In Silico Дизайн безладної химерної багатоепітопної вакцини проти Mycobacterium tuberculosis Частина 1

Анотація

Туберкульоз (ТБ) є глобальною загрозою здоров’ю, щороку вбиває приблизно 1,5 мільйона людей. Ліквідація Mycobacterium tuberculosis, головного збудника туберкульозу, стає дедалі складнішою через появу великої кількості штамів, стійких до ліків. Вакцинація вважається ефективним способом захисту організму від патогенів, але єдина клінічно схвалена протитуберкульозна вакцина, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), має обмежений захист у дорослих. Було виявлено, що багатоепітопні вакцини підвищують імунітет до хвороб шляхом вибіркового поєднання епітопів з кількох білків-кандидатів.

Туберкульоз — це інфекційне захворювання, спричинене бактерією Mycobacterium tuberculosis, яке переважно вражає легені, але також може вражати інші органи. Важливу роль у розвитку та лікуванні туберкульозу відіграє імунітет.

При недостатньому імунітеті мікобактерії туберкульозу можуть легко проникнути в організм людини і перерости в туберкульоз. Наприклад, ослаблення імунної системи внаслідок певних захворювань або медикаментозного лікування підвищує ризик інфікування туберкульозом. Крім того, такі фактори, як неправильне харчування, низька якість життя та надмірний стрес, також можуть послабити імунітет, що призведе до розвитку туберкульозу.

Тому для профілактики туберкульозу дуже важливо підтримувати здоров’я та зміцнювати імунітет. Імунітет можна підвищити за допомогою здорового харчування, регулярного способу життя, правильних фізичних вправ і достатнього сну, що може ефективно знизити ризик зараження різними захворюваннями, включно з туберкульозом.

Імунітет також важливий для лікування та одужання, коли туберкульоз вже виник. Чим сильніша імунна система, тим ефективніше організм може захищатися від атаки туберкульозної палички та виробляти достатню кількість антитіл для боротьби з хворобою. Таким чином, дотримання правильного харчування, правильні фізичні вправи та позитивний настрій можуть зміцнити імунітет і сприяти одужанню.

Підсумовуючи, існує тісний зв’язок між імунітетом і туберкульозом. Збереження здоров’я та зміцнення імунітету є одним із важливих шляхів профілактики та лікування туберкульозу. Давайте сприймати життя позитивно, підтримувати здоровий спосіб життя та триматися подалі від хвороб. З цієї точки зору нам необхідно підвищувати свій імунітет. Цистанхе може істотно підвищити імунітет, оскільки м'ясна зола містить різноманітні біологічно активні компоненти, такі як полісахариди, два гриби Хуан Лі та ін. Ці компоненти можуть стимулювати імунну систему. Різні типи клітин у системі, підвищують їхню імунну активність.

Клацніть на переваги цистанчі для здоров’я

Це дослідження мало на меті розробити багатоепітопну вакцину проти туберкульозу з використанням імуноінформаційного підходу. Завдяки функціональному збагаченню ми ідентифікували вісім білків, що виділяються M. tuberculosis, які необхідні для патогенезу, секретуються у позаклітинний простір або обидва. Потім ми проаналізували епітопи цих білків і відібрали 16 епітопів хелперних Т-лімфоцитів з інтерфероніндукуючою активністю, 15 епітопів цитотоксичних Т-лімфоцитів і 10 лінійних епітопів B-клітин, а також кон’югували їх з ад’ювантом і епітопом, що зв’язує Pan HLA DR (PADRE), використовуючи відповідний лінкери.

Крім того, ми передбачили третинну структуру цієї вакцини, її потенційну взаємодію з Toll-Like Receptor-4 (TLR4) та імунну відповідь, яку вона може викликати. Результати показали, що ця вакцина має сильну спорідненість до TLR4, що може значно стимулювати клітини CD4 plus і CD8 plus до секреції імунних факторів і B-лімфоцитів до секреції імуноглобулінів, щоб отримати хороший гуморальний і клітинний імунітет. Загалом, прогнозували, що цей багатоепітопний білок буде стабільним, безпечним, високоантигенним та високоімуногенним, що може слугувати глобальною вакциною проти туберкульозу.

1. Введення

Туберкульоз (ТБ), висококонтагіозна хвороба, спричинена Mycobacterium tuberculosis, вважається Всесвітньою організацією охорони здоров’я (ВООЗ) головною причиною смерті від одного інфекційного агента [1–3]. У 2021 році оціночна кількість смертей від туберкульозу та нових випадків сягнула 1,6 млн і 10,6 млн відповідно [4]. В даний час клінічне лікування туберкульозу відносно мало, і в основному використовується комбінація декількох протимікробних препаратів.
Цей цикл хіміотерапії дуже тривалий, зазвичай займає від дев’яти до дванадцяти місяців або навіть довше [5], що підвищує ризик резистентних мутацій у M. tuberculosis [6,7]. Останніми роками хіміотерапія стала менш ефективною через появу та збільшення частки множинних та широко лікарсько-резистентних M. tuberculosis [6]. Запобігання розвитку туберкульозу може бути ефективнішим, ніж його лікування. Добре відомо, що вакцинація є ефективним способом захисту організму від патогенних бактерій [8].

На даний момент єдиною клінічно схваленою протитуберкульозною вакциною є Bacillus Calmette-Guérin (BCG), розроблена понад 100 років тому [9]. На жаль, БЦЖ захищає лише новонароджених і немовлят і в основному неефективний проти підлітків і дорослих [2,10], хоча ВООЗ повідомляє, що 89 відсотків випадків туберкульозу в 2021 році були дорослі [4]. Тому існує нагальна потреба в розробці нової та ефективної протитуберкульозної вакцини, особливо для підлітків і дорослих.

Розробка протитуберкульозної вакцини ускладнюється багатьма особливостями мікобактерій, такими як латентна інфекція, персистенція та імунне ухилення [11–13]. Ідеальна вакцина проти туберкульозу повинна бути розроблена так, щоб націлюватися на білки/шляхи, відповідальні за ці властивості M. tuberculosis, і мати здатність ефективно індукувати імунні відповіді, опосередковані CD4 плюс і CD8 плюс Т-клітинами [14].

Крім того, ефективна вакцина також має бути націлена на основні комплекси гістосумісності (MHC) хазяїна, які є високополіморфними [15]. Ці характеристики висувають дуже високі вимоги до універсальності вакцини, які, очевидно, не можуть бути досягнуті одним природним білком. Мультиепітопна вакцина, рекомбінантний білок, що складається з серії епітопів (пептидів), що перекриваються [16], є новим типом вакцини-кандидата, який може вирішити вищевказані проблеми.

В останні роки багатоепітопні вакцини привернули велику увагу завдяки їхнім перевагам у вищому імунітеті та нижчій алергенності порівняно зі звичайними вакцинами [17,18]. В даний час розроблено багатоепітопні вакцини проти багатьох патогенних мікроорганізмів, включаючи Shigella spp. [19], вірус ящуру [20], Helicobacter pylori [21,22], вірус гепатиту B [23], Toxoplasma gondii [24], Leishmania infantum [25], вірус Nipah [26], Onchocerca volvulus [27], Pseudomonas aeruginosa [28] та вірус лейкозу [29].

Зокрема, поява пандемії COVID-19 посилила застосування цієї технології [16,30–32]. Що стосується туберкульозу, то кілька мультиепітопних вакцин були розроблені для боротьби з природньо активним туберкульозом [33–39] і латентним туберкульозом [40,41]. Серед них три вакцини-кандидати були розроблені у формі ДНК [34,36,40], і два з них включили епітопи в білкові кістяки для створення рекомбінантних вакцин [34,36].

Слід зазначити, що білки-кандидати для деяких із зазначених вище багатоепітопних вакцин вибираються випадковим чином, і охоплення населення цими вакцинами потребує подальших досліджень.

Крім того, було розроблено два багатоепітопних вакцини-кандидати проти туберкульозу з широким охопленням населення, один епітоп був обраний з білків імуногенних екзосом везикул з патогенними властивостями [39], а інший не фокусується на білках-кандидатах, а безпосередньо відбирає висококонсервативні та експериментально підтверджені епітопи з бази даних імунних епітопів (IEDB) [38]. Однак ці білки-кандидати не мають функціонального збагачення, і здатність кандидатів у вакцину індукувати секрецію інтерферону (ІФН-) ще потребує вдосконалення.

У попередньому дослідженні було зроблено висновок, що раціональна оптимізація епітопів може бути досягнута шляхом поєднання здатності зв’язування MHC і здатності епітопу реагувати з рецепторами Т-клітин [42]. Крім того, вони передбачили, що вакцини з епітопами, що зв’язують цитотоксичні Т-лімфоцити (CTL) A1, A2, A3, A24 і B7, охоплять майже 100 відсотків основних етнічних груп (чорношкірих, азіатів, латиноамериканців та європеоїдів).

Однак досі не було подібного підходу до створення вакцини проти туберкульозу. У цьому дослідженні ми розробили багатоепітопну протитуберкульозну вакцину з дуже безладним статевим життям, використовуючи різні антигенні особливості восьми білків, збагачених функціями. Химерна вакцина-кандидат має 15 епітопів CTL, 16 епітопів хелперних Т-лімфоцитів (HTL) із властивостями, що індукують IFN- -, і 10 епітопів лінійних В-клітин. Імуноінформаційний аналіз продемонстрував, що ця вакцина-кандидат є «всеохоплюючою», що робить її потенційною наріжним каменем для досягнення «стратегії подолання туберкульозу».

2. Матеріали та метод

2.1. Вибір білка та пошук послідовності

Щоб сконструювати багатоепітопну вакцину проти туберкульозу, ми спочатку відібрали білки комплексу M. tuberculosis, які депоновані в базі даних IEDB [43] і були валідовані як епітопи, що зв’язують MHC класу I та II. Амінокислотні послідовності (первинна структура) білків штаму M. tuberculosis H37Rv отримано з бази даних UniProt [44]. Незалежні від вирівнювання прогнози проспективних антигенів на основі фізико-хімічних властивостей були отримані з сервера VaxiJen 2.0 [45], який пройшов автоматичне та крос-коваріаційне (ACC) перетворення білкових послідовностей у єдиний вектор основної амінокислоти. властивості, з порогом антигенності, встановленим на рівні 0.4 для кожного бактеріального білка [45,46].

Функціональна анотація білків була оцінена за допомогою бази даних для анотації, візуалізації та інтегрованого виявлення (DAVID) 6.8 [47]. Секретовані білки були додатково збагачені за допомогою двох категорій: позаклітинний простір і патогенез через бази даних DAVID і BioCyc [48] відповідно. Протеом Homo sapiens GRCh38.p13 був завантажений у форматі FASTA з бази даних Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI) [49]. BLASTp використовувався для прогнозування гомології (E-значення =1e-5) між секретованими білками та білками H. sapiens.

2.2. Прогноз Т-клітинного епітопу

Прогнозування та відбір епітопів є вирішальними кроками у створенні багатоепітопних вакцин. Молекули MHC I зв’язують короткі пептиди (9–11 амінокислот), оскільки пептидзв’язуюча щілина молекул MHC I, що складається з одного ланцюга, закрита [50]. Для прогнозування епітопів CTL використовувався доступний у вільному доступі NetMHCpan-4.1 [51], який використовує NNAlign_MA для створення процентних рангів (процентний ранг) на основі комбінації афінності зв’язування MHC I та елюйованих лігандів .

«Відсотковий рейтинг» запитуваної послідовності визначали шляхом порівняння її передбачуваної оцінки з розподілом прогнозованої оцінки для відповідного MHC, розрахованого з використанням набору випадково вибраних нативних пептидів. Епітопи з відсотковим рейтингом < 0.5 відсотків вважалися сильними зв’язувачами, тоді як епітопи з відсотковим рейтингом < 2 відсотків вважалися слабкими зв’язувачами [51].

Хоча на сервері можна передбачити до 12 епітопів супертипу MHC класу I, ми використовували лише A1, A2, A3, A24 і B7, оскільки ці п’ять супертипів охоплюють 100 відсотків основних людських рас [42] . Ми вибрали сильні зв’язувачі та передбачили їх антигенність за допомогою VaxiJen2.0 [45], потім ми передбачили імуногенність класу I за допомогою Міжнародної бази даних епітопів (IEDB) [52], яка використовує 3-кратну перехресну перевірку.

Нарешті, ми впорядкували епітопи, які були як антигенними, так і імуногенними відповідно до процентного рейтингу, і вибрали 15 епітопів з низьким рівнем оцінки, по три для кожного супертипу та принаймні по одному для кожного білка-кандидата, за винятком білка-кандидата, який не міг мати сильного епітопу зв’язування з CTL тобто антигенні та імуногенні. Нарешті, значення IC50 для кожного епітопу CTL були передбачені за NetMHC-4.0 [53].
Молекули MHC II класу зв'язуються з антигенними пептидами, і отриманий комплекс може бути розпізнаний HTL. Як правило, антигенні пептиди мають довжину від 12 до 20 амінокислотних залишків, але часто спостерігаються пептиди довжиною від 13 до 16 залишків [54].

{{0}}мери були найпоширенішими епітопами MHC II для M. tuberculosis і були депоновані в IEDB. У результаті ми використали NetMHCIIpan-4.0 [51,55] для прогнозування зв’язування пептидів 15-mer з людським лейкоцитарним антигеном-DR (HLA-DR), HLADQ, HLA-DP, і алель H-2–1. Прогноз також ґрунтувався на NNAlign_MA з відсотковим рейтингом < 2 відсотків і < 10 відсотків, які вважалися сильними і слабкими зв’язуючими речовинами відповідно [51].

Крім того, ми передбачили 15-mer IFN-індукуючі епітопи для білків-кандидатів за допомогою сервера IFNepitope [56], який використовує машинний гібридний підхід допоміжних векторів, який дозволяє віртуально перевіряти IFN- -індукуючий пептид/епітоп у пептиді бібліотека, що складається з IFN- -індукованих і неіндукованих зв’язувачів MHC II, які активують Т-хелпери. Потім ми передбачили антигенність епітопів, що індукують IFN [45], і, нарешті, ми вибрали 16 найбільш безладних епітопів, які сильно зв’язувалися з MHC-II, індукували IFN і були антигенними.

Важливо відзначити, що сигнальні пептиди були видалені з білків-кандидатів перед прогнозуванням епітопу. У цьому дослідженні сигнальні пептиди перевіряли за допомогою SignalP 5.0 [57] і TargetP2.0 [58].

2.3. Лінійне передбачення В-клітинного епітопу

Епітопи лінійних B-клітин (16-mers) були передбачені за допомогою ABCpred [59,60] із порогом за замовчуванням 0.51. Крім того, щоб підвищити надійність результатів передбачення, ми також використали BepiPred 2.0 [61] для передбачення лінійних В-клітинних епітопів. Епітопи, отримані з цих двох програм, були додатково піддані прогнозу антигенності за допомогою VaxiJen2.0 [45]. Нарешті, ми вибрали десять лінійних В-клітинних епітопів на основі високих балів ABCpred та антигенності, принаймні один епітоп, обраний для кожного білка-кандидата.

2.4. Конструювання мультиепітопної вакцини-кандидата з химерними властивостями

Розроблена багатоепітопна вакцина містить один ад’ювант HBHA (гепарин-зв’язуючий гемаглютинін), один Pan HLA DR-зв’язуючий епітоп (PADRE), 15 CTL, 16 HTL, 10 лінійних B-клітинних епітопів і одну мітку His × 6 (рис. 3). Лінкери використовували для з’єднання епітопів, запобігання виробленню з’єднаних епітопів і посилення процесії та регенерації окремих епітопів у химерних вакцинах [62].

Для конструювання цієї вакцини-кандидата ад’ювант HBHA (ідентифікатор UniProt: P9WIP9) був розташований на N-кінці та зв’язаний із нижнім PADRE через лінкер EAAAK. Потім епітопи HTL, об’єднані лінкерами GPGPG, були пов’язані з PADRE. Крім того, епітопи CTL, з’єднані лінкером AAY, були з’єднані з епітопами HTL через лінкер HEYGAEALERAG, який також приєднав одиницю епітопу CTL до лінійних В-клітинних епітопів, пов’язаних за допомогою лінкерів KK. Нарешті, тег His × 6 був прикріплений до С-кінця химерного білка.

2.5. Антигенність, алергенність та фізико-хімічні властивості

Антигенність багатоепітопної вакцини та восьмикомпонентних білків була передбачена сервером VaxiJen 2.0 [45], тоді як алергенність цих білків була передбачена сервером AllerTOP 2.0 [ 63]. AllerTOP 2.0 використовує E-дескриптори амінокислот, ACC-трансформацію білкових послідовностей і k-найближчих сусідів (kNN) для класифікації алергенів.

Метод досяг 85,3-відсоткової точності з 5-кратною перехресною перевіркою. Для прогнозування фізико-хімічних властивостей, таких як період напіввиведення, ізоелектрична точка, індекс нестабільності, аліфатичний індекс і велике середнє гідропатичності (GRAVY) цієї багатоепітопної вакцини, використовувався сервер ExPASy ProtParam [64].
Крім того, розчинність багатоепітопного вакцинного пептиду оцінювали за допомогою сервера proteinSol (PROSO II) [65] на основі класифікатора, що використовує тонкі відмінності між добре відомими нерозчинними білками з TargetDB і розчинними білками з TargetDB і PDB [65]. 66]. При оцінці за допомогою 10-кратної перехресної перевірки було досягнуто 71.0 відсотків точності (площа під кривою ROC=0.785).

2.6. Імунна симуляція

Щоб охарактеризувати профіль імунної відповіді та імуногенність вакцини, було проведено імунне моделювання in silico за допомогою сервера C-ImmSim [67]. C-ImmSim прогнозує імунну взаємодію, використовуючи матриці оцінки позиції, отримані з методів машинного навчання для прогнозування пептидів.
Він одночасно симулює три компартменти, що представляють три окремі анатомічні області, виявлені у ссавців: (i) кістковий мозок, де гемопоетичні стовбурові клітини були змодельовані для виробництва нових лімфоцитів і мієлоїдних клітин; (ii) тимус, де були відібрані наївні Т-клітини, щоб уникнути аутоімунітету; і (iii) лімфатичний орган, такий як лімфатичні вузли.

Щоб ефективно розпочати та підсилити вакцину, ми дотримувалися підходу [68], де дві ін’єкції вводили з інтервалом у чотири тижні. Для всіх параметрів симуляції було встановлено значення за замовчуванням із часовими кроками 10 і 94 (кожен часовий крок становить вісім годин).

2.7. Прогноз невпорядкованої області

Внутрішньо невпорядковані ділянки (IDR) присутні в багатьох білках. Невпорядковану область було передбачено за допомогою DISOPRED3 [69], який використовує DISOPRED2 і два інших модулі на основі машинного навчання, навчені великим IDR для ідентифікації невпорядкованих залишків. Вони тоді були anno

2.8. Прогнозування вторинної та третинної структури

Вторинна структура розробленої вакцини була передбачена сервером PSIPRED 4.0 [70], який вперше використовує PSI-BLAST для ідентифікації послідовностей, тісно пов’язаних із білком запиту. Третинна структура цієї вакцини була передбачена за допомогою сервера Iterative Threading Assembly Refinement (I-TASSER) [71].

Є чотири ключові кроки в моделюванні ITASSER; a) ідентифікація шаблону потоків; б) ітераційне моделювання складання структури; в) вибір і доопрацювання моделі; та d) функціональна анотація на основі структури [72,73].

I-TASSER створив п’ять моделей, які були перевірені за допомогою ProSA-web [74], і модель з найнижчим Z-показником була обрана для подальшого вдосконалення. ProSA-web порівнює бали моделі, отримані від експериментально перевірених структур, депонованих у PDB. Діаграма локального показника якості допомагає визначити проблемні області в моделі, і ті самі показники були представлені за допомогою кольорового коду на презентації 3D-структури. Це корисно для раннього визначення та уточнення структури.

2.9. Уточнення третинної структури

«Груба» 3D-модель вакцини-кандидата, отримана ITASSER, була вдосконалена в два етапи з використанням двох серверів; спочатку з ModRefiner [75], а потім GalaxyRefine [76]. ModRefiner використовує сліди C, щоб впливати на конструкцію та очищення білків, отриманих двоетапною мінімізацією енергії на атомному рівні.

По-перше, сліди C були використані для побудови основного ланцюга, а потім уточнення ротамерів бічних ланцюгів і атомів магістралі за допомогою складених силових полів, заснованих на фізиці та знаннях. GalaxyRefine використовує кілька шаблонів для створення надійних базових структур, тоді як ненадійні цикли або термінали були створені за допомогою моделювання на основі оптимізації.

2.10. Валідація третинної структури

Уточнену структуру вакцини-кандидата було підтверджено графіками Рамачандрану, створеними з баз даних PROCHECK [77] і MolProbity [78]. Графіки Рамачандрана оцінюють конформацію скелета білків шляхом поділу амінокислотних залишків на дві області: дозволену та заборонену. PROCHECK використовує стереохімію для оцінки чистої якості білкових структур шляхом порівняння їх із уточненими структурами з тією самою роздільною здатністю та представлення областей, які потребують подальшого аналізу.

Molprobity перевіряє моделі локальних і глобальних макромолекул (білків і нуклеїнових кислот) за допомогою поєднання рентгенівських, ЯМР, обчислювальних і кріоЕМ критеріїв [79]. Потужність і чутливість для оптимізації розміщення водню та аналіз контакту всіх атомів широко використовуються в оновленій версії критеріїв ковалентної геометрії та торсійного кута [80].

2.11. Розривні B-клітинні епітопи

Розривні B-клітинні епітопи в структурі нативного білка були передбачені за допомогою ElliPro [81]. ElliPro реалізує три алгоритми для наближення форми білка як еліпсоїда, обчислює індекс виступу залишків (PI) і об’єднує сусідні залишки на основі їх значень PI. ElliPro надає кожному вихідному епітопу оцінку, описану як усереднене значення PI для залишку епітопу. Еліпсоїд зі значенням PI 0.9 складається на 90 відсотків із залишків білка, що міститься, тоді як решта 10 відсотків залишків лежать за межами еліпсоїда. Для кожного залишку епітопу значення PI розраховується з центру маси залишку, що лежить за межами найбільшого можливого еліпсоїда.

2.12. Молекулярний докінг химерних білків

Молекулярний докінг розробленої вакцини (ліганду) з імунним рецептором Toll-Like Receptor-4 (TLR4) (PDB ID: 3FXI) проводили за допомогою Patchdock [82]. Потім 10 найкращих моделей були вдосконалені за допомогою FireDock [83]. PatchDock замінює представлення поверхні молекул у вигляді точок Конноллі на увігнуті, опуклі та плоскі плями.

Потім моделі оцінювали на основі геометричної відповідності та атомної десольватації. [82]. FireDock оптимізує конформації бічних ланцюгів і орієнтацію твердого тіла і генерує результат 3D уточненого комплексу на основі енергії зв’язку [83]. В якості стикувального комплексу ми обрали першу модель Firedock на основі глобальної енергетики. Нарешті, енергію зв’язку та вміст дисоціації в док-комплексі було передбачено за допомогою сервера PRODIGY [84].

2.13. Моделювання молекулярної динаміки

Молекулярно-динамічне моделювання було виконано на білках за допомогою швидкого та вільно доступного веб-сервера, сервера аналізу внутрішніх координат у нормальному режимі (iMODS) [85], а послідовні та оптимальні результати стикування були отримані з сервера PatchDock-FireDock. У внутрішніх координатах аналіз нормального режиму (NMA) генерує колективні рухи, критичні для макромолекулярної функції. iMODS представляє механізми для дослідження цих режимів як аналіз вібрації, анімація руху та трансформація траєкторій, які виконувалися майже інтерактивно з різною роздільною здатністю [85].

2.14. Зворотна трансляція, оптимізація кодонів і клонування in silico вакцини

Для ефективної експресії вакцини-кандидата в клітинах Escherichia coli кДНК була створена in silico шляхом оптимізації кодонів і зворотної трансляції за допомогою Java Codon Adaptation Tool (JCAT) [86].

Оптимізація включала (i) уникнення rho-незалежних термінаторів транскрипції, ii) уникнення сайтів зв’язування прокаріотичних рибосом, (iii) уникнення сайту розщеплення ферментів рестрикції NcoI та XhoI, який служить N-кінцевим і C-кінцевим сайтами рестрикції для вставки кДНК шаблон вакцини та (iv) лише часткова оптимізація для застосування спрямованого мутагенезу. Індекс адаптації кодону (CAI) і вміст GC передбачили якість кДНК з опаловим стоп-кодоном (TGA), вставленим після мітки His×6. Потім оптимізований фрагмент ДНК кандидата на химерну вакцину був інтегрований у зворотний ланцюг pET-28a( plus ) за допомогою інструменту SnapGene [87].

For more information:1950477648nn@gmail.com