягом 4 тижнів, детальна схема описана в таблиці S1. Після 4 тижнів стресу тест на сахарозу, тест у відкритому полі та тест із пригніченням годування були проведені, як описано раніше [4]. Схема CUS і поведінковий тест показані на рис. S1. Після поведінкових тестів від кожного щура було отримано щонайменше 4 гранули калу та поміщено в стерильні конічні пробірки для аналізу КТР in vitro(екстракт цистанхи трубчастої)метаболізм.

2.3. Шлунково-кишковий метаболізм CTE(екстракт цистанхи трубчастої)нормальними та CUS щурами in vitro

2.3.1. Метаболізм КТР(екстракт цистанхи трубчастої)в імітованих шлункових і кишкових соках

П'ятдесят міліграм КТР(екстракт цистанхи трубчастої)додавали до 10 мл імітованого шлункового та кишкового соку відповідно. Потім CTE(екстракт цистанхи трубчастої)інкубували при 37 градусах протягом 4 годин у шлунковому соку та 6 годин у кишковому соку. Культивовану суміш (1 мл) гасили 3 мл насиченого водою н-бутанолу негайно в 0 і 4 години в шлунковому соку та в 0 і 6 годин в кишковому соку. Метод обробки зразка був таким, як описано раніше [9].

2.3.2. Метаболізм КТР(екстракт цистанхи трубчастої)за нормальною та CUS кишковою мікробіотою щурів

Свіжі нормальні та CUS зразки фекалій щурів спочатку змішували та гомогенізували з 25-кратним об’ємом бульйону GAM. Осад видаляли фільтруванням через три шматки марлі. Потім суспензію інкубували при 37 градусах в анаеробному інкубаторі, в якому повітря було замінено газовою сумішшю (H2 5 відсотків, CO2 10 відсотків, N2 85 відсотків). П'ятдесят міліграмів CTE додавали окремо до 5 мл нормальної суспензії фекалій щурів і CUS, і суспензію інкубували при 37 градусах протягом 48 годин. Культивовану суміш видаляли та екстрагували насиченим водою н-бутанолом через 0, 12, 24 та 48 год. Метод обробки зразка був описаний раніше [9].

2.3.3. Послідовний метаболізм КТР(екстракт цистанхи трубчастої)за допомогою шлункового соку, кишкового соку, нормальної та CUS мікробіоти кишечника щурів

По-перше, 100 мг КТР(екстракт цистанхи трубчастої)додавали до 1{{10}} мл імітованого шлункового соку та інкубували при 37 градусах протягом 4 годин. Всю реакцію гасили 3-кратним об’ємом водонасиченого н-бутанолу та центрифугували при 3000 об/хв протягом 15 хв з подальшим випаровуванням супернатанту під струменем азоту. газ при 37 градусах. По-друге, залишок повторно розчиняли в 0,4 мл стерильної води, додавали до 8 мл імітованого кишкового соку та інкубували при 37 градусах протягом 6 годин. Таким же чином готували пробу з шлунковим соком. Нарешті, залишок повторно розчиняли в 0,3 мл стерильної води, додавали до 6 мл суспензій фекалій щурів нормальних і CUS відповідно та інкубували при 37 градусах протягом 48 годин в анаеробінкубаторі. Один мілілітр реакції гасили 3 мл насиченого водою н-бутанолу відразу через 0 і 4 год у шлунковому соку, через 0 і 6 год у кишковому соку та через 0, 12, 24 і 48 год у кишковій мікробіоті щурів. . Зразок обробляли ідентично CTE(екстракт цистанхи трубчастої)в симульованому шлунковому соку.

2.4. Метаболізм КТР(екстракт цистанхи трубчастої)нормальними та CUS щурами in vivo

Потім кожного щура в двох групах помістили в індивідуальну метаболічну клітку. Після нічного голодування, яке дозволяло лише вільний доступ до води, усім щурам перорально вводили 2 мл води через шлунковий зонд. Порожні зразки сечі та фекалій збирали у всіх щурів від 0 год до 12 год. Далі КТР(екстракт цистанхи трубчастої)(400 мг/кг) вводили через зонд. Зразки сечі та фекалій збирали з 0 до 24 годин. Усі зразки сечі та фекалій негайно зберігали при температурі -80 градусів.

Зразки сечі та фекалій нормальних щурів і щурів CUS попередньо обробляли, як описано раніше [12]. Усі отримані зразки аналізували методом UPLC-Q-TOF-MS.

2.5. Аналітичний метод

UPLC проводили на системі Waters ACQUITY UPLC (WatersCorp., Мілфорд, Массачусетс, США) з колонкою ACQUITY UPLC BEH C18 (100 мм × 2,1 мм внутрішній діаметр, 1,7 мкм, Waters Corp. , США) шляхом градієнтного елюювання з використанням {{10}}.1% ацетонітрилу мурашиної кислоти (A) та 0.1% мурашиної кислоти у воді (B) зі швидкістю потоку 0,4 мл/хв. . Профіль градієнта становив: 0–5 хв (A: 5–20 відсотків), 5–7,5 хвилин (A: 20–30 відсотків), 7,5–10 хвилин (A: 30–70 відсотків), 10–11 хвилин (A : 70–100 відсотків) і витримували 1,5 хв. Градієнт повертали до 5 відсотків за 0,5 хв і витримували протягом 2,5 хв для наступного циклу. Об'єм ін'єкції становив 3 мкл. Температуру колонної печі було встановлено на 35 градусів.

Мас-спектрометрію проводили за допомогою мас-спектрометра Waters Vion IMS (Waters Corp., Milford, MA, USA). Іонізацію проводили в режимі негативного електророзпилення (ESI−). Параметри МС були такими: капілярна напруга, −2.0 кВ; напруга конуса, 20 В; температура джерела, 120 градусів; температура десольватації, 500 град.; витрати газу конусної та десольватації 50 та 1000 л/год відповідно. Для точного вимірювання маси лейцин-енкефалін використовувався як маса блокування для генерації іона [M–H]− (m/z 554,2615). Експеримент MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) у двох функціях сканування проводився наступним чином: функція 1 (низька енергія): m/z 50–1000, час сканування 0,25 с, затримка між скануванням 0,02 с, енергія зіткнення 6 еВ; функція 2 (висока енергія): m/z50–1000, час сканування 0,25 с, затримка між скануванням 0,02 с, зміна енергії зіткнення 20–45 еВ.

2.6. Обробка даних

Дані були оброблені за допомогою програмного забезпечення UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Мілфорд, Массачусетс, США) для ідентифікації метаболітів у точних масових необроблених даних повного сканування, зібраних через MSE. Сполуки були ідентифіковані на основі точної маси, фрагментів у високоенергетичній мас-спектрометрії. Поріг інтенсивності було встановлено як 100,0 відліків. Ідентифікація цілі, допуск на збіг фрагментів та інші параметри були встановлені автоматично.

3. Результати

3.1. Зміни поведінки у щурів з депресією, викликаною CUS

Щурів із депресивними симптомами, спричиненими CUS, оцінювали за допомогою поведінкових тестів, включаючи тест на перевагу сахарози, тест у відкритому полі та тест із пригніченням годування. Т-критерій Стьюдента показав, що перевага сахарози в тесті на перевагу сахарози (p < 0,001),="" загальна="" відстань,="" пройдена="" в="" тесті="" відкритого="" поля="" (p="">< 0,001),="" і="" затримка="" їжі="" в="" тесті="" з="" придушенням="" новизни="" (p="">< 0,01)="" були="" суттєвими.="" відрізняється="" від="" контрольної="" групи="" після="" 4-тижневого="" лікування="" cus="" (рис.="" 1).="" ці="" результати="" показали,="" що="" модель="" хронічного="" непередбачуваного="" стресу="" була="" успішно="">

3.2. Характеристика хімічних складових КТР(екстракт цистанхи трубчастої)

Комплексний аналіз прототипних складових КТР(екстракт цистанхи трубчастої)було проведено за допомогою UPLC-Q-TOF-MS. Загалом 27 складових від КТР(екстракт цистанхи трубчастої)були виявлені та попередньо охарактеризовані, включаючи 20 PhG, 5 іридоїдів та іридоїдних глікозидів та 2 олігосахариди. Детальна інформація, зокрема час утримування, точна МС та іони фрагментів МС/МС, наведена в Додатковій інформації (Таблиця S2), щоб отримати уявлення про структуру цих хімічних складових. UPLC-Q-TOF-MS загальна іонохроматограма (TIC) CTE була показана на рис. S2.

3.3. Шлунково-кишковий метаболізм CTE(екстракт цистанхи трубчастої)нормальними та CUS щурами in vitro

У цьому дослідженні потенційні метаболіти CTE(екстракт цистанхи трубчастої)нормальними та CUS-щурами in vitro були виявлені з TIC та ідентифіковані за допомогою комбінації елементного складу та мас-спектрів фрагментів MS/MS після порівняння їх із контрольними зразками. Усі метаболіти з CTE(екстракт цистанхи трубчастої)у змодельованих шлункових і кишкових соках нормальна кишкова мікробіота щурів і CUS наведена в таблиці 1.

3.3.1. Метаболізм КТР(екстракт цистанхи трубчастої)в імітованих шлункових і кишкових соках

Сім метаболітів CTE(екстракт цистанхи трубчастої)у моделюваному шлунковому соку були попередньо ідентифіковані за точною інформацією про масу та MSE фрагментів: M1 (m/z315,1074, C14H20O8, 1,66 хв), M4 (m/z 459,1501, C20H28O12, 2,36 хв), M5 (m/z 445,1715, C20H30O11, 2,60 хв), M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 хв), M12 (m/z 785,2481, C35H46O20, 4,77 хв), M16 (m/z 827,2580, C37H48O21, 5,73 хв) і M18 (m/z 623 .1968, C29H36O15, 5,81 хв). Деглікозилювання, дегідроксилювання, дегідрування та ізомеризація вважалися основними метаболічними шляхами КТР у шлунковому соку. Було виявлено, що M4 і M5 мають молекулярну масу на 2 та 16 Да нижчу, ніж їхній прототипний компонент, декафеоїлактеозид, і, таким чином, визначені як його дегідроговані та дегідроксильовані продукти відповідно. M12 було ідентифіковано як ізомер ехінакозиду, який утворює ті самі іони, що й ехінакозид при m/z 623,2178, 477,1601, 315,1055, 161,0237.

Такі ж метаболіти були виявлені після КТР(екстракт цистанхи трубчастої)інкубація в кишковому соку. Слід зазначити, що кофеїльна група в положенні C-6′ у PhGs легко метаболізується травними ферментами в кишковому соку з утворенням декафеїлових метаболітів і кавової кислоти.

3.3.2. Метаболізм КТР(екстракт цистанхи трубчастої)за нормальною та CUS кишковою мікробіотою щурів

Загалом 20 метаболітів біотрансформовано з CTE(екстракт цистанхи трубчастої)у нормі кишкова мікробіота була виявлена ​​та ідентифікована (рис. 2). За результатами було виявлено, що PhG розкладаються до агліконгідрокситирозолу (HT) M2 (m/z 153,0550, C8H10O3, 1,78 хв) і кавової кислоти (CA) M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 хв), а потім вони далі метаболізувалися до M3 (m/z 163,0390, C9H8O3, 2,02 хв), M6 (m/z 181,0501, C9H10O4, 2,76 хв), M10 (m/z 195,0655, C10H12O4, 4,35 хв) і M11 (m/z 165,0552) , C9H10O3, 4,36 хв) шляхом дегідроксилювання, відновлення та метилювання. Крім того, центральними метаболічними шляхами, які продукують прямі метаболіти сполук-прототипів PhG з CTE у нормальній кишковій мікробіоті щурів, є відновлення, метоксилування, деглікозилювання, декафеоїл, дегідрування та ізомеризація.

Після інкубації в CUS-індукованій депресії кишкової мікробіоти щурів, CTE(екстракт цистанхи трубчастої)перетворювався на 20 метаболітів за допомогою тих самих метаболічних шляхів, що й звичайні щури.

3.3.3. Послідовний метаболізм CTE шлунковим соком, кишковим соком, нормальною та CUS кишковою мікробіотою щурів

Після послідовної інкубації в шлунковому соку, кишковому соку, нормальній та CUS кишковій мікробіоті щурів, CTE(екстракт цистанхи трубчастої)метаболізувався до 14 метаболітів (включаючи 8 з шлунковим соком, 7 з кишковим соком, 11 з нормальною та 10 з мікробіотою кишечника щурів CUS). Серед них M2(HT) і M11 (3-гідроксифенілпропіонова кислота, 3-HPP) були кінцевими метаболітами PhG після послідовної інкубації CTE(екстракт цистанхи трубчастої)у шлунковому соку, кишковому соку та кишковій мікробіоті. Не було суттєвої різниці в метаболітах між нормальними та CUS щурами.

M8, M9, M14, M17, M19 і M20 були виявлені лише в незалежному метаболізмі CTE нормальною та CUS кишковою мікробіотою щурів. Ці метаболіти були в основному метаболічними проміжними продуктами, які повністю метаболізувалися до кінцевих метаболітів у дослідженні послідовного метаболізму CTE, і тому їх важко виявити.

3.3.4. Відмінності між швидкістю метаболізму CTE нормальною та CUS ратинтестинальної мікробіоти

Щоб з'ясувати відмінності між швидкістю метаболізму КТР(екстракт цистанхи трубчастої)за нормальною та CUS кишковою мікробіотою щурів окремо та послідовно визначали відносний вміст 27 прототипних сполук та 20 метаболітів після інкубації з шлунковим соком, кишковим соком, нормальною та CUS кишковою мікробіотою щурів (таблиці S3 та S4). Результати показали, що хоча суттєвих відмінностей між CTE не було(екстракт цистанхи трубчастої)метаболітів нормальних і депресивних щурів спостерігалася значна різниця в їх метаболічних швидкостях. Наприклад, C2 і C5 були ідентифіковані як 8-епілоганова кислота або її ізомер. Вони повністю метаболізувалися в нормальних зразках протягом 12 годин інкубації. Однак у патологічно пригніченій кишковій мікробіоті щурів вони повністю метаболізувалися після 48 годин інкубації. Було очевидно, що швидкість метаболізму у нормального щура була швидшою, ніж у щура CUS. Подібні результати були виявлені для С18 (ізоактеозид). Крім того, слід зазначити, що площа піку M12 (ізомеризація ехінакозиду) та M16 (ізомеризація тубулозиду A) у нормальних зразках була набагато більшою, ніж у зразках CUS, що вказує на реакцію ізомеризації CTE.(екстракт цистанхи трубчастої)був більш поширеним у нормальної кишкової мікробіоти щурів, ніж у депресивної кишкової мікробіоти щурів.

3.4. Метаболізм CTE нормальними та CUS щурами in vivo

Порівнюючи біологічні зразки групи, обробленої CTE, з пустими біологічними зразками, загалом 26 метаболітів (сполука 1–26) CTE(екстракт цистанхи трубчастої)ненормальних та CUS щурів виявлено (табл. 2). Типові UPLC хроматограми нормальних і CUS зразків сечі щурів представлені на рис. 3.

3.4.1. Характеристика метаболітів CTE у нормальному та CUS ратурині

Всього 18 in vivo метаболітів CTE(екстракт цистанхи трубчастої)у нормальних зразках сечі щурів були попередньо ідентифіковані. Метаболіти деградації PhG, включаючи HT і CA, і їх подальше сульфатування (сполука 1, 2, 3, 5, 8 і 16), метилювання (6, 21, 22 і 24) і метоксилування (13 і 14) були метаболітами. основні метаболіти в нормальній сечі щурів. Іридоїдні глікозиди легко метаболізуються до агліконів (23, 25 і 26) шляхом деглікозилювання. Слід зазначити, що жодного прототипного компонента не було виявлено в нормальному зразку сечі щура.

У зразку сечі депресивного щура виявлено 22 метаболіти КТР(екстракт цистанхи трубчастої)були виявлені та охарактеризовані. Один прототип сполуки, 8-епілоганова кислота, була виявлена ​​в патологічній сечі щура. Інші метаболіти відповідали тим, що були знайдені в нормальній сечі щурів, включаючи сульфатовані метаболіти (1, 2, 3, 8, 10 і 16), метильовані метаболіти (6, 11, 19 і 22), метоксиловані метаболіти (13 і 14). HT і CA, а також теаглікони іридоїдних глікозидів (25 і 26).

3.4.2. Характеристика метаболітів КТР(екстракт цистанхи трубчастої)у нормальному та CUS ratfeces

У цьому дослідженні лише один метаболіт (сполука 20, 3-HPP) CTE(екстракт цистанхи трубчастої)був ідентифікований у нормальному калі щурів. Більшість PhG спочатку розщеплюються до CA, а потім метаболізуються до основного мікробного метаболіту 3-HPP. У зразку фекалій щура CUS було попередньо охарактеризовано 3 метаболіти, включаючи сульфатований 3-HPP (сполука 16) і сульфатований HT (сполуки 2 і 3).

3.4.3. Відмінності між in vivo метаболітами CTE у нормальних і CUS щурів

Після перорального прийому КТР(екстракт цистанхи трубчастої), метаболіти in vivo показали очевидні відмінності у здорових і депресивних модельних щурів. 21 метаболіт (сполука 1–3, 5, 6, 8–14, 16, 17 та 19–26) було виявлено як у зразках здорових, так і у щурів CUS. Сполука 23 (деглікозильована геніпозидова кислота) була ідентифікована лише у зразках здорових щурів, тоді як сполуки 4 (НТ), 7 (8-епілоганова кислота), 15 (3, 4-дигідроксибензолпропіонова кислота) і 18 ({{ 19}}HPP глюкуронідна кон’югація) були виявлені лише у зразках щурів моделі CUS. Підводячи підсумок, компоненти прототипу були виявлені лише у щурів CUS, тоді як у нормальних щурів було виявлено більше метаболітів фази II.

4. Обговорення

У цьому дослідженні три моделі інкубації in vitro, включаючи шлунковий сік, кишковий сік, нормальну та CUS кишкову мікробіоту щурів, використовувалися незалежно та послідовно для дослідження шлунково-кишкового метаболічного профілю CTE(екстракт цистанхи трубчастої)в пробірці. Встановлено, що PhG та іридоїдні глікозиди при КТР(екстракт цистанхи трубчастої)легко метаболізувалися до своїх вторинних глікозидів і агліконів за допомогою CUS-індукованої депресивної кишкової мікробіоти щурів. Після цього прижиттєвий метаболізм КТР(екстракт цистанхи трубчастої)у нормальних і CUS щурів також було перевірено. Запропоновані метаболічні шляхи для КТР(екстракт цистанхи трубчастої)у здорових щурів із депресією, спричиненою CUS, показано на рис. 4. PhG, такі як ехінакозид і актеозид, метаболізувалися до HT і CA, а CA зазнала подальшого метаболізму до свого основного мікробного метаболіту 3-HPP. Потім HT, CA і 3-HPP метаболізувалися до сульфатованих, метильованих і метоксилованих метаболітів. Іридоїдні глікозиди, включаючи геніпозидову кислоту, канканозид A і канканозид N, метаболізувалися до своїх агліконів шляхом деглікозилювання. Це також продемонструвало, що PhG та іридоїдні глікозиди в CTE(екстракт цистанхи трубчастої)легко метаболізувалися до вторинних глікозидів і агліконів у щурів CUS. Ці метаболіти зазвичай виявляють кращу кишкову абсорбцію та біодоступність для подальшого всмоктування в кров для прояву біологічної активності [16–18]. Варто зазначити, що ізомеризація була поширеною для PhGs у шлунково-кишковому тракті, відповідні метаболіти були ідентифіковані після порівняння з часом утримування UPLC їхніх прототипних сполук на основі неоптимізованого ідеального профілю градієнта UPLC.

Кофеїнова кислота була первинним продуктом деградації CTE(екстракт цистанхи трубчастої)депресивною патологічною кишковою мікробіотою щура. У попередніх публікаціях повідомлялося, що кавова кислота викликає антидепресивний ефект у тесті на примусове плавання на мишах. Рівень мРНК нейротрофічного фактора головного мозку (BDNF) у фронтальній корі головного мозку та рівень мРНК TrkB у мигдалеподібному тілі значно знизився після тесту на примусове плавання, і перше зниження було значно інгібовано кавовою кислотою [19]. Гідрокситирозол був агліконом PhGs, який захищає нейрогенез і когнітивні функції, запобігаючи спричиненому стресом зниженню регуляції нервового білка BDNF [20]. Таким чином, необхідно приділяти більше уваги деяким біоактивним метаболітам (тобто HT і CA), які трансформуються кишковою мікробіотою після перорального прийому.

Крім того, ці результати свідчать про те, що в депресивної кишкової мікробіоти метаболічна здатність генерувати вторинні глікозиди та аглікони була помітно слабшою, ніж у нормальної кишкової мікробіоти щурів. Причиною, ймовірно, є спричинені депресією структурні зміни кишкової мікробіоти, що призводить до зниження активності метаболічних ферментів, що виробляються кишковою мікробіотою [21]. Цікаво, що попереднє дослідження показало, що тип Bacteroidetes кодує найпоширеніші гени глікозид-гідролази та полісахарид-ліази для гідролізу глікозидів і розщеплення складних вуглеводів за механізмом елімінації [22]. Зокрема, Bacteroides spp. в тому числі B. caccae, B. dorei, B. finegoldii, B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis таB. xylanisolvens показали домінуючу загальну кількість генів, що кодують GHs і PLs. Parabacteroides distasonis також має такі ж характеристики [22]. Наші попередні дослідження підтвердили, що 28-денна хронічна непередбачувана стресова стимуляція зменшила відносну чисельність родів Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas і Weissella, тоді як збільшила Ruminococcus і Deinococcus у щурів [4]. Слід зазначити, що Bacteroides і Parabacteroides були двома найпоширенішими мікробними таксонами, на які припадало приблизно 20 відсотків відносної кількості у нормальних щурів. Після лікування CUS відносна кількість Bacteroides і Parabacteroides різко знизилася приблизно до 5 відсотків у модельних щурів з депресією. Таким чином, це неминуче призведе до зниження загальної кількості ферментів GH і PL у щурів CUS і додатково порушить реакцію деглікозильованого CUS, що пригнічує мікробіоту кишечника після перорального введення CTE(екстракт цистанхи трубчастої)у модельних щурів.

5. Висновок

У цьому дослідженні було створено та застосовано метод UPLC-Q-TOF-MS для скринінгу та ідентифікації метаболітівЕкстракт цистанхи трубчастоїу нормальних та CUS депресивних щурів in vitro та in vivo. Результати показали, що КТР(екстракт цистанхи трубчастої)метаболізувався до агліконів і продуктів розпаду PhG та іридоїдних глікозидів як здоровою, так і пригніченою кишковою мікробіотою. Після перорального прийому КТР(екстракт цистанхи трубчастої), метаболіти ІІ фази агліконів і продукти розпаду ФГ та іридоїдглікозидів були переважно виявлені в сечі щурів. Метаболічна здатність генерувати вторинні глікозиди та аглікони в депресивній кишковій мікробіоті щурів була набагато слабшою, ніж у нормальній кишковій мікробіоті щурів, що було пов’язано з невпорядкованими глікозидгідролазами, що виробляються кишковою мікробіотою у щурів з депресією CUS. Це дослідження відкриває нову перспективу для пізніх розвиток КТР(екстракт цистанхи трубчастої)як потенційний антидепресант.

Подяки

Ця робота була підтримана грантами Національної ключової програми досліджень і розвитку Китаю (2017YFC1702400).

Додаток А. Додаткові дані

Додаткові дані до цієї статті можна знайти в Інтернеті за адресою HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

З: «Метаболізм in vitro та in vivoЕкстракт цистанхи трубчастоїу нормальних і хронічних непередбачуваних депресивних щурів, спричинених стресомЯн Лі та ін

--Журнал хроматографії B 1125 (2019) 121728

Список літератури

[1] Комісія китайської фармакопеї, Фармакопея Китайської Народної Республіки, видання 2015 р., China Medical Science Press, Пекін, Китай, 2015 р., стор. 135 Частина І.
[2] Ю. Цзян, П.-Ф. Tu, Аналіз хімічних складових у видах Cistanche, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: огляд його хімії, фармакології та фармакокінетики, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, Антидепресант-подібні ефектиЕкстракт цистанхи трубчастоїна щурах хронічного непередбачуваного стресу шляхом відновлення гомеостазу кишкової мікробіоти, Front. Pharmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] Дж. А. Фостер, М. В. Нойфельд, Вісь кишечник-мозок: як мікробіом впливає на тривогу та депресію, Trends Neurosci. 36 (2013) 305–312.
[6] Е. Шервін, Т. Г. Дінан, Дж. Ф. Краян, Останні розробки в розумінні ролі кишкової мікробіоти в здоров’ї та захворюваннях мозку, Ен. NY акад. Sci. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Варіації кишкової мікробіоти та фекального метаболічного фенотипу, пов’язаного з депресією за допомогою секвенування гена 16S рРНК та LC/ MS-based metabolomics, J. Pharm. Біомед. анальний 138 (2017) 231–239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Transfering the blues: depression-associated gut microbiota induces нейроповедінкові зміни у щурів, J. Psychiatr. рез.. 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Шлунково-кишковий метаболізм людини водного екстракту Cistanches Herba in vitro: з’ясування метаболічного профілю на основі комплексної ідентифікації метаболітів у шлунковому соку, кишечнику сік, кишкові бактерії людини та кишкові мікросоми, J. Agric. Харчова хім. 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Ідентифікація метаболітів ехінакозиду, що виробляються кишковими бактеріями людини, за допомогою ультраефективної рідинної хроматографії/квадрупольної часпролітної мас-спектрометрії, Дж. Agric. Харчова хім. 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, Скринінг та ідентифікація трьох типових метаболітів фенілетаноїдних глікозидів з Cistanches Herba кишковими бактеріями людини за допомогою UPLC/Q-TOF-MS, J. фарм. Біомед. анальний 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, Швидкий скринінг та ідентифікація відмінностей між метаболітами Cistanche deserticola та водним екстрактом C. tubulosa у щурів за допомогою UPLC- Q-TOF-MS комбінований аналіз розпізнавання образів, J. Pharm. Біомед. анальний 131 (2016) 364–372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, Систематична характеристика метаболітів ехінакозиду та актеозиду з Cistanche tubulosa в плазмі, жовчі, сечі та калі щурів на основі UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Хроматогр. 30 (2016) 1406–1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, Підхід до ідентифікації послідовних метаболітів типовий фенілетаноїдний глікозид, ехінакозид, на основі часу захоплення іонів рідинною хроматографією
мас-спектрометричний аналіз польоту, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Метаболізм ехінакозиду, хорошого антиоксиданту, у щурів: виділення та ідентифікація його жовчних метаболітів, Препарат Метаб. Dispos. 37 (2009) 431–438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Розуміння молекулярних механізмів взаємодії між фітопрепаратами та мікробіотою кишечника, Med. рез. 37 (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Всмоктування та розподіл гінзенозидів після перорального прийому введення екстракту Panax notoginseng щурам, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 2290–2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Взаємодія кишкової мікробіоти з функціональними харчовими компонентами та нутрицевтиками, Pharmacol. рез. 61 (2010) 219–225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, Кофейна кислота послаблює зниження експресії мРНК кортикального BDNF, спричинене впливом примусового впливу Плавальний стрес у мишей, Eur. J. Pharmacol. 534 (2006) 115–121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, Материнське введення гідрокситирозолу покращує нейрогенез і когнітивні функції в пренатальному стресі нащадків, Я. Нутр. Біохім. 26 (2015) 190–199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, Вплив кишкової мікробіоти на метаболізм і токсичність ліків, Expert Opin. Препарат Метаб. Токсикол. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, Велика кількість і різноманітність вуглеводно-активних ферментів у мікробіоті кишечника людини, Nat. Rev. Microbiol. 11 (2013) 497–504.